丁 軻，羅偉光，丁盼盼，李 旺，李元曉 ，余祖華，恒子鈐，賈艷艷，程相朝,3,*

（1.河南科技大學宏翔發(fā)酵飼料實驗室，河南 洛陽 471003；2.河南省動物疫病與公共安全院士工作站，河南 洛陽 471003；3.河南省高等學校環(huán)境與畜產(chǎn)品安全重點學科開放實驗室，河南 洛陽 471003）

雙纖維素酶基因在乳酸桿菌中的融合分泌表達

丁 軻1,2，羅偉光1，丁盼盼1，李 旺1，李元曉1，余祖華2，恒子鈐1，賈艷艷2，程相朝2,3,*

（1.河南科技大學宏翔發(fā)酵飼料實驗室，河南 洛陽 471003；2.河南省動物疫病與公共安全院士工作站，河南 洛陽 471003；3.河南省高等學校環(huán)境與畜產(chǎn)品安全重點學科開放實驗室，河南 洛陽 471003）

為提高纖維素的降解效率，將兩種不同的纖維素酶基因在乳酸桿菌中融合表達，實現(xiàn)雙纖維素酶在乳酸桿菌中的高效表達。根據(jù)兩纖維素酶的基因序列設計兩對引物，并在兩基因間引入一段連接肽。通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）分別擴增得到兩纖維素酶基因CelL15和CelL73，將其融合后連接到乳酸桿菌分泌性表達載體pMJ67中，構建重組表達質(zhì)粒pMJ-CelL15-CelL73，電轉化入乳酸桿菌Lactobacillus casei，利用紅霉素MRS平板篩選陽性克隆，通過PCR驗證獲得了分泌表達雙纖維素酶的重組乳酸桿菌。電泳實驗結果表明重組乳酸桿菌成功表達了1個約為83 kD的融合蛋白。平板酶活力檢測發(fā)現(xiàn)重組乳酸桿菌能明顯降解底物中的羧甲基纖維素鈉，培養(yǎng)液上清中纖維素酶酶活力可達1.25 U/mL。

纖維素酶；重組乳酸桿菌；融合；分泌

纖維素是自然界中分布最廣泛的可再生資源，其中各種農(nóng)作物的秸稈是糧食生產(chǎn)的副產(chǎn)物，每年全世界有約30億t，我國的秸稈產(chǎn)量約占世界產(chǎn)量的20%[1]。但是由于秸稈纖維素含量太高，且很難利用，僅有10%左右的秸稈用于反芻動物飼料，其他的被直接還田、焚燒或棄置，造成了極大的浪費，而且污染了環(huán)境，所以秸稈類纖維素資源的合理開發(fā)和應用已成為當前的研究熱點[2]。由于秸稈的營養(yǎng)價值極低，采用物理、化學或酶解等處理方法，不僅費用高，而且易產(chǎn)生二次污染，所以模擬自然界利用微生物降解是解決秸稈纖維素降解的最可行的方案[3-5]。因此，獲得能夠高效降解纖維素的微生物是解決這一問題的關鍵。利用微生物降解的原理其實還是利用微生物的產(chǎn)纖維素酶的功能，然而自然降解秸稈的微生物往往酶活力較低，而且產(chǎn)酶種類較單一、降解過程較長，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)。要提高微生物的產(chǎn)酶能力，最好的辦法就是利用基因工程技術將目的基因重組入高效表達系統(tǒng)進行表達。前期實驗已經(jīng)克隆了2個芽孢桿菌源的不同的纖維素酶基因，對纖維素均有一定的降解能力[6]。本實驗擬將這兩個纖維素酶基因融合在一起重組入乳酸桿菌表達質(zhì)粒pMJ67中，電轉化入干酪乳桿菌L.CECT5276中，以期獲得共表達雙纖維素酶的重組乳酸桿菌，為進一步研究其快速降解秸稈纖維素的機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）CECT5276、表達質(zhì)粒pMJ67由荷蘭Gasper教授贈送[6]；pGTL15、pGTL73由河南科技大學宏翔發(fā)酵飼料實驗室構建[6]；DH5α由本實驗室保存；pMD18-T載體 日本TaKaRa公司。

1.2 培養(yǎng)基、試劑與儀器

分離培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中加入1%的羧甲基纖維素鈉，121高壓滅菌20 min，待溫度降至60 ℃左右時向其中加入1.5%的過濾除菌的剛果紅溶液。

限制性內(nèi)切酶Pst I、Sma I、Bam HI、Pyrobest DNA Polymerase、DL2000、DL5000、T4 DNA連接酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、pMD18-T試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、細菌基因組提取試劑盒 日本TaKaRa公司。

凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀、電轉化儀 美國Bio-Rad公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Biometra公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計

根據(jù)質(zhì)粒pGTL15、pGTL73中纖維素酶基因CelL15和CelL73的序列設計2對引物。

下劃線部分為限制性內(nèi)切酶，方框中的序列是兩基因之間外加的連接肽序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.2 CelL15和CelL73基因克隆

分別以質(zhì)粒pGTL15和pGTL73為模板，PCR反應體系為：上游引物1.5 μL（20 pmol/L）、下游引物1.5 μL（20 pmol/L）、10×PCR緩沖液 5 μL、 dNTPs 1 μL（10 pmol/L）、Pyrobest DNA 聚合酶0.5 μL（5 U/μL）、模板DNA 4 μL，加滅菌超純水至50 μL。反應在Biometra PCR儀上進行：模板DNA 95 ℃預變性10 min；95 ℃ 40 s、58 ℃ 1 min（CelL15）、62 ℃ 1 min（CelL73）、72 ℃ 90 s，進行30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。然后將兩基因按照pMD18-T試劑盒說明書分別克隆入pMD18-T中，并命名為pMD-CelL15和pMD-CelL73，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.3 重組乳酸桿菌的構建

將質(zhì)粒pMD-CelL15和pMD-CelL73分別用Bam HI/ Sma I進行雙酶切，試劑盒回收，T4 DNA連接酶連接，得到質(zhì)粒pMD18-CelL15-CelL73，并將其送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。再將質(zhì)粒pMD18-CelL15-CelL73和乳酸桿菌表達載體pMJ67分別用Pst I/Sma I雙酶切后回收相應片段，用T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性重組子后用質(zhì)粒抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒，采用PCR法和酶切法進行鑒定，將該質(zhì)粒命名為pMJ-CelL15-CelL73。

將100 μL感受態(tài)乳酸桿菌（參照文獻[7]制備）與5 μL（300～500 ng）pMJ- CelL15-CelL73在冰浴下混勻，然后加入到冰浴預冷的0.1 cm的電轉化杯中，冰上放置10 min，在電壓600～1 200 V、電容25 μF、電阻100 Ω條件下進行電擊，電擊后立即加入0.9 mL預冷的含10%蔗糖的MRS，轉入1.5 mL離心管中，37℃孵育2 h后，取200 μL涂于含5 μg/mL的紅霉素抗性的MRS平板上， 37 ℃厭氧培養(yǎng)40 h。在平板上挑取陽性克隆，采用細菌基因組提取試劑盒提取乳酸桿菌基因組，分別用引物P15F+ P15R、P73F+P73R和P15F+P73R，參照1.3.2節(jié)進行PCR擴增，并將擴增后的序列進行測序，鑒定正確的即為重組乳酸桿菌。

1.3.4 重組乳酸桿菌的表達

將陽性重組乳酸桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧靜置培養(yǎng)至OD600nm=0.5時加入0.5%的乳糖，誘導培養(yǎng)36 h，將菌液5 000 r/min離心8 min，取上清進行電泳檢測。

1.3.5 重組乳酸桿菌培養(yǎng)上清中纖維素酶酶活力的測定

將重組乳酸桿菌和非重組乳酸桿菌同時取2 μL菌液滴種在分離培養(yǎng)基上（其中另加1%的乳糖），37 ℃厭氧36 h，觀察菌落周圍的酶解圈，并計算酶解圈直徑D /cm與菌落直徑d/cm比值，初步判定重組乳酸桿菌纖維素酶表達情況。

重組乳酸桿菌培養(yǎng)上清中纖維素酶酶活力測定方法參考國標GB/T 23881—2009《飼用纖維素酶活性的測定濾紙法》[8]。取培養(yǎng)36 h的菌液6 000 r/min離心10 min，取上清1 mL，加入1 mL含1% 羧甲基纖維素鈉的pH 4.8醋酸-醋酸鈉緩沖液混勻，50 ℃恒溫水浴30 min，加入2.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻后定容到25 mL，在520 nm波長條件下比色，測出OD520nm值，查閱標準曲線后，求出溶液 中的葡萄糖含量。酶活力單位規(guī)定：在pH 5.0、50 ℃條件下，以1 mL纖維素酶液在1 min內(nèi)水解羧甲基纖維素鈉生成1 μmoL葡萄糖的酶量為1個酶活力單位（U）。

2 結果與分析

2.1 CelL15基因和CelL73基因克隆

以質(zhì)粒pGTL15、pGTL73為模板，利用引物P15F、P15R和P73F、P73R進行PCR擴增，獲得兩個大小分別約為1 524 bp和764 bp的片段（圖1），與預期結果大小相符。

圖1 CelL15 CelL73基因PCR擴增圖Fig.1 PCR amplification of CelL15 and CelL73

2.2 重組表達質(zhì)粒pMJ-CelL15-CelL73的構建

圖2 重組表達質(zhì)粒pMJ-CelL15-CelL73酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant expression plasmid pMJ-CelL15-CelL73 by double enzyme digestion

將兩PCR產(chǎn)物分別克隆于pMD18-T中，采用酶切連接法將兩基因重組到乳酸桿菌表達質(zhì)粒pMJ67中。如圖2所示，經(jīng)雙酶切電泳可見兩條大小約分別為4 895 bp和2 256 bp的片段，符合質(zhì)粒和融合基因的大小，因此獲得了陽性克隆質(zhì)粒pMJ-CelL15-CelL73。將該質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，確定正確的閱讀框。

2.3 重組乳酸桿菌的PCR驗證

將整合了質(zhì)粒pMJ-CelL15-CelL73的乳酸桿菌抽提基因組后，分別利用引物P15F+P15R、P73F+P73R和P15F+ P73R進行PCR擴增，電泳可見3個片段的大小分別約為1 524、764、2 256 bp，與預期大小相符（圖3）。測序結果也證明已經(jīng)將該融合基因整合到了乳酸桿菌基因組上，且整個基因片段在連接時沒有發(fā)生核苷酸的突變或缺失，表明成功構建了重組乳酸桿菌。

圖3 重組乳酸桿菌PCR鑒定圖Fig.3 Identification of recombinant Lactobacillus by PCR method

2.4 重組乳酸桿菌的表達

由圖4可知，重組乳酸桿菌培養(yǎng)后的上清液經(jīng)10倍濃縮后，每孔點樣20 μL，電泳條帶與非重組乳酸桿菌比較，在約83 kD處有一條非常明顯的蛋白條帶，且與CelL15和CelL73融合蛋白大小預期一致，而非重組乳酸桿菌無該條帶，說明雙基因在乳酸桿菌中得到了表達，且能夠分泌到培養(yǎng)基上清中。

2.5 重組乳酸桿菌表達液中纖維素酶酶活力

將重組乳酸桿菌和非重組乳酸桿菌在含有羧甲基纖維素鈉為底物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，通過剛果紅染色，發(fā)現(xiàn)重組乳酸桿菌能明顯降解菌落周圍的羧甲基纖維素鈉（圖5），且D/d=4.42，而非重組乳酸桿菌D/d=1.12（表1）。

通過國標法測定重組乳酸桿菌培養(yǎng)上清中纖維素酶酶活力為1.25 U/mL，而非重組乳酸桿菌的酶活力僅為0.05 U/mL（表1），進一步驗證纖維素酶在重組乳酸桿菌中得到了表達。

圖4 重組乳酸桿菌表達上清SDS-PAGGEE圖Fig.4 SDS-PAGE of recombinant Lactobacillus expressed protein in supernatant

圖5 重組乳酸桿菌剛果紅平板培養(yǎng)Fig.5 Observation of recombinant Lactobacillus cultured on Congo red medium

表1 重組乳酸桿菌培養(yǎng)基和上清中纖維素酶活力測定結果Table 1 Cellulase activity of recombinantLactobacillus in solid medium and supernatant

3 討 論

近年來，秸稈纖維素的降解一直都是研究的熱點，但無論是從降解程度，還是降解成本來看，秸稈的降解還是要依靠微生物及其纖維素酶[9-10]。秸稈是一種結構復雜的物質(zhì)，主要組分包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[11]，因此，不是僅僅依靠一種酶就能解決的問題[12]。所謂纖維素酶是能水解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱，纖維素的降解是內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等協(xié)同作用的結果，所以秸稈纖維素降解是一個復雜的生物化學過程[13-14]。前期實驗已經(jīng)分離篩選了多株高產(chǎn)纖維素酶的微生物，如芽孢桿菌、乳酸桿菌、真菌等[15-16]，對秸稈均有不程度的降解作用，但是還很不理想，其原因可能是單一菌種、單一纖維素酶作用效果有限，不能按照自然界多種微生物、多種纖維素酶共同作用的原理降解秸稈。因此本實驗選擇來源于兩種芽孢桿菌的纖維素酶基因Cel15基因和Cel73基因，其中Cel15基因表達后是內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶，在纖維素和半纖維素生物降解過程中起重要作用的酶；Cel73基因表達后是外切β-葡聚糖酶，能夠催化葡聚糖中末端糖苷鍵的水解。通過基因工程技術將兩個基因融合在一起，共同在乳酸桿菌中進行表達，從而實現(xiàn)一種微生物產(chǎn)兩種不同纖維素酶的功能，提高了對纖維素的降解能力，結果也驗證了這一點。

目前科學家已從40多種細菌和多種真菌中克隆到纖維素酶基因，且分別在大腸桿菌、酵母、芽孢桿菌和乳酸桿菌等表達系統(tǒng)中進行了表達[17-18]。但就實際應用來說，將纖維素酶在乳酸桿菌中表達具有實際應用價值，因為利用大腸桿菌和芽孢桿菌進行發(fā)酵秸稈，氣味較臭、口感極差；酵母發(fā)酵會產(chǎn)生醇類等物質(zhì)易于揮發(fā)；乳酸桿菌本來就是秸稈青貯最主要的菌種，而利用重組纖維素酶的乳酸桿菌發(fā)酵秸稈不僅能有效降解秸稈中的纖維素，而且還可以產(chǎn)生乳酸、乙酸等次級代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物，不僅具有抗菌作用，而且還可以改變這種低值飼料的風味，有利于增加動物的采食量，提高料肉比。本實驗將兩個芽孢桿菌源的纖維素酶基因克隆到乳酸桿菌中并實現(xiàn)了表達，目的就是利用乳酸桿菌的益生特性，有利于以后進一步應用到生產(chǎn)中。

本實驗所使用的表達載體pMJ67是一種整合型載體，外源基因插入到多克隆位點后，能通過兩端的lacG和lacF同源臂整合到乳酸桿菌基因組上，并進行穩(wěn)定表達。另外，前期研究將短小乳桿菌的S-層蛋白的信號肽插入到了啟動子下游，并實現(xiàn)了引導外源蛋白進行分泌表達[19]。本實驗將融合的雙纖維素酶基因重組到該系統(tǒng)中，結果也表明融合的纖維素蛋白表達后能大量分泌到細胞外，再次驗證了該表達系統(tǒng)的構建是成功的，而分泌到胞外的纖維素酶有利于與外界的纖維素直接接觸而發(fā)生生物化學作用，結果顯示培養(yǎng)基上清中的對羧甲基纖維素酶的酶活力可達1.25 U/mL。 LI Wang等[5]將芽孢桿菌源纖維素酶基因重組到原核表達載體pET28a中并在大腸桿菌中表達，誘導后表達量僅為0.52 U/mL。張漫莉等[20]將纖維素酶EGA重組到枯草芽孢桿菌，在培養(yǎng)基上清中酶活力達到1 120 U/L。黃妙容等[21]將福壽螺多功能纖維素酶基因egx在真核細胞PK15中進行表達，對羧甲基纖維素鈉的酶活力為0.84 U/mL。結合文獻[19]結果，說明該表達系統(tǒng)具備了高效分泌表達外源蛋白的能力。后續(xù)實驗將進一步克隆其他種類的纖維素酶基因，使之重組到該表達系統(tǒng)中，然后利用表達不同纖維素酶的乳酸桿菌協(xié)同發(fā)酵秸稈，可能會得到比較理想的效果。

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Fusion Design and Secretory Expression in Lactobacillus casei of Two Cellulase Genes

DING Ke1,2, LUO Wei-guang1, DING Pan-pan1, LI Wang1, LI Yuan-xiao1, YU Zu-hua2, HENG Zi-qin1, JIA Yan-yan2, CHENG Xiang-chao2,3,*
(1. Hongxiang Biological Feed Laboratory of Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China; 2. Animal Disease and Public Safety Academician Workstation of Henan Province, Luoyang 471003, China; 3. Open Laboratory of Key Discipline for Enviroment and Animal Products Safety of Henan Institute of Higher Learning, Luoyang 471003, China)

Cellulase is a key enzyme for cellulose degradatio n. In order to enhance the efficiency of cellulose degradation, two different cellulase genes were fused and integrated into Lactobacillus genome, and efficiently expressed. Two pairs of primes were designed according to two cellulose genes in GenBank, a peptide containing 10 amid acids was inserted between the two genes. CelL15 and CelL73 were amplified by PCR method, and then fused and cloned into the expression vector pMJ67. The recombinant vector was electrotransferred into Lactobacillus casei. SDS-PAGE analysis showed that the fusion cellulase protein was successfully expressed and secreted into the cell culture supernatant, which was approximately 83 kD. Enzyme activity detection on solid medium indicated that the recombinant Lactobacillus could obviously degrade sodium carboxymethylcellulose in the medium, and the cellulase activity in the supernatant was up to 1.25 U/mL after culture for 36 h.

cellulase; recombinant Lactobacillus; fusion; secretion

Q939.99

A

1002-6630（2014）15-0127-05

10.7506/spkx1002-6630-201415026

2013-09-15

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101744）；河南省教育廳科學技術研究重點項目（13B230987）；洛陽市科技特派員項目（1103040A）

丁軻（1977—），男，副教授，博士，主要從事動物微生態(tài)學研究。E-mail：keding19@163.com

*通信作者：程相朝（1966—），男，教授，博士，主要從事動物傳染病學研究。E-mail：chengxch@126.com