龐業(yè)濱，黎樂(lè)群，彭寧福(綜述)，向邦德(審校)

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科，南寧530021)

根據(jù)最新的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，原發(fā)性肝癌已成為全球第5位最常見(jiàn)的惡性腫瘤，病死率排名第3位[1]。在中國(guó)，原發(fā)性肝癌年發(fā)病率居全部腫瘤第2位，病死率僅次于肺癌居第2位[2]。原發(fā)性肝癌中絕大部分(>85%)屬于肝細(xì)胞癌[3]。肝細(xì)胞癌惡性程度高，早期診斷率低，容易擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，術(shù)后易復(fù)發(fā)，對(duì)于晚期肝細(xì)胞癌患者，放療及化療的效果十分有限，影響肝癌患者預(yù)后的主要因素仍是就診時(shí)腫瘤的分期分級(jí)[4]。自從Bonnet等[5]首次于人類急性粒細(xì)胞白血病中分離出腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞群，之后在乳腺癌、前列腺癌等實(shí)體瘤中成功分離出腫瘤干細(xì)胞，研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞與腫瘤的形成、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)、耐藥有著很大的相關(guān)性。隨著研究的深入，研究者開(kāi)始探討這一功能上與組織干細(xì)胞十分相似的細(xì)胞類型，本質(zhì)上是否就是由組織干細(xì)胞突變而來(lái)[6]。這些研究成果使得人們不禁產(chǎn)生這樣的疑問(wèn)：對(duì)于原發(fā)性肝癌，以往的研究是否都過(guò)多關(guān)注成為“結(jié)果”的腫瘤細(xì)胞，而忽略了作為“原因”的腫瘤干細(xì)胞。

1 腫瘤的細(xì)胞起源學(xué)說(shuō)

關(guān)于腫瘤的細(xì)胞起源，目前有兩種主流的觀點(diǎn)。①一種觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤起源于成熟的組織細(xì)胞，由成熟細(xì)胞去分化成為幼稚細(xì)胞，重新獲得自我更新的能力，進(jìn)而突變形成腫瘤細(xì)胞。Friedmann等[7]發(fā)現(xiàn)，在大鼠中由致癌基因的突變而引起神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的去分化會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤的形成。Lazarevich等[8]通過(guò)重排肝細(xì)胞核因子(一種維持肝細(xì)胞穩(wěn)定性的因子)的基因序列，導(dǎo)致肝細(xì)胞的去分化、增殖并形成人與大鼠的肝細(xì)胞癌。②另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為腫瘤起源于組織中正常的干細(xì)胞，由干細(xì)胞的分化成熟受阻，再演變成腫瘤細(xì)胞。早在2001年，Reya等[6]在總結(jié)了前人研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，提出“腫瘤干細(xì)胞”學(xué)說(shuō)，認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是腫瘤內(nèi)可能存在的具有增殖、自我更新能力和多向分化潛能的干細(xì)胞樣細(xì)胞，是腫瘤形成的起始細(xì)胞，并認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是正常干細(xì)胞累積突變的結(jié)果，是由正常干細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)。Sell[9]認(rèn)為更有理由相信腫瘤起源于正常干細(xì)胞，依據(jù)主要是：①干細(xì)胞具有自我更新和分化能力，經(jīng)常處于增殖狀態(tài)，因此較成熟細(xì)胞更易受到攻擊而發(fā)生突變；②干細(xì)胞壽命較長(zhǎng)，有更多機(jī)會(huì)受到多次攻擊，并且有累積突變的條件，而形成腫瘤。時(shí)至今日，研究者已在眾多實(shí)體瘤(如腦腫瘤、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌)中相繼證實(shí)有腫瘤干細(xì)胞的存在[10]，同時(shí)不斷有文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為腫瘤的產(chǎn)生與正常干細(xì)胞突變有著密切的聯(lián)系。而對(duì)于腫瘤干細(xì)胞與正常干細(xì)胞的關(guān)系，Reya等[6]認(rèn)為兩者有很多相似的特性：①干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞均有自我更新及無(wú)限增殖能力；②干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞有相同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如Wnt-β聯(lián)蛋白通路、Notch通路、Sonic hedgehog通路等信號(hào)通路；③干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞具有端粒酶活性。但是，Marquardt等[11]認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞有自己的特性，并不完全等同于正常干細(xì)胞：①腫瘤干細(xì)胞自我更新能力的負(fù)反饋機(jī)制已被破壞，其增殖分化處于無(wú)序和失控的不平衡狀態(tài)；②腫瘤干細(xì)胞缺乏正常干細(xì)胞那樣的分化成熟能力；③腫瘤干細(xì)胞具有積累復(fù)制錯(cuò)誤的傾向，而正常干細(xì)胞通過(guò)多種途徑防止這種情況發(fā)生；④腫瘤干細(xì)胞有耐受遺傳毒性藥物及形成腫瘤的能力。根據(jù)現(xiàn)有的證據(jù)，肝癌起源的干細(xì)胞成熟受阻學(xué)說(shuō)目前得到較多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可。

2 肝癌的干細(xì)胞起源

2.1肝干細(xì)胞 在成體肝臟組織中，肝干細(xì)胞主要有肝內(nèi)源性和外源性兩種來(lái)源。肝內(nèi)來(lái)源主要是指位于肝內(nèi)膽管最小末端的卵原細(xì)胞，是目前較為公認(rèn)的肝臟干細(xì)胞。卵原細(xì)胞具有雙向分化潛能，在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，同時(shí)分裂增殖能力被阻抑的情況下，從休眠狀態(tài)中活化，分化成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞及膽管細(xì)胞，完成肝臟的結(jié)構(gòu)及功能的重建。Furuyama等[12]通過(guò)對(duì)大鼠體內(nèi)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Sox9細(xì)胞的譜系追蹤，證實(shí)了大鼠肝臟起始細(xì)胞定位于末梢膽管上皮。Yoon等[13]則證實(shí)在人類成體肝臟中存在著相似的肝臟起始細(xì)胞。肝外來(lái)源肝干細(xì)胞主要有血液循環(huán)中的骨髓干細(xì)胞，以及少部分胰腺上皮細(xì)胞。Liu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓干細(xì)胞可在肝臟損傷或是細(xì)胞因子的趨化作用下，移行至肝臟匯管區(qū)，并在特定環(huán)境下分化成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞。肝內(nèi)及肝外來(lái)源的肝干細(xì)胞解剖上均定位于膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的移行處，也即是膽管系統(tǒng)的末梢—Hering管及其周圍。

2.2肝干細(xì)胞與肝癌發(fā)生密切相關(guān) 在肝硬化等被認(rèn)為是肝癌癌前病變的慢性肝病中，通常會(huì)出現(xiàn)卵原細(xì)胞的增殖，提示肝臟干細(xì)胞與肝癌癌變有關(guān)。Lowes等[15]發(fā)現(xiàn)酒精性肝病、慢性丙型肝炎、肝硬化和肝癌等組織中均有卵原細(xì)胞出現(xiàn)，且隨著病情程度加重而增多；在此基礎(chǔ)上，Galicia等[16]最新的研究發(fā)現(xiàn)，在人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)同源基因(注：PTEN基因和p53基因類似，是作用較為廣泛的抑癌基因，在多種腫瘤中均有出現(xiàn)，公認(rèn)簡(jiǎn)稱為PTEN基因)抑癌基因缺失的動(dòng)物模型中，是肝臟慢性炎癥階段促使了原始腫瘤起始細(xì)胞(tumor initial stem cell,TISC)的產(chǎn)生，而非PTEN基因缺失本身。最近2年，基因功能分析技術(shù)及分子病因?qū)W研究方面的進(jìn)展，使得人們對(duì)于肝干細(xì)胞在肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的變化有了更本質(zhì)的認(rèn)識(shí)。在肝癌發(fā)生早期，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)信號(hào)途徑通過(guò)中間蛋白SMAD(drosophila mothers against decapentaplegic protein)，激活細(xì)胞分化程序并抑制細(xì)胞周期循環(huán)。研究者發(fā)現(xiàn)，在促進(jìn)分化及生長(zhǎng)停滯的信號(hào)途徑中，一些中間調(diào)節(jié)因子(如β2-Spectrin)的丟失，將會(huì)導(dǎo)致肝干細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化并形成肝癌，而在肝癌的TISC細(xì)胞群中，TGF-β促分化信號(hào)的丟失，會(huì)導(dǎo)致TISC內(nèi)高表達(dá)胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct4和Nanog，同時(shí)賦予TISC自我更新的能力[17]。經(jīng)典的β聯(lián)蛋白信號(hào)途徑是通過(guò)激活T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子啟動(dòng)子起作用，而這也是正常干細(xì)胞增殖、存活及抑制分化的機(jī)制。β聯(lián)蛋白信號(hào)途徑及其相關(guān)蛋白的變異則通常指β聯(lián)蛋白的激活，但是Wnt途徑未被啟動(dòng)，這一現(xiàn)象多在因慢性肝損傷而代償性增殖的肝干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，并最終導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[18]。在一份最新的研究報(bào)告中，來(lái)自中國(guó)上海東方肝膽外科醫(yī)院的Wu等[19]將大鼠干細(xì)胞樣多能細(xì)胞——WB-F344細(xì)胞暴露于低劑量TGF-β下處理18周，發(fā)現(xiàn)TGF-β長(zhǎng)期處理削弱了WB-F344細(xì)胞的干細(xì)胞潛能，卻賦予了其腫瘤起始細(xì)胞的特性，包括表達(dá)TISC的標(biāo)志物、自我更新能力及藥物抗性的增加，以及對(duì)非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(Non-obese diabetic/severe combined immunodeficient,NOD/SCID)大鼠的致瘤性。研究最后認(rèn)為，TGF-β可誘導(dǎo)硬化肝的干細(xì)胞樣細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化為TISC細(xì)胞，并通過(guò)依賴miR-216a/PTEN/Akt途徑促進(jìn)肝癌發(fā)生。歸結(jié)起來(lái)，基因功能分析已確認(rèn)的使肝干細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)變的信號(hào)途徑包括：有絲分裂原激活的蛋白激酶，磷脂酰肌醇磷酸激酶，TGF-β和β聯(lián)蛋白途徑，轉(zhuǎn)化為TISC后高表達(dá)多能相關(guān)性轉(zhuǎn)錄因子，包括Nanog、Oct4、c-Myc和Sox2等[11]。由此推斷，肝干細(xì)胞的自我更新失調(diào)控有可能是肝癌形成的早期事件，肝癌的發(fā)生與肝干細(xì)胞密切相關(guān)。

3 肝癌干細(xì)胞(肝癌起始細(xì)胞)的分離鑒定

迄今為止，還未能在肝癌組織中分離出真正意義上的肝癌干細(xì)胞。在分離鑒定肝癌干細(xì)胞方面，使用較多的方法是，以一些被認(rèn)為是肝干細(xì)胞表面標(biāo)志物的細(xì)胞表面抗原特異性標(biāo)記細(xì)胞后進(jìn)行分離。CD133，又稱為Prominin-1，是一種跨膜糖蛋白，最初發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)上皮干細(xì)胞，CD133的表達(dá)已在多個(gè)人類肝癌細(xì)胞系中得到證實(shí)[20]。最近的研究表明TGF-β信號(hào)途徑在機(jī)制上調(diào)控著CD133在Huh7細(xì)胞系中的表觀遺傳修飾，且CD133的表達(dá)水平被認(rèn)為與肝癌起始有關(guān)[21]；上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)在新生肝臟組織及膽管系統(tǒng)中高表達(dá)，在成熟肝細(xì)胞中不表達(dá)，并且TISC信號(hào)途徑β聯(lián)蛋白的激活可使EpCAM的表達(dá)上調(diào)[22]，據(jù)此可以作為肝臟干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞相互聯(lián)系的佐證，其表達(dá)與患者預(yù)后有關(guān)[13]；CD44屬于黏附分子家族，在肝癌中CD44的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及化療耐藥有關(guān)[23]。除此之外，CD90也是報(bào)道了較多在肝癌組織中高表達(dá)的干細(xì)胞標(biāo)志物[24]。由于這些標(biāo)志物在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)率從1%～60%不等[23]，因此結(jié)合多個(gè)標(biāo)志物的共表達(dá)對(duì)肝癌干細(xì)胞的篩選將更為特異。肝癌組織中高表達(dá)上述標(biāo)志物的細(xì)胞較其他腫瘤細(xì)胞有更強(qiáng)的體外成瘤能力、更強(qiáng)的侵襲性、更高的耐藥性和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)能力，并且擁有自我更新及增殖分化的能力。

此外，在肝癌組織中還分離出一種被稱為側(cè)群(side population,SP)細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞。SP細(xì)胞由于細(xì)胞膜上存在腺苷三磷酸結(jié)合盒，能夠?qū)晒馊玖螲oechst 33342轉(zhuǎn)移出細(xì)胞外而被識(shí)別，這一特性也被成為SP表型。Chiba等[25]通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞同時(shí)擁有肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞表型，并且SP細(xì)胞與非SP細(xì)胞相比，表現(xiàn)出高增殖潛能和抗凋亡能力、高度的自我增殖和體外成瘤能力，1×103個(gè)側(cè)群細(xì)胞即可使NOD/SCID大鼠成瘤，而非側(cè)群細(xì)胞1×106個(gè)仍不能使NOD/SCID大鼠成瘤，據(jù)此認(rèn)為SP細(xì)胞可能聚集了大部分甚至全部的肝癌干細(xì)胞。但并不是所有具有SP表型的細(xì)胞均有干細(xì)胞特性，也不是所有腫瘤干細(xì)胞都有SP表型。Lichtenauer等[26]對(duì)腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞系NCI-h295R的研究，以及Burkert等[27]對(duì)胃腸道癌的研究均證實(shí)，這些癌組織中的SP細(xì)胞不具有干細(xì)胞特性。Hill等[28]的研究認(rèn)為，用于SP分選的Hoechst 33342染料具有細(xì)胞毒性，SP細(xì)胞由于腺苷三磷酸結(jié)合盒的轉(zhuǎn)運(yùn)作用而免受毒害，而非SP細(xì)胞則沒(méi)有這層細(xì)胞膜上的保護(hù)性蛋白，不能存活，因此SP細(xì)胞的致瘤性可能是Hoechst 33342染料的毒性而人為導(dǎo)致的。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

隨著對(duì)肝腫瘤干細(xì)胞研究的不斷深入，不斷有證據(jù)支持肝癌起源于干細(xì)胞，同時(shí)也表明肝癌組織中確實(shí)存在肝癌干細(xì)胞。但是，肝癌的干細(xì)胞起源學(xué)說(shuō)還面臨著許多未解的難題，例如干細(xì)胞在演變?yōu)楦伟┻^(guò)程中經(jīng)歷了哪些基因變化，具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如何都還未得到詳細(xì)闡明。因此，對(duì)肝干細(xì)胞癌變機(jī)制的探討，將揭示其在肝癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，以及耐藥和復(fù)發(fā)過(guò)程中的作用，為研究肝癌新的診斷治療方法提供理論依據(jù)。

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