劉 順 戴瑜來 周素明 鄭曉葉 王國良

(寧波大學 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室 寧波 315211)

血卵渦鞭蟲是一種呈世界范圍分布的能夠感染多種海水甲殼動物的寄生性原蟲(許文軍等,2007a;Hamish,2012)。主要引起甲殼動物肌肉、血淋巴、肝胰腺等液化病變癥狀,可在不同規(guī)格階段、不同季節(jié)暴發(fā)流行(Shields,1994)。Chatton等(1931)首次報道法國綠蟹(Carcinus maenas)感染血卵渦鞭蟲病,此后陸續(xù)在美國、加拿大、澳大利亞、法國等地區(qū)的藍蟹(Callinectes sapidus)(Newmanet al,1975)、白氏雪蟹(Chionoecetes bairdi)(Meyerset al,1987)、蛛雪蟹(Chionoecetes opilio)(Tayloret al,1995)、挪威龍蝦(Nephrops norvegicus)(Fieldet al,1998)、Necora puber(Wilhelmet al,1996)、遠海梭子蟹(Portunus pelagicus)(Shields,1992)、北方黃道蟹(Cancer borealis)(MacLeanet al,1978)、斑點蝦(Pandalus platyceros)(Johnson,1986)等重要經(jīng)濟物種中發(fā)現(xiàn)該病。國內(nèi)許文軍等(2007b,2007c,2010)已對鋸緣青蟹(Scylla serrata)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)感染該病的情況進行相關(guān)研究,因其發(fā)病率高、流行范圍廣、危害嚴重,已引起業(yè)界的廣泛關(guān)注。近年來浙江地區(qū)擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病頻發(fā),嚴重制約青蟹養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。國外關(guān)于血卵渦鞭蟲病的病原生活史(Appletonet al,1998;Liet al,2011a)、發(fā)病規(guī)律(Fieldet al,1992;Shieldset al,2005)、傳播、擴散方式等流行病學相關(guān)研究已有較詳細的報道(Meyerset al,1996;Liet al,2011b),而國內(nèi)有關(guān)血卵渦鞭蟲病的流行病學研究尚未見報道。為了解血卵渦鞭蟲病發(fā)病原因、流行規(guī)律及危害情況,作者于 2012年 4—11月對溫州地區(qū)養(yǎng)殖擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病的流行情況進行了研究,以期為病害的預防和控制提供數(shù)據(jù)參考和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

參照 Shields等(2005)的方法,對溫州瑞安閣巷養(yǎng)殖區(qū)的5個監(jiān)測池塘,自2012年4月起分批次采集擬穴青蟹樣本,4—6月和 9—11月每月采集一次,6—9月每半月采集一次。具有典型病癥的擬穴青蟹依發(fā)病程度每次采集數(shù)量在 0—300只范圍,用于病原體檢測、組織病理觀察和發(fā)病率與環(huán)境因子相關(guān)性分析,正常青蟹采自同一養(yǎng)殖區(qū)。

1.2 病原體檢測

用消毒注射器從蟹的血竇中抽取少量血淋巴,取約 15μL于載玻片上,用等量美蘭染色后于光鏡下觀察。并參照施慧等(2008)的方法,進行血卵渦鞭蟲的 PCR檢測。同時進行白斑綜合征病毒檢測和細菌學分析。

1.3 組織樣品制備及觀察

分別取患病青蟹與正常青蟹肝胰腺、心肌、步足肌、鰓等組織,10%海水福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋切片(厚度4—6μm),H&E染色,Olympus顯微鏡下觀察并拍照保存。

1.4 環(huán)境因子檢測

由瑞安市水產(chǎn)技術(shù)推廣站檢疫與環(huán)境檢測實驗室,定期對5個監(jiān)測池塘的水質(zhì)進行檢測分析。溫度、pH、鹽度等按常規(guī)方法現(xiàn)場檢測,溶解氧、亞硝酸鹽、氨氮等采集水樣后固定并帶回實驗室,按 GB 3097-1997海水水質(zhì)標準方法測定(中華人民共和國環(huán)境保護局,1997)。

日平均氣溫、平均氣壓、降雨量等數(shù)據(jù)由瑞安市氣象局提供。

1.5 流行病學數(shù)據(jù)采集

根據(jù)溫州市擬穴青蟹養(yǎng)殖的面積、分布等整體情況,分別對溫州地區(qū)的瑞安、龍灣、樂清、蒼南四個青蟹養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)在 2010—2012年期間,疑似擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病進行實地咨詢、養(yǎng)殖日記收集和問卷調(diào)查,主要內(nèi)容有池塘養(yǎng)殖面積、發(fā)病面積、發(fā)病癥狀、發(fā)病時間、病蟹規(guī)格和經(jīng)濟損失等。共計調(diào)查養(yǎng)殖場 36個,池塘 78口,面積 192.1公頃;發(fā)放問卷(擬穴青蟹養(yǎng)殖病害發(fā)生情況調(diào)查表)36份,收回 36份,收集養(yǎng)殖日記66本,受訪人數(shù)82人次。對各類采集數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

運用SPSS13.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病的癥狀及組織病理觀察

患病青蟹往往活力差,蟹體瘦弱,體色暗淡,體表發(fā)紅,步足關(guān)節(jié)膜發(fā)白、模糊,關(guān)節(jié)失去彈性,應(yīng)激反應(yīng)強,易斷肢,斷肢處有白色液體流出。解剖病蟹發(fā)現(xiàn)其體腔充滿乳白色液體,血淋巴由原先清藍色轉(zhuǎn)變?yōu)榛鞚?乳白色、黃色或橙色,不易凝固,肝胰腺彌散,肌肉液化,鰓往往呈黑褐色(圖1)。

圖1 擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病癥狀Fig.1 The symptoms of S.paramamosain infected with Hematodinium sp.

光學顯微鏡下觀察比較正常青蟹組織及患血卵渦鞭蟲病青蟹組織發(fā)現(xiàn),患病青蟹肝臟海綿組織缺失或壓迫性壞死,小動脈擴張,肝小管上皮邊緣彎曲變形、界限模糊并消失,小管內(nèi)腔水腫增大,細胞核固縮或溶解,管腔間隙充滿大量血卵渦鞭蟲(圖2a,圖2b);步足肌肌纖維排列疏松、間隔增大,往往纖維斷裂、溶解,橫紋消失,呈均質(zhì)樣變性或壞死,可見血卵渦鞭蟲(圖2c,圖2d);鰓上皮組織變性、壞死,鰓腔擴大,充滿血卵渦鞭蟲(圖2e,圖2f)。

2.2 血卵渦鞭蟲的形態(tài)及其檢測

病蟹血淋巴經(jīng)美蘭染色后,光鏡觀察顯示正常血細胞數(shù)目稀少,呈現(xiàn)大量血卵渦鞭蟲。蟲體多為卵圓形,細胞核單核或多核,單核時呈馬蹄形,大小在5—7μm,有些蟲體具有長度不等的鞭毛(圖3)。

從患血卵渦鞭蟲病樣本的血淋巴、肝胰腺、肌肉中提取總DNA后經(jīng)血卵渦鞭蟲PCR檢測,1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示三個組織均為陽性(圖4),即患病蟹的血淋巴、肝胰腺、肌肉都有血卵渦鞭蟲的寄生。樣品中未能檢出白斑綜合癥病毒,約有 70%樣品可分離到細菌,但多少不一且不成優(yōu)勢,鑒定顯示比較混雜。

圖2 擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病的組織病理(400×)Fig.2 Histopathological changes in the organs of S.paramamosain infected with Hematodinium sp.H&E(400×)

圖3 光學顯微鏡下擬穴青蟹血淋巴中的血卵渦鞭蟲Fig.3 Hematodinium sp.from the hemolymph of S.paramamosain

圖4 患病青蟹血淋巴、肝胰腺、肌肉組織PCR檢測Fig.4 The PCR detection of the Hematodinium sp.in hemolymph,hepatopancreas and muscle of the disease crab

2.3 擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病的流行病學特征

2.3.1 時空分布 對溫州瑞安閣巷5個監(jiān)測池塘進行跟蹤檢測,以血卵渦鞭蟲病發(fā)生的發(fā)病初期、死亡高峰期、發(fā)病末期三個時段,統(tǒng)計分析每月各發(fā)病時段的概率(圖5)。結(jié)果顯示,擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病的發(fā)病初期主要集中在7月份,40%的概率;死亡高峰期則在7月底至9月中旬之間,概率均為33.33%;而發(fā)病末期則在9月下旬后,概率為46.66%。這與現(xiàn)場走訪調(diào)查時青蟹養(yǎng)殖戶所提供的資料基本吻合。

圖5 擬穴青蟹每月各發(fā)病時段的概率趨勢圖Fig.5 The probability trends of S.paramamosain infected with Hematodinium sp.in each month

依據(jù) 2010—2012年間的調(diào)查統(tǒng)計數(shù)據(jù),溫州地區(qū)養(yǎng)殖擬穴青蟹各月的發(fā)病情況變化較大,發(fā)病率最高可達 100%。為使發(fā)病率數(shù)據(jù)接近正態(tài)分布,因此對發(fā)病率作反正弦轉(zhuǎn)換(根據(jù)統(tǒng)計《擬穴青蟹養(yǎng)殖病害發(fā)生情況調(diào)查表》中的數(shù)據(jù),發(fā)病率 = 擬穴青蟹養(yǎng)殖監(jiān)測地區(qū)的發(fā)病面積 / 養(yǎng)殖監(jiān)測總面積)。

根據(jù)轉(zhuǎn)換值再作方差分析,了解擬穴青蟹發(fā)病與年月的關(guān)系(表1)。

表1 擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病發(fā)病率的方差分析Tab.1 Variance analysis of S.paramamosain infected withHematodinium sp.in different time

由表1可知,不同的月份(P＜0.01)對溫州地區(qū)養(yǎng)殖擬穴青蟹的發(fā)病率有極顯著影響,而不同的年份(P＞0.05)對擬穴青蟹的發(fā)病率無顯著影響。進一步的多重比較表明,發(fā)病率最高的是9月份,其次是6—8月份,這與上述發(fā)病時段的概率趨勢基本一致。

2.3.2 發(fā)病與齡期和規(guī)格的關(guān)系 擬穴青蟹發(fā)病與齡期的關(guān)系見表2。由表2可知,擬穴青蟹在幼年期和成年期發(fā)病的概率相近,分別為0.476和0.524。表明擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病在整個生長周期內(nèi)均會發(fā)生。統(tǒng)計擬穴青蟹在放苗半個月、脫殼期和繁殖時期中的發(fā)病概率,結(jié)果均較相近,脫殼期發(fā)病率略高于其它時期(圖6)。擬穴青蟹發(fā)病與規(guī)格的關(guān)系見圖7,規(guī)格在小于50g和250g以上的青蟹,血卵渦鞭蟲病發(fā)病率較高。

表2 擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病發(fā)病齡期Tab.2 The probability of S.paramamosain in different life stages due to Hematodinium sp.infection

圖6 特殊時期發(fā)病概率Fig.6 Probability of outbreak in the special life stages

圖7 擬穴青蟹規(guī)格與血卵渦鞭蟲病發(fā)病率的關(guān)系Fig.7 Correlation between size of S.paramamosain and morbidity of Hematodinium sp.

2.4 擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病發(fā)生與環(huán)境因子間的關(guān)系

2.4.1 發(fā)病與氣象因子 運用SPSS軟件對氣象數(shù)據(jù)與發(fā)病率作相關(guān)性分析,結(jié)果見表3所示。月平均氣溫及月降水量對擬穴青蟹發(fā)病率的影響均有高度顯著的線性關(guān)系,月平均氣壓與月平均風速則無顯著影響?？紤]到月平均氣溫和降水量對擬穴青蟹發(fā)病率的非線性效應(yīng),把月平均氣溫、月降水量分成5個等級(表4),進一步對這些氣象因子對發(fā)病率的影響進行方差分析(表5),結(jié)果顯示月平均氣溫及月降水量對發(fā)病率的影響顯著。

表3 擬穴青蟹發(fā)病率與氣象因子的相關(guān)系數(shù)Tab.3 Correlation between morbidity of S.paramamosain and meteorological factors

表4 各氣象因子的等級Tab.4 The grades of meteorological factors

表5 氣象因子對發(fā)病率影響的方差分析Tab.5 Variance analysis of the effects of meteorological factors on the crab disease due to Hematodinium sp.infection

2.4.2 發(fā)病與養(yǎng)殖水體環(huán)境因子 對溫州瑞安閣巷養(yǎng)殖區(qū)監(jiān)測點 5個池塘水體環(huán)境因子分析結(jié)果顯示,該地區(qū)不同時期的pH、DO、鹽度的變化都有極顯著差異(P＜0.01),而不同池塘之間的 pH、DO、鹽度則都無顯著差異(P＞0.05);不同時期含量變化無顯著差異(P＞0.05),不同池塘的和含量變化也無顯著差異(P＞0.05)(表6)。

擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病發(fā)生與瑞安閣巷養(yǎng)殖水體理化因子的檢測結(jié)果顯示,水溫、鹽度的變化趨勢與發(fā)病率的變化趨勢相近,水溫(r= 0.756)、鹽度(r=0.631)的變化與擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病的發(fā)生具有相關(guān)性(圖8,圖9)。而 DO、pH、、、透明度等各項指標與發(fā)病率的變化趨勢沒有明顯相關(guān)性。

表6 環(huán)境因子方差分析Tab.6 Analysis of variance for the environmental factors

圖8 水溫與發(fā)病率的關(guān)系Fig.8 Correlation between the water temperature and morbidity

圖9 鹽度與發(fā)病率的關(guān)系Fig.9 Correlation between the salinity and morbidity

3 討論

擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病的病癥特點是活力差,體色暗淡,步足關(guān)節(jié)失去彈性,易斷肢,血淋巴由正常的清澈顯微藍轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色或乳濁色,呈不能凝固的變性液體,肝胰腺模糊呈彌散狀,有些病蟹鰓呈土黃色或深褐色,與已報道的青蟹黃水病較相似(丁小豐等,2011)。但不同的是擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病的肝胰腺、肌肉、鰓等組織病理顯示有大量血卵渦鞭蟲侵染,采用特異性引物的 PCR方法能檢出血卵渦鞭蟲,與許文軍等(2007b)、施慧等(2008)的研究結(jié)果相同。然而有報道認為青蟹黃水病是由環(huán)境影響造成(韓新全,2005),作者結(jié)合流行病學研究結(jié)果,認為擬穴青蟹養(yǎng)殖中環(huán)境因子變化是引起病害的誘發(fā)因素,血卵渦鞭蟲可能是主要的繼發(fā)性感染病原體,與Taylor等(1995)的報道相似。

溫州地區(qū)擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病發(fā)病期為每年的5—11月,高峰期為9月份,而6—7月也有一定程度的發(fā)病率。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,年份間與發(fā)病率無相關(guān)性,但不同月份對病害的發(fā)生有極顯著影響。每年 9月份及 6—7月份正值臺風多發(fā)季節(jié)和梅雨季節(jié),該段時期水溫較高、晝夜溫差大,受梅雨與臺風影響出現(xiàn)降雨多、降水量大,極易造成養(yǎng)殖水體環(huán)境突變,引起擬穴青蟹較強烈的應(yīng)激反應(yīng),容易遭受病原體的侵染而發(fā)生病害。氣象因子與發(fā)病率的相關(guān)性分析,也表明月平均氣溫及月降水量對發(fā)病率有影響顯著,水體理化因子檢測分析顯示水溫、鹽度的變化與擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病的發(fā)生具有顯著相關(guān)性,與 Eaton等(1991)、Meyers等(1990)發(fā)現(xiàn)白氏雪蟹血卵渦鞭蟲病的流行高峰期在夏、秋季水溫較高時期的報道相似。Messick等(2000)報道低水溫和低鹽度能抑制藍蟹血淋巴中血卵渦鞭蟲的增殖,在水溫低于 15°C時蘭蟹感染率明顯降低,在鹽度低于 11的大西洋海灣未發(fā)現(xiàn)感染蟹。Kirk等(2013)也發(fā)現(xiàn)鹽度的變化與藍蟹感染血卵渦鞭蟲病密切相關(guān)。溫州地區(qū)擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病發(fā)生時期,水溫均高于 20°C,鹽度在 17—29之間,即處于血卵渦鞭蟲適宜感染和增殖的條件。如遇氣候影響,養(yǎng)殖池塘晝夜水溫或水體鹽度驟然變化,擬穴青蟹受應(yīng)激反應(yīng)免疫防御能力下降,可引起血卵渦鞭蟲病的發(fā)生和暴發(fā)流行。因此,養(yǎng)殖漁民應(yīng)加強防病意識,注重調(diào)控水質(zhì),預防病害發(fā)生。

本研究還進行了擬穴青蟹血卵渦鞭蟲病與各個生長期之間的關(guān)系分析。在放苗期、脫殼期、繁殖時期各階段發(fā)病情況有所差異但不顯著,其中脫殼期感染發(fā)病率較高,Shields等(2000)對藍蟹血卵渦鞭蟲病研究也發(fā)現(xiàn)藍蟹在脫殼期感染率更高,Stentiford等(2001)對挪威龍蝦血卵渦鞭蟲病的研究也得到類似結(jié)論。這可能與甲殼類在脫殼期對外界環(huán)境影響敏感易產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)而免疫功能低下有關(guān)。Messick等(2000)報道藍蟹血卵渦鞭蟲病的發(fā)病率與蟹體規(guī)格關(guān)系密切,甲殼寬小于30mm的幼蟹平均發(fā)病率高于大規(guī)格蟹,而疾病流行與性別關(guān)系不大,但本實驗結(jié)果反映體重小于50g的幼蟹和大于250g的成蟹發(fā)病率均較高,性別差異不明顯,可能與不同蟹類品種和地域差異有關(guān)。

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