朱曉艷，吳 倩，史紅蘭，肖道清，曹國洲

(寧波檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江寧波 315012)

柱前衍生高效液相色譜法測定食品接觸用紙制品中乙二醛含量

朱曉艷，吳 倩，史紅蘭，肖道清，曹國洲

(寧波檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江寧波 315012)

建立了柱前衍生-高效液相色譜法測定食品接觸用紙制品中乙二醛含量的方法。紙制品中的乙二醛用水溶液萃取后與5,6-二氨基脲嘧啶（DDP）反應(yīng)生成2,4-二氧四氫蝶。該反應(yīng)簡單、快速、且無副反應(yīng)。衍生產(chǎn)物通過高效液相色譜法分離熒光檢測器（激發(fā)波長330nm，發(fā)射波長460 nm）測定。通過對衍生化條件的優(yōu)化，反應(yīng)可在40℃，15 min的堿性介質(zhì)中完成。在給定條件下，乙二醛衍生物的保留時間為7.0 min，在質(zhì)量濃度0.1～20 mg/L內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回收率在90.3%～105.8%之間，檢出限（S/N=3）為0.01 mg/L。應(yīng)用此法測定食品接觸用紙中的乙二醛遷移量取得滿意的結(jié)果。

柱前衍生；高效液相色譜法（HPLC）；食品接觸用紙制品；乙二醛

由于食品用紙具有綠色環(huán)保、品種性能豐富等特點，其應(yīng)用日益廣泛，因而越來越受到人們的關(guān)注。在某些發(fā)達(dá)國家，紙包裝材料占總包裝材料總量的40%～50%，我國占23.50%左右[1]。乙二醛作為原料在造紙工業(yè)中應(yīng)用非常廣泛，可提高紙張的濕強(qiáng)度和抗張強(qiáng)度，可作為交聯(lián)劑提高紙張的表面抗水和耐水性能。國外生產(chǎn)的乙二醛主要應(yīng)用于高級紙張和餐巾紙、包裝紙與商標(biāo)紙等生產(chǎn)過程中，以提高其防潮性能及增加光澤，其用量約占乙二醛總需求量的40%[1]。但乙二醛具有中等毒性，對眼和鼻粘膜有刺激作用?？梢饎游飫⊥拢灾卸究梢鹨认贀p害[2]，也有報道稱乙二醛且具有致癌性、致突變等遺傳毒性[3]。

因為乙二醛的危害，各國家和地區(qū)對乙二醛在不同產(chǎn)品中的限量進(jìn)行規(guī)定。歐盟《成員國關(guān)于化妝產(chǎn)品的近似于法律的指令》中規(guī)定了化妝品中乙二醛的限量為100 mg/kg[4]。歐盟2009年7月發(fā)布的2009/568/EC[5]生活用紙生態(tài)標(biāo)簽指令中對生活用紙安全評價做出了明確規(guī)定，限制乙二醛含量為1.5 mg/ dm2。德國聯(lián)邦風(fēng)險評估（BFR）規(guī)定食品接觸用紙制品中乙二醛單體的含量不得超過1.5 mg/dm2[6]，我國目前還未對食品接觸用紙制品中乙二醛的含量進(jìn)行限定，也無相關(guān)的方法來測定食品接觸用紙制品中的乙二醛含量。

目前，測定乙二醛的分析方法主要有紫外分光光度法[7-12]，高效液相色譜法[3，13-18]，容量法[19-20]和化學(xué)發(fā)光法[21]。這之中常用的是紫外分光光度法和高效液相色譜法。但乙二醛本身無發(fā)色基團(tuán)，因此在使用紫外分光光度法和高效液相色譜法時，需要利用衍生試劑與乙二醛反應(yīng)生成帶發(fā)色基團(tuán)的乙二醛衍生物。常用的衍生試劑有2，4-二硝基苯肼[5，11，14，18]、羥胺[16，22]和2-亞肼基-2,3-二氫-3-甲基苯并噻唑鹽(HMBT)[7]。2,4-二硝基苯肼，乙二醛與之反應(yīng)生成乙二醛腙。但此反應(yīng)副反應(yīng)多，產(chǎn)物易相互轉(zhuǎn)化而不易定量。羥胺與乙二醛可生產(chǎn)乙二醛二肟，但產(chǎn)物僅有紫外吸收，不能滿足低檢出限要求。DIN54603中用2-肼基-2,3-二氫-3-甲基苯并噻唑鹽酸進(jìn)（HMBT）作為衍生試劑，用紫外分光光度法測定，分析步驟繁瑣，不適合批量檢測。因此尋找一種合適的衍生化試劑和檢測方法是解決乙二醛檢測問題的關(guān)鍵。本文擬用DDP為衍生試劑用于紙制品中乙二醛的測定，反應(yīng)速度快，產(chǎn)物單一易于定量，且操作便捷。整個檢測分析流程可在半小時內(nèi)完成，適用于樣品的快速分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

高效液相色譜儀，Waters 2695e，美國沃斯特公司；恒溫震蕩器，SHA-C，國華企業(yè)；電子天平，AL104，梅特勒托利多儀器上海有限公司；pH計，S40，梅特勒托利多儀器上海有限公司。

1.1.2 試劑

乙二醛標(biāo)準(zhǔn)品（39.9%，Chemservice）；2,4-二氧四氫喋啶標(biāo)準(zhǔn)品（98%，Aldrich化學(xué)公司）；5,6-二氨基脲嘧啶（簡稱DDP，分析純，Sigma-Aldrich）；乙腈（HPLC，天津迪馬公司）；氯化銨（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；檸檬酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氨水（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；除非另作說明，所用試劑均為色譜純，水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制

乙二醛標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 000 mg/L）：準(zhǔn)確稱取1.253 1 g（±0.5 mg）乙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 mL燒杯，用水稀釋轉(zhuǎn)移入500 mL容量瓶，搖勻，定容。此溶液濃度為1 000 mg/L。用水逐級稀釋該儲備液，可得各級標(biāo)準(zhǔn)溶液。

氯化銨緩沖鹽（0.5 mol/L，pH=10）：準(zhǔn)確稱取2.67 g氯化銨（NH4Cl），加超純水定容至100 mL容量瓶中，再用氨水調(diào)節(jié)pH至10。

檸檬酸緩沖鹽（0.01 mol/L，pH=6）：準(zhǔn)確稱取1.050 g的檸檬酸，加超純水溶解用氫氧化鈉調(diào)pH至6，定容至500 mL容量瓶中，再過0.45 μm濾膜過濾，超聲。

5,6-二氨基脲嘧啶衍生試劑（下稱DDP衍生試劑，400 mg/L）：準(zhǔn)確稱取0.04 g的DDP，移入100 mL棕色容量瓶中，用超純水溶解，超聲，搖勻并定容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 反應(yīng)原理

乙二醛和過量的5,6-二氨基脲嘧啶（DDP）在堿性介質(zhì)中進(jìn)行衍生化反應(yīng)如圖1，形成高熒光二氧四氫喋啶衍生物。乙二醛衍生產(chǎn)物二氧四氫喋啶在高效液相色譜上分離，熒光檢測。檢測的二氧四氫喋啶即相應(yīng)的乙二醛的含量。

圖1 反應(yīng)方程式Fig.1 The reaction equation

1.2.3 乙二醛的衍生化方法

取萃取后的樣品溶液或乙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于25 mL容量瓶中，隨后加入0.125 mL的氯化銨鹽緩沖溶與400 mg/L的DDP衍生試劑，置于一定溫度的水浴鍋中進(jìn)行衍生化反應(yīng)。反應(yīng)一段時間后將溶液迅速冷卻，加檸檬酸緩沖鹽定容至25 mL，過濾，備用。

1.2.4 紙制品中乙二醛的萃取方法

根據(jù)EN 645[23]標(biāo)準(zhǔn)將紙剪切成大約1～2 cm2的紙碎片，然后稱取10 g（±0.1 g）的紙碎片，隨后移入500 mL的磨口錐形瓶，加入200 mL的超純水于瓶中，置于23±2℃的恒溫振蕩24 h后將溶液傾倒出，用超純水清洗留有紙碎片的錐形瓶數(shù)次，過濾，將濾液移入250 mL的容量瓶，用超純水定容至刻度。

1.2.5 色譜條件

色譜柱：Shim-Pak C18柱，250 mm×4.6 mm（內(nèi)徑）×5.0 μm（粒徑）；

檢測器：熒光檢測器(Waters 2475)，激發(fā)波長330 nm，發(fā)射波長460 nm；

流動相：乙腈+檸檬酸緩沖鹽=3+97；等度洗脫；

肉眼觀察并比較各組大鼠牙齦的增生情況，并拍照。然后分離所有大鼠的雙側(cè)上頜磨牙及其牙周組織，將樣本置于新鮮配制的40 g/L多聚甲醛中固定48 h后，100 g/L乙二胺四乙酸二鈉溶液中脫鈣30 d，流水下沖洗12 h；依次用700、800、900、950、1 000 mL/L乙醇分別脫水1 h，然后用1 000 mL/L 乙醇再脫水2次，1 h/次；二甲苯透明，石蠟包埋；最后沿牙體長軸按頰舌向作左側(cè)上頜第一磨牙5 μm的連續(xù)切片，組織切片烤片30 min后備用。

流速：1.0 mL/min；

柱溫：40℃；

進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

根據(jù)ESPINOSA-MANSILLA等[15]的文獻(xiàn)，流動相檸檬酸緩沖溶液：水=（97：3），Zorbax Eclipse XDBC18柱，可分離DDP與2,4-二氧四氫喋啶，實驗中發(fā)現(xiàn)用Shim-Pak C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分離效果更好。故選擇Shim-Pak C18柱，改變流動相中乙腈和檸檬酸緩沖鹽的的比例發(fā)現(xiàn)乙腈越少分離效果越好。但是純水相對柱子不利，因此選擇乙腈：檸檬酸為3：97，在選定的分離條件下，目標(biāo)峰和衍生試劑DDP可充分分離。目標(biāo)峰出現(xiàn)時間6.5 min左右。

2.2 衍生化反應(yīng)介質(zhì)的pH

取5組10 mg/L的乙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液各吸取1.0 mL至25 mL容量瓶中，分別加入pH值為7、8、9、10、 11的氯化銨緩沖溶液0.125 mL，隨后分別加入400 mg/L的DDP試劑1.0 mL，搖勻30 s。在60℃放置100 min后迅速在冰水中冷卻。最后用檸檬酸緩沖溶液稀釋至刻度并搖勻，過膜，取樣品注入高效液相色譜儀。以衍生化后峰面積為指標(biāo)選擇緩沖溶液的pH。

圖2 pH對衍生化反應(yīng)的影響Fig.2 The effect of pH to derivatization

2.3 衍生化反應(yīng)溫度和時間選擇

取一系列25 mL容量瓶，分別加入1.0 mL的10 mg/L的乙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液再加入pH為10.0的氯化銨緩沖溶液0.125 mL，隨后分別加入400 mg/L DDP試劑1.0 mL，搖勻。分別在5、20、30、40、50℃下各反應(yīng)1、5、10、15、20、30、40、50、60 min后迅速在冰水中冷卻。按方法“1.2.3”操作，所得溶液注入高效液相色譜儀。衍生化反應(yīng)中溫度與時間對衍生化反應(yīng)的影響如下：以衍生化后峰面積為指標(biāo)選擇衍生化溫度和時間。從圖3可以看出溫度是影響反應(yīng)的一個重要指標(biāo)。溫度低于20℃時，加熱時間在10 min以下，轉(zhuǎn)化率變化明顯，加熱時間大于20 min以后，反應(yīng)向趨于穩(wěn)定，但在選定條件下并不能完全反應(yīng)，即使反應(yīng)12 h，轉(zhuǎn)化率還是不能達(dá)到100%。30～50℃，衍生反應(yīng)非?？? min即可使轉(zhuǎn)化率達(dá)97%以上。一方面考慮到反應(yīng)充分又能快速完成反應(yīng)，另一方面考慮到乙二醛沸點為50.4℃，過高的溫度對精密度有影響。因此本課題選用衍生溫度為40℃，衍生化時間為15 min。

圖3 不同溫度下乙二醛轉(zhuǎn)化率與加熱時間的關(guān)系Fig.3 The relationship between conversion rate of glyoxal and heat time under diverse temperature

2.4 乙二醛與DDP的摩爾比

取9組10 mg/L的乙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液各吸取1.0 mL至25 mL容量瓶中，分別加入0.04 mg/L的DDP衍生試劑0.125 mL，0.250 mL，0.500 mL，1.00 mL，1.25 mL，1.50 mL，2.00 mL，2.50 mL，3.75 mL。，隨后加入pH值為10的氯化銨緩沖溶液0.125 mL，搖勻30 s，在40℃放置15 min后迅速在冰水中冷卻。按方法“1.2.3”操作后，所得溶液注入高效液相色譜儀。在此條件下DDP與乙二醛的摩爾比分別約為1:1，2:1，4:1，8:1，11:1，13:1，17:1，22:1，32: 1。以DDP與乙二醛的摩爾比為X軸，乙二醛衍生物峰面積為Y軸，作圖。摩爾比對乙二醛峰面積的影響如圖4。

從圖4可知隨著摩爾比的變大，峰面積快速變大，在4：1到11：1之間達(dá)到一個平，隨后略有變小。說明隨著DDP含量增加，衍生產(chǎn)物變多。但是DDP本身是熒光性物質(zhì)，過多的DDP可能對產(chǎn)物有淬滅作用，因此在達(dá)到平臺后，衍生產(chǎn)物峰面積變小。摩爾比在4:1，8:1，11:1時，乙二醛的轉(zhuǎn)化率分別為98.2%、100%、和99.7，說明摩爾比在4:1時已經(jīng)足夠快速反應(yīng)，考慮到反應(yīng)的穩(wěn)定性，本課題選用摩爾比為8:1，即反應(yīng)時加入400 mg/L的DDP衍生試劑1 mL。

圖4 摩爾比（DDP/乙二醛）與乙二醛衍生物峰面積關(guān)系Fig.4 The relationship between mole ration(DDP/glyoxal)and peak area of glyoxal derivative

2.5 線性關(guān)系與方法學(xué)考察

2.5.1 線性范圍、檢出限及穩(wěn)定性

移取0.1、1.0、2.0、4.0、10、20 mg/L的乙二醛系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在優(yōu)化的條件40℃，15 min,pH10下，按方法“1.2.3”進(jìn)行衍生化，在最佳色譜分離檢測條件下測定，乙二醛的線性范圍和檢出限（S/N=3）如表1所示。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖如圖5所示。

通過連續(xù)測定10 mg/L的乙二醛衍生后的產(chǎn)物8次，每次檢測間隔為1小時，來評估方法的穩(wěn)定性。實驗表明本方法穩(wěn)定性好。8次測定的RSD為2.13%。

圖5 最佳條件下，10 mg/L乙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生后產(chǎn)物2,4-二氧四氫蝶色譜圖Fig.5 Typical chromatogram of lumazine derivatived from 10 mg/L glyoxal standard solution under optimized condition.

表1 線性范圍、重現(xiàn)性及檢出限Tab.1 Linear range,reproducibility and detection limit

2.5.2 加標(biāo)回收率試驗和精密度

對各種樣品萃取液，分別加入低、中、高三個不同含量的乙二醛，進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度的試驗，結(jié)果見表2和表3。由表可知，乙二醛的加標(biāo)回收率在90.3%～105.8%，精密度在0.7%～3.6%。

3 結(jié)論

本方法操作簡單，可以用于食品接觸用紙制品中乙二醛的快速批量檢測，一般紙盤10 g樣品的最小面積0.1 dm2，根據(jù)本方法操作換算，檢出限可達(dá)0.025 mg/dm2，最低定量限為0.25 mg/dm2，能滿足德國聯(lián)邦風(fēng)險評估（BFR）規(guī)定食品接觸用紙制品中乙二醛單體的含量不得超過1.5 mg/dm2的檢測要求。

表2 樣品的回收率（n=3）Tab.2 Recovery of samples

[1]宋成劍,蘇文強(qiáng).乙二醛在造紙工業(yè)中的應(yīng)用[J].造紙化學(xué)品,2009(6):19-23.

[2]張志虎,邵 華.工作場所空氣中乙二醛測定方法研究[J].中國公共衛(wèi)生,2006,22(1):87-88.

[3]王 路,范來富,王迎春,等.乙二醛遺傳毒性的研究進(jìn)展[J].中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2004,17(1):43-45.

[4]THE COUNCIL OF THE EUROPEAN COMMUNITIES.COUNCIL DIRECTIVE of 27 July 1976 on the approximation of the laws of the Member States relating to cosmetic products(76/768/EEC).[EB/OL].(2010.3.1)[2014.6.10].http://eur-lex.europa.eu/ LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CONSLEG:1976L0768:20100301:en:PDF.

[5]THE COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES.COMMISSION DECISION of 9 July 2009 establishing the ecological criteria for the award of the Community Eco-label for tissue paper(notified under document number C(2009)4596)(Text with EEA relevance)(2009/568/EC).[EB/OL].(2009.7.29)[2014.6.10].http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/PDF/? uri=CELEX:32009D0568(01)&from=EN

[6]Bundesinstitut für Risikobewertung.XXXVI.Paper and board for food contact.[EB/OL].(2013.6.1)[2014.6.10].http://bfr.zadi. de/kse/faces/resources/pdf/360-english.pdf.

[7]NA 074-02-01 AA-Chemisch-technische Prüfverfahren für Papier,Pappe,Faserstoff und Chemiezellstoff.Testing of paper, paperboard and board-Determination of glyoxal content DIN 54603-2008[S].Berlin:DIN Deutsches institute für Normung e. V..:2008.

[8]徐嘉涼,王誠瑜,湯曉東,等.紫外分光光度法測定乙二醛含量的研究[J].分析試驗,1998,17(5):41-44.

[9]宋海英,趙地順,趙 瑩,等.紫外分光光度法測定乙二醛溶液中乙二醛的含量[J].河北工業(yè)科技,2007,24(5):281-283.

[10]劉樹彬,楊建一,張星辰,等.紫外分光光度法同時測定乙醛和乙二醛[J].河北科技大學(xué)學(xué)報,2010,31(1):22-24.

[11]范富龍,施耀曾,楊士英,等.在乙醛酸等化合物存在下乙二醛測定方法研究[J].南京大學(xué)學(xué)報,1989,5(2):308-313.

[12]浙江三元紡織有限公司.HG/T 4450-2012紡織染整助劑樹脂整理劑中游離乙二醛的測定[S].北京:化工出版社,2013.

[13]ZHANG Zhiyong,ZHAO Dishun,XU Baoyun.Analysis of Glyoxal and Related Substances by Means of High-Performance Liquid Chromatography with Refractive Index Detection[J].Journal of Chromatographic Science 2012:1-6.

[14]UCHIYAMA S,MATSUSHIMA E,TOKUNAGA H,et al.Determination of orthophthalaldehyde in air using,4-dinitrophenylhydrazine-impregnated silica cartridge and high-performance liquid chromatography[J].Journal of Chromatography A,2006,1 116: 165-171.

[15]ESPINOSA-MANSILLA A,DURáN-MERáS I,CA?ADA F C,et al.High-performance liquid chromatographic determinationof glyoxal and methylglyoxal in urine by prederivatization to lumazinic rings using in serial fast scan fluorimetric and diode array detectors[J].Analytical Biochemistry,2007,371:82-91.

[16]王依春,黃 健,馬繼紅.高效液相色譜法測定化妝品中乙二醛的方法研究[J].香料香精化妝品,2009(1):6-8.

[17]朱鴨梅,崔 群,王海燕.高效液相色譜法測定乙醛溶液中的乙二醛和乙醛酸[J].色譜,2010,28(1):59-63.

[18]NAKAJIMA K,OHTA K,TOUfiK A,et al.Glyoxal sample preparation for high-performance liquidchromatographic detection of 2,4-dinitro-phenylhydrazone derivative:Suppression of polymerization and mono-derivative formation by using methanol medium[J].Journal of Chromatography A,2007,1 161:338-341.

[19]徐嘉涼,趙 怡,陳 亞,等.乙二醛容量測定法的改進(jìn)[J].石油化工,1999,28(9):620-631.

[20]全國化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會.GB 6324.5-2008有機(jī)化工產(chǎn)品中羰基化合物含量的測定-容量法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[21]方盧秋.高錳酸鉀一硫酸體系流動注射化學(xué)發(fā)光法測定乙二醛的含量[J].重慶師范大學(xué)學(xué)報,2006,23(1):58-60.

[22]陳紅梅,朱春華,楊文杰.分光光度法測定樹脂吞整理劑中游離乙二醛[J].印染,2010,23:39-41.

[23]92/39054 DC.BS EN 645:1994 Paper and board intended to come into contact with foodstuffs-preparation of a old water extract.[S].London:Brithish Standard Institution,1994.

Determination of Glyoxal in Food Contact Paper by Highperformance Liquid Chromatography with Precolumn Derivatization

ZHU Xiao-yan，WU Qian，SHI hong-lan,et al
(Ningbo Academy of Inspection and Quarantine,Ningbo 315012,China)

A new method for determining the glyoxal content in food contact paper by HPLC with precolumn derivatization was developed.The glyoxal in the paper extracted by water react with 5,6-diamino-2,4-hydroxypyrimidine sulfate(DDP)to form highly fluorescent lumazine derivatives.The reaction is simple,fast with no byproduts.The glyoxal derivative was separated by HPLC and was determined fluorimetrically at 460 nm (exciting at 310 nm).Under optimized conditions,the reaction was finished with the reagent in alkaline medium,for 15 min at 40℃,and the retention time of the derivatization of glyoxal was 7.0 min,the detector response was found to be linear in the concentration rang 0.05-20.0 mg/L.Recoveries of the glyoxal were in the range of 90.3%-105.8%,limits of detection(S/N=3)was 0.01 mg/L.The proposed method was successfully applied to analyze glyoxal in food contact paper with satisfactory results.

pre-column derivatization;HPLC;food contact paper;glyoxal

TS207.3;O657.7+2

A

1008－830X(2014)04－0358－06

2014-03-25

國家質(zhì)監(jiān)總局項目（2011IK036）；浙江省分析測試項目（2012C37075）

朱曉艷（1978-），女，高級工程師，碩士研究生，研究方向：食品接觸材料檢測方法.E-mail:Zhuxy@nbiq.gov.cn