李 艷，范 佳

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊 050018）

自然發(fā)酵是借助于環(huán)境中的微生物使牛乳發(fā)酵，將糖與蛋白質(zhì)等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳酸、酒精等其他風(fēng)味物質(zhì)。自然發(fā)酵中的酵母菌不僅對乳糖的利用和蛋白質(zhì)的分解起重要的作用，同時可與乳酸菌有共生作用產(chǎn)生豐富的氨基酸與醇類物質(zhì)［1］。開菲爾粒是開菲爾的傳統(tǒng)發(fā)酵劑，是多種微生物的互生體系，主要由乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等構(gòu)成［2］。乳酸菌分解乳糖產(chǎn)生葡萄糖和半乳糖，促使酵母菌生長而引起乙醇發(fā)酵并產(chǎn)生CO2

［3］；酵母菌的生長繁殖為乳酸菌和醋酸菌的生長起促進作用。開菲爾粒特殊的菌群構(gòu)成賦予了開菲爾制品特殊的口感和香氣風(fēng)味特征［4］。開菲爾制品中含有50%的黏性多糖（m（葡萄糖）∶m（半乳糖）=1∶1）、少量脂肪、蛋白質(zhì)、水和其他成分［5］。開菲爾粒中酵母菌的種類和數(shù)量致使發(fā)酵乳制品的品質(zhì)不同，當乳糖發(fā)酵型酵母菌數(shù)達到105CFU／m L時，才能賦予乳制品特有的乳酒風(fēng)味。2000年，GADAGA等從津巴布韋傳統(tǒng)發(fā)酵乳中分離出釀酒酵母、假絲酵母等多種酵母菌［6］。2010年，F(xiàn)ADDA等從撒丁島山羊乳中分離出誕沫假絲酵母［7］。目前，中國對于發(fā)酵型乳制品微生物的研究大多為乳酸菌，研究可發(fā)酵低度乳酒酵母菌的文獻較少。本研究是從自然發(fā)酵乳和內(nèi)蒙古牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵劑開菲爾粒中分離篩選酵母菌，并進行酵母菌的形態(tài)聚類和分子鑒定，探尋酵母菌的多樣性和主要菌群的種屬類型，為篩選可發(fā)酵低度乳酒的酵母菌奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗原材料

1.1.1 原料

1）市售鮮牛乳：購于河北省石家莊市南栗村農(nóng)戶；

2）商品滅菌乳：購于河北科技大學(xué)大學(xué)商城國大超市，分別由伊利、蒙牛和君樂寶乳業(yè)公司生產(chǎn)；

3）開菲爾粒：取自內(nèi)蒙古牧區(qū)牧民家中，4℃冰箱貯存于滅菌牛乳中。

1.1.2 培養(yǎng)基

YEPD 培養(yǎng)基，WL培養(yǎng)基［8］。

1.1.3 試劑

TaqDNA聚合酶，d NTP，限制性內(nèi)切酶HinfⅠ，HaeⅢ和CofⅠ，合成引物：引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SW-CJ-1BU潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；DP-200生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；QL-901漩渦振蕩器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；S1000 PCR擴增儀、XR＋凝膠成像分析儀（北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司）；DYY-8C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCP-310水平式電泳槽（北京市六一儀器廠）；XS-212-202雙目顯微鏡（JMOEC）配有單反相機D5100（尼康映像儀器銷售有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理與酵母菌的分離

1.3.1.1 自然發(fā)酵乳的制備與酵母菌的分離

以鮮牛乳為對照樣，分別將商品滅菌乳和鮮牛乳各20 m L置于100 m L三角瓶內(nèi)進行發(fā)酵為1號樣；用檸檬酸調(diào)節(jié)p H值至4.5后再發(fā)酵為2號樣；用檸檬酸調(diào)節(jié)p H值至4.5并添加2 g蔗糖后再發(fā)酵為3號樣。發(fā)酵條件為28℃，3～4 d。分別取發(fā)酵后的樣品1 m L進行10倍梯度稀釋，取稀釋梯度為10-3～10-5的稀釋菌液0.2 m L（菌落數(shù)控制在30～300 CFU／m L）涂布于YEPD培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)24～48 h［9］，每個樣品做3個平行。依據(jù)菌落觀察挑取不同形態(tài)的酵母菌再劃線于新鮮的WL培養(yǎng)基上，進行純化培養(yǎng)，將分離得到的酵母菌用25%（體積分數(shù)）甘油冷凍保藏于-20℃冰箱，備用。

1.3.1.2 開菲爾粒的活化與酵母菌分離

開菲爾?！尤霚缇Ｈ椤?8℃培養(yǎng)24 h→過濾→再加入滅菌牛乳→28℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3次［10］。

取活化增殖培養(yǎng)后的開菲爾粒1 g，于10 m L無菌生理鹽水中研磨，再取1 m L樣品進行10倍梯度稀釋，取稀釋梯度為10-4～10-6稀釋菌液0.2 m L（菌落數(shù)控制在30～300 CFU／m L）涂布于YEPD培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，每個稀釋度做3個平行。酵母菌分離和純化的方法與自然發(fā)酵乳相同。

1.3.2 酵母菌的形態(tài)聚類分析

酵母菌的形態(tài)聚類采用菌落形態(tài)和細胞顯微形態(tài)結(jié)合分析的方法。將冷凍保藏的酵母菌取出活化，再將單菌落劃線于WL培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)4 d。依據(jù)菌落和細胞形態(tài)的不同特征予以區(qū)分。菌落特征包括：菌落形態(tài)、色澤、濕潤程度、表面是否光滑、邊緣是否整齊等。細胞顯微特征包括：細胞形狀、大小、生長繁殖方式、是否有假菌絲等。

1.3.3 酵母菌的分子鑒定

1.3.3.1 酵母菌DNA提取

酵母菌DNA提取采用SDS裂解法［11］。

1.3.3.2 酵母菌5.8S r DNA-ITS區(qū)PCR擴增及反應(yīng)程序

PCR反應(yīng)體系（50μL）：引物ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）各2μL；d NTP 1μL；Colorless Go Taq Reaction Buffer 10μL；TaqDNA 聚合酶0.35μL；模板DNA 1μL；雙蒸水33.65μL。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性7 min；95℃變性1 min，52℃退火2 min，72℃延伸2 min，循環(huán)35次；再72℃延伸10 min。

PCR擴增產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù)（下同）2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，控制電壓在70 V。

1.3.3.3 酵母菌5.8S r DNA-ITS區(qū)PCR擴增產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶酶切

將酵母菌5.8S r DNA-ITS區(qū)PCR擴增產(chǎn)物利用3種限制性內(nèi)切酶HinfⅠ，HaeⅢ和CofⅠ進行酶切。

酶切反應(yīng)體系（20μL）：10×Buffer 2μL，PCR產(chǎn)物8μL，限制性內(nèi)切酶1μL，雙蒸水9μL。

酶切反應(yīng)條件：37℃水浴2.5 h。

PCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，控制電壓在90 V。

1.3.3.4 酵母菌5.8S r DNA-ITS區(qū)序列分析

將酶切后的酵母菌5.8S r DNA-ITS區(qū)域PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，委托其進行基因序列測定。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

雙向基因序列測序結(jié)果經(jīng)過拼接后，在Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫中通過Blast（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／blast／Blast.cgi）進行同源序列搜索，比較提交菌株與已知序列菌株的相似程度，以相似度大于99%時確定其屬和種，初步確定酵母菌株的分類學(xué)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品預(yù)處理與酵母菌的分離

從鮮牛乳、自然發(fā)酵乳和開菲爾粒中共分離得到130株酵母菌，其中鮮牛乳和自然發(fā)酵乳中分離到87株，開菲爾粒中分離到43株，分別占各自所分離總微生物菌數(shù)的2.86%和6.64%，開菲爾粒中酵母菌所占比例明顯高于自然發(fā)酵乳，結(jié)果見表1。

由表1可見，依據(jù)初步形態(tài)觀察，從開菲爾粒中分離出的酵母菌形態(tài)完全不同于鮮牛乳和自然發(fā)酵乳。從開菲爾粒中分離出的4種形態(tài)酵母菌，在鮮牛乳和自然發(fā)酵乳中都沒有分離到。而從鮮牛乳和自然發(fā)酵乳中分離出的6種形態(tài)酵母菌在開菲爾粒中也沒有分離到。說明酵母菌的存在與原料和環(huán)境有密切關(guān)系。

開菲爾粒本身是發(fā)酵劑，經(jīng)活化后，所含微生物處于活躍狀態(tài)，便于酵母菌的分離和篩選。鮮牛乳直接分離和經(jīng)過自然發(fā)酵后分離到形態(tài)5，6，7三種形態(tài)的酵母菌，僅占總菌數(shù)的1.23%～2.70%。調(diào)節(jié)鮮牛乳的p H值和含糖量，使營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件更適宜酵母菌的生長，分離到形態(tài)7的酵母菌，說明該菌在鮮牛乳中基數(shù)較少，經(jīng)過發(fā)酵富集后才被分離。從理論上講，滅菌乳在任何條件下都應(yīng)該分離不到微生物，但事實是自然發(fā)酵的滅菌乳樣品中都分離到了各種微生物，特別是經(jīng)過調(diào)整p H值和加糖后自然發(fā)酵培養(yǎng)的2號和3號樣所分離到的酵母菌形態(tài)類型和數(shù)量的確比直接培養(yǎng)分離的1號樣菌數(shù)多，形態(tài)也更豐富，酵母菌所占比例從0到13.89%。對此可以有2點解釋，一是在銷售環(huán)節(jié)滅菌乳的貯存條件導(dǎo)致微生物滋生；二是自然發(fā)酵過程中，環(huán)境微生物的侵入或樣品中極少量微生物因營養(yǎng)和培養(yǎng)條件的改善使菌數(shù)和種類增加。

表1 開菲爾粒和自然發(fā)酵乳中分離的酵母菌數(shù)量統(tǒng)計Tab.1 Separation of the yeast quantity statistics in kefir grains and natural fermented dairy

2.2 酵母菌的形態(tài)聚類分析

酵母菌的形態(tài)鑒別通常用WL培養(yǎng)基。因為培養(yǎng)基中含有溴甲酚綠指示劑，不同種類的酵母菌在 WL培養(yǎng)基上生長的菌落顏色和形態(tài)不同，基于此再結(jié)合顯微鏡下酵母菌細胞形態(tài)的特點，可以將酵母菌進行初步形態(tài)聚類［12］。本研究依據(jù)菌落特征和顯微鏡下細胞特征［13］對所分離的130株酵母菌進行了形態(tài)聚類，初步分為10種形態(tài)類型，形態(tài)描述和酵母菌株數(shù)見表2。

由表2可看出，酵母菌均以出芽方式繁殖，細胞大小不一。開菲爾粒中含有4種形態(tài)的酵母菌，菌落形態(tài)不同，但在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，形態(tài)1，2和4有相似處，均有少量假菌絲形成，與盧鑫研究的一株馬克斯克魯維酵母菌［14］的顯微形態(tài)類似，王和平等鑒定的克魯維酵母菌的顯微形態(tài)中也有少量假菌絲［15］。初步判定形態(tài)1，2和4為馬克斯克魯維酵母。形態(tài)1的酵母菌數(shù)在開菲爾粒中占有絕對優(yōu)勢，為優(yōu)勢菌株。形態(tài)5和形態(tài)9的酵母菌分別是鮮牛乳自然發(fā)酵和滅菌乳自然發(fā)酵篩選出的優(yōu)勢菌株。

2.3 酵母菌的分子鑒定

2.3.1 酵母菌株5.8S r DNA-ITS區(qū)RFLP分子鑒定圖譜

在WL培養(yǎng)基初步形態(tài)聚類的基礎(chǔ)上，利用5.8S r DNA-ITS區(qū)進行RFLP分子鑒定。因為酵母菌的核糖體5.8S r DNA及兩側(cè)的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）具有顯著的種間差異性［10］，可以作為鑒別酵母菌的分類依據(jù)［16］。從10種形態(tài)的酵母菌中每個形態(tài)隨機各選1株進行5.8S-ITS區(qū)基因擴增，PCR擴增產(chǎn)物電泳圖見圖1。

由圖1可以看出，10種形態(tài)的酵母菌經(jīng)PCR產(chǎn)物電泳分析后分成5類，均在450～900 bp之間。其中形態(tài)1，2，4，6的PCR條帶一致，均在750 bp；形態(tài)3，9和10的PCR條帶一致，均在650 bp；形態(tài)5，7，8的條帶各不相同，分別是880，560，450 bp。為了將10種形態(tài)酵母菌完全區(qū)分開，故將PCR產(chǎn)物用3種限制性內(nèi)切酶HinfⅠ，HaeⅢ和CofⅠ進行酶切做進一步分析，酶切產(chǎn)物電泳圖見圖2。

表2 開菲爾粒和自然發(fā)酵牛乳中酵母菌的形態(tài)特征Tab.2 Colony morphology of yeast isolates in kefir grains and natural fermented dairy

由圖2可以看出，經(jīng)過3種酶切分析后，共得到種6種酶切類型。其中形態(tài)3和形態(tài)9，10的HinfⅠ和HaeⅢ這兩種內(nèi)切酶條帶不同。形態(tài)1，2，4，6酵母菌的酶切圖譜仍然一致，雖在WL培養(yǎng)基上形態(tài)表征不同，但經(jīng)過5.8S r DNA-ITS區(qū)RFLP分析后具有相同的PCR產(chǎn)物及酶切條帶，則初步鑒定其為同一類酵母菌。形態(tài)表現(xiàn)的不同是因為菌株所處生長時期和個體差異所致。其余4種不同形態(tài)的酵母菌WL培養(yǎng)基聚類分析結(jié)果與5.8S rDNAITS區(qū)RFLP分析鑒定結(jié)果基本一致。

圖1 5.8S r DNA-ITS區(qū)PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 PCR amplification pattern of 5.8S rDNA-ITS region of yeast isolates

2.3.2 酵母菌株5.8S r DNA-ITS區(qū)PCR擴增產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物大小分析

根據(jù)酵母菌5.8S r DNA-ITS區(qū)PCR擴增產(chǎn)物及3種限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物電泳圖，通過Image Lab軟件進行處理，結(jié)合軟件自動讀帶，讀取清晰強度較高的電泳條帶分子量大?。?7］。不同形態(tài)類型的酵母菌株5.8S-ITS區(qū)域RFLP分析結(jié)果及鑒定結(jié)果見表3。

本研究對5.8S r DNA-ITS序列分析結(jié)果作進一步測序鑒定，即將每一分子類型酵母菌隨機挑選一株，共6株進行測序分析。即將其PCR擴增產(chǎn)物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行基因測序，結(jié)果見表4。并將測序序列登陸 GeneBank數(shù)據(jù)庫（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／blast／Blast.cgi），進行BLAST相似性比對［18］，以相似度大于99%確定其種屬，測序結(jié)果見表4。

圖2 酵母菌5.8S r DNA-ITS區(qū)擴增產(chǎn)物限制性酶切圖譜Fig.2 Restriction analysis pattern of PCR amplified 5.8S r DNA-ITS region of yeast

表3 5.8S r DNA-ITS區(qū)擴增產(chǎn)物大小及酶切片段大小Tab.3 Amplification product size and enzyme fragment size of 5.8S r DNA-ITS region

表4 酵母菌5.8S r DNA-ITS區(qū)序列分析結(jié)果Tab.4 Sequence analysis results of 5.8S r DNA-ITS region of yeasts

從表4可以看出，經(jīng)過初步的形態(tài)學(xué)鑒定和后續(xù)的5.8S r DNA-ITS區(qū)分子生物學(xué)鑒定后，原10種菌落形態(tài)酵母菌現(xiàn)分為6種分子類型，歸屬于6個屬的6個種，分別為馬克思克魯維酵母菌（K.marxianus）、隱球酵母菌（Cryptococcussp.）、釀酒酵母菌（S.cerevisiae）、熱帶假絲酵母菌（C.tropicalis）、陸生伊薩酵母菌（I.terricola）和季也蒙畢赤酵母菌（P.guilliermondii）。

開菲爾粒中分離到的4種形態(tài)的酵母菌鑒定為2種分子類型。鮮牛乳和自然發(fā)酵乳中分離到的6種形態(tài)的酵母菌鑒定為5種分子類型。最值得討論的是形態(tài)1，2，4和6，它們分別來自于開菲爾粒和鮮牛乳自然發(fā)酵，菌落特征和細胞顯微特征完全不同，但是分子類型相同，或許是因為分子鑒定的方法中所涉及到的基因片段相同，它們存在著亞種或菌株水平的區(qū)分。

在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)菌株序列［19］，利用MEGA4生物學(xué)軟件的Neighbor-Joining連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［20］，同時進行1 000次Bootstrap檢驗。系統(tǒng)發(fā)育樹上在同一分支的酵母其同源關(guān)系最近，同時從聚類結(jié)果可以看出各酵母的種屬名稱及各自的分類情況。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。

圖3 基于5.8S r DNA-ITS區(qū)序列和Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylo genetic tree based on the 5.8S r DNA-ITS region domain sequences

自然發(fā)酵乳和傳統(tǒng)開菲爾粒中以K.marxianus，S.cerevisiae和P.guilliermondii數(shù)量最多。其中K.marxianus為重要菌群，占總酵母菌數(shù)的38%，在開菲爾粒和自然發(fā)酵乳中均分離到，為乳糖發(fā)酵型酵母菌［21］，可利用牛乳中的乳糖發(fā)酵產(chǎn)生CO2和具有保健功能的脂肪酸等活性物質(zhì)［22］。尹艷軍從漢森公司提供的開菲爾粒中也分離到了K.marxianus，并比較了其與釀酒酵母的發(fā)酵性能［23］，該菌在生長繁殖和代謝過程中，產(chǎn)生促進其他細菌生長的生長素類物質(zhì)［24］，因而在開菲爾粒中，它不僅促進微生物之間的共生作用而且在提高特殊風(fēng)味和香氣方面也起到重要作用。S.cerevisiae是非乳糖發(fā)酵型酵母，主要源自鮮牛乳自然發(fā)酵，占篩選總酵母菌的18%，主要利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生酒精，并具有很好的耐酒精性。將K.marxianus和S.cerevisiae按比例混合作為發(fā)酵低醇度乳酒的發(fā)酵劑，不僅酒精含量高而且還具有很好的風(fēng)味。

3 結(jié) 論

本研究從自然發(fā)酵乳及內(nèi)蒙古牧區(qū)傳統(tǒng)開菲爾粒中分離純化出130株酵母菌，形態(tài)學(xué)聚類為10種形態(tài)類型，5.8S r DNA-ITS區(qū)域PCR擴增產(chǎn)物RFLP分析后得到6種分子類型。經(jīng)測序、登錄Genbank進行Blast同源性比對鑒定出6種分子類型的酵母菌分別為馬克思克魯維酵母菌（K.marxianus）、隱球酵母菌（Cryptococcussp.）、釀酒酵母菌（S.cerevisiae）、熱帶假絲酵母菌（C.tropicalis）、陸生伊薩酵母菌（I.terricola）和季也蒙畢赤酵母菌（P.guilliermondii）。其中馬克思克魯維酵母菌、釀酒酵母菌和季也蒙畢赤酵母菌為優(yōu)勢菌群，具有釀造低醇度發(fā)酵乳制品的潛力。

本研究將傳統(tǒng)酵母菌形態(tài)聚類與分子鑒定相結(jié)合，分離篩選出具有發(fā)酵低純度乳酒潛質(zhì)的酵母菌，為進一步進行工業(yè)化應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)，對生產(chǎn)具有不同口感和類型的低醇度發(fā)酵乳制品具有重要意義。

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