張金敏，張松林(綜述)，魏 蕾(審校)

(1.三峽大學(xué)心血管病研究所 宜昌市中心人民醫(yī)院心胸外科，湖北 宜昌 443003; 2.武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，武漢 430071)

缺血/再灌注損傷是臨床器官移植最常見的病理過程，是導(dǎo)致同種移植物術(shù)后早期功能不全的主要原因和晚期并發(fā)癥(如移植物血管病變)的主要相關(guān)因素[1]。尤其在目前供體不足的情況下，較多的利用受到不同程度的損傷甚至是非心跳的供體器官，更易受到缺血/再灌注損傷的影響。因此，尋找一種有效的減輕缺血/再灌注損傷的治療方法是移植領(lǐng)域研究的方向之一。Smith等[2]在1992年意外發(fā)現(xiàn)以一氧化碳(carbon monoxide,CO)中毒患者為供體來源的心臟移植，術(shù)后排斥反應(yīng)輕，移植物功能較好。由于CO的毒性，直到后來發(fā)現(xiàn)源于血紅素加氧酶(heme oxygenase,HO)催化亞鐵血紅素降解產(chǎn)生的內(nèi)源性CO，它的生理作用才得到重視。CO是一種與一氧化氮類似的氣體信號(hào)分子，在調(diào)節(jié)血管張力、細(xì)胞生長與應(yīng)急等方面發(fā)揮關(guān)鍵性作用。近年來，有學(xué)者把外源性CO用于器官移植研究，發(fā)現(xiàn)其與HO-1有類似的作用，可以明顯減輕器官移植物缺血/再灌注損傷，并探明了部分機(jī)制。

1 CO具有改善微循環(huán)的作用

微循環(huán)紊亂是器官移植物缺血/再灌注損傷的特征性表現(xiàn)之一。移植物冷保存期間的缺血缺氧導(dǎo)致血管內(nèi)皮通透性和黏附分子表達(dá)的增加，內(nèi)皮細(xì)胞失去其抗黏附的特性并形成易于黏附的表面。移植恢復(fù)血流后，缺血受損的內(nèi)皮細(xì)胞黏附血小板和白細(xì)胞，釋放細(xì)胞因子和縮血管物質(zhì)，進(jìn)一步加劇炎性反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，增加血管阻力而導(dǎo)致微循環(huán)紊亂[3]。研究表明，CO可以通過保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)、調(diào)節(jié)血管張力和抗凝作用來改善器官移植物缺血/再灌注損傷后的微循環(huán)紊亂[3]。

1.1CO保護(hù)VECs VECs是缺血/再灌注損傷的主要作用靶區(qū)，其損傷可導(dǎo)致器官移植物的微循環(huán)紊亂和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活。在形態(tài)學(xué)上，冷保存再灌注后損傷的VECs表現(xiàn)為移植物內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31的表達(dá)明顯減少，并出現(xiàn)不規(guī)則和中斷現(xiàn)象；掃描電鏡顯示VECs有較多空泡形成和線粒體的破壞；而受體吸入CO組(250×10-6kg/L)卻發(fā)現(xiàn)毛細(xì)血管CD31著色的VECs呈線型排列，細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)保存完好；透射電鏡三維顯像示毛細(xì)血管呈網(wǎng)絡(luò)狀排列和較好的充盈狀態(tài)，近似正常組織的超微結(jié)構(gòu)[4-5]。這提示CO可以通過保存VECs的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性來減輕移植物缺血/再灌注損傷。

資料表明，損傷的VECs可以上調(diào)黏附分子的表達(dá)，如細(xì)胞黏附分子1、血管細(xì)胞黏附分子1、P選擇素等，從而促進(jìn)VECs與白細(xì)胞和血小板的黏附，導(dǎo)致微循環(huán)的紊亂和移植物損傷[3]。因此，抑制黏附分子的表達(dá)將有助于緩解移植物缺血/再灌注損傷。這在大鼠腎移植與肺移植實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，吸入CO可以顯著降低再灌注后移植物內(nèi)細(xì)胞黏附分子1 mRNA的表達(dá)[4-5]，減少白細(xì)胞的黏附和浸潤。

在體外細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，同樣證實(shí)了CO對(duì)VECs的保護(hù)性影響。Brouard等[6]的研究顯示，外源性CO(10000×10-6kg/L)明顯阻止腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的VECs凋亡，其保護(hù)機(jī)制與p38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)的活化有關(guān)，使用p38 MAPK抑制劑(SB203580)可以逆轉(zhuǎn)CO的保護(hù)性影響[6]；Caumartin等[7]亦證實(shí)，CO釋放分子2預(yù)處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，可以明顯減輕其缺氧/再氧化損傷，并證實(shí)與CO的抗炎作用有關(guān)。

1.2CO調(diào)節(jié)血管張力 微循環(huán)紊亂的另一特點(diǎn)是移植物缺血或再灌注后血管灌注壓明顯升高。損傷的VECs釋放縮血管物質(zhì)內(nèi)皮縮血管肽1，導(dǎo)致血管阻力增加。研究表明，CO可以抑制人肺動(dòng)脈VECs和血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)皮縮血管肽1的表達(dá)[6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，受體吸入CO(250 ×10-6kg/L)可以明顯阻止心臟移植后內(nèi)皮縮血管肽1的激活，并改善移植物功能[8]。這證實(shí)了CO可以通過抑制縮血管物質(zhì)的表達(dá)而發(fā)揮其擴(kuò)血管功能。

此外，可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylate cyclase，sGC)的活化及其伴隨的環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)產(chǎn)生在CO調(diào)節(jié)血管張力中起關(guān)鍵作用。cGMP可以激活其下游的cGMP效應(yīng)蛋白，如蛋白激酶，從而導(dǎo)致血管平滑肌松弛。由于外源性CO可以明顯提高細(xì)胞內(nèi)cGMP的濃度，可以認(rèn)為CO的舒血管功能至少部分是cGMP依賴性的。在肺、腎移植的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，受體給入CO(250×10-6kg/L)或CO釋放分子預(yù)處理可以明顯改善移植物內(nèi)的血流[3,9]，而CO的這種有益影響可以被sGC的選擇性抑制劑所逆轉(zhuǎn)，這間接地證實(shí)sGC/cGMP途徑介導(dǎo)了CO的舒血管作用。

1.3CO具有抗凝作用 血小板在器官移植物缺血/再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制起重要作用，它激活后可以分泌促凝物質(zhì)(如血栓素A2)，導(dǎo)致微循環(huán)內(nèi)血細(xì)胞黏附、纖維素沉積和血栓形成。CO具有強(qiáng)大的抗凝功能，能抑制血小板釋放血栓素。在熱缺血/再灌注肺損傷模型中，吸入CO明顯抑制纖溶酶原活化因子抑制劑1的表達(dá)，減少微血管內(nèi)的纖維素沉積[10-11]。Mishra等[11]在大鼠同系肺移植實(shí)驗(yàn)中觀察到，CO不僅能減少纖維素和白細(xì)胞沉積，還明顯抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的活性和促凝激活劑早期生長反應(yīng)因子1的表達(dá)。但抑制sGC的活性可以抵消CO的這種保護(hù)性影響，提示CO的抗凝功能也可能是經(jīng)sGC/cGMP途徑介導(dǎo)的[10-11]。此外，CO也可經(jīng)激活糖蛋白Ibα介導(dǎo)的機(jī)制抑制血小板凝集和白細(xì)胞黏附，從而改善微循環(huán)。

2 CO具有強(qiáng)大的抗炎癥特性

炎癥免疫反應(yīng)是器官移植物缺血/再灌注損傷的最主要的特征。損傷的組織細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子和各種酶類物質(zhì)，移植物內(nèi)伴有中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞甚至T淋巴細(xì)胞浸潤。已經(jīng)證明，CO對(duì)各種損傷均具有抗炎作用[3]。CO不僅可以保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的組織炎癥損傷和下調(diào)眾多促炎因子的表達(dá)(如腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6等)，且對(duì)移植物缺血/再灌注損傷也顯示出強(qiáng)大的抗炎功能。在一系列的動(dòng)物移植模型中，受體在移植前1 h和移植后24 h持續(xù)吸入低濃度的CO(250×10-6kg/L)，可以明顯減輕冷保存再灌注后腎、心臟、肺和肝臟移植物內(nèi)的炎性細(xì)胞浸潤[7,9,12-15]。其機(jī)制與CO下調(diào)促炎介質(zhì)(如腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6、誘生型一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶2等)的表達(dá)密切相關(guān)。

另有研究表明，核因子κB作為參與炎性反應(yīng)的一個(gè)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，調(diào)節(jié)許多炎癥基因的表達(dá)，在誘導(dǎo)不同的器官移植物缺血/再灌注炎癥損傷中起重要作用[3]。在肝、肺移植動(dòng)物研究中，均發(fā)現(xiàn)核因子κB在移植血流恢復(fù)后迅速激活，而CO可以明顯減少炎性因子的表達(dá)和減輕移植物的損傷程度，但核因子κB的活性無明顯變化[3,5,10]。相反的是，低濃度CO能抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的產(chǎn)生，其機(jī)制與CO抑制核因子κB的激活有關(guān)[16]。因此，核因子κB途徑是否介導(dǎo)了CO對(duì)器官移植物缺血/再灌注炎癥損傷的保護(hù)性影響，目前仍有爭議。

此外，MAPK可能是移植物缺血/再灌注炎癥損傷的另一重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。MAPK主要包括p38MAPK、ERK、c-Jun氨基端激酶三個(gè)家族，與多種炎癥性疾病有關(guān)。研究顯示，CO的抗炎特性與MAPK激活有關(guān)，如CO能選擇性地激活p38MAPK和其上游的MAPK激酶，從而保護(hù)人肺上皮細(xì)胞的氧化損傷[6]。在大鼠同系肺、肝臟移植模型中，冷保存再灌注后移植物內(nèi)MAPK的三種激酶明顯激活，吸入低濃度CO[(20～250)×10-6kg/L]明顯改善移植肺的氧合功能，下調(diào)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，且證實(shí)CO的這種保護(hù)性影響與抑制ERK1/2的激活有關(guān)[10,15]，而CO并未抑制p38MAPK或c-Jun氨基端激酶的活性。

3 CO抑制樹突狀細(xì)胞的成熟與遷徙

近年來的研究表明，樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)在缺血/再灌注損傷中也起重要作用。損傷細(xì)胞釋放內(nèi)源性配體與DC上的Toll樣受體結(jié)合，通過一系列蛋白質(zhì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子的釋放，如白細(xì)胞介素12、干擾素γ、白細(xì)胞介素6和腫瘤壞死因子α等，從而損傷缺血/再灌注器官。目前，在移植背景中探討CO與DC關(guān)系的研究極少。Kotsch等[17]在一組同種大鼠腎移植研究中，用CO的前體藥物二氯甲烷預(yù)處理供體，移植后與對(duì)照組比較，發(fā)現(xiàn)受體脾臟主要組織相容性抗原Ⅱ、CD80、CD86等分子的表達(dá)明顯減少，同時(shí)趨化因子干擾素誘導(dǎo)蛋白10的表達(dá)亦顯著減少，而移植物內(nèi)上述分子無明顯變化。這提示CO預(yù)處理供體可以抑制移植物DC的成熟和遷徙，降低移植物的免疫原性，減輕器官移植物的缺血/再灌注損傷。但CO調(diào)節(jié)DC的具體機(jī)制仍有待闡明。

4 CO具有抗凋亡作用

凋亡是器官移植物冷保存再灌注后常見的病理生理現(xiàn)象。業(yè)已證明，抑制細(xì)胞死亡信號(hào)通路是阻止器官移植物缺血/再灌注損傷的重要策略[3]，而凋亡細(xì)胞死亡又是促發(fā)炎癥和組織損傷的關(guān)鍵因素，這提示凋亡在移植物缺血/再灌注損傷和功能不全中起重要作用。

前已述及，CO可以通過激活p38MAPK抑制腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的VECs凋亡[6]。在移植背景中，CO可以經(jīng)不同的信號(hào)機(jī)制，同樣顯示出抗凋亡功能。Neto等[4]在大鼠腎冷保存24 h后移植的模型中發(fā)現(xiàn)，胱天蛋白酶3(caspase-3)陽性著色主要位于腎小管上皮細(xì)胞和管腔的細(xì)胞或碎片，移植后6 h陽性著色細(xì)胞數(shù)達(dá)最多，而受體吸入CO(250×10-6kg/L)則明顯減少腎小管caspase-3陽性細(xì)胞的凋亡數(shù)(峰值<50%)。同樣，在器官保存液中加入CO釋放分子3，能明顯抑制低溫誘導(dǎo)的腎小球和腎小管細(xì)胞凋亡，并改善移植腎臟功能，其抗凋亡功能與CO穩(wěn)定線粒體膜有關(guān)[18-19]。此外，采用二氯甲烷誘導(dǎo)受體小鼠產(chǎn)生CO，發(fā)現(xiàn)能明顯減輕移植誘導(dǎo)的缺血/再灌注損傷，移植心臟再灌注后凋亡細(xì)胞明顯減少，并證實(shí)CO的這種保護(hù)性影響與抑制促凋亡基因Bcl-2 mRNA和caspase-3的表達(dá)有關(guān)[20]。

目前，CO的抗凋亡影響在細(xì)胞模型和在體動(dòng)物中均得到證實(shí)。但是，它對(duì)器官移植物缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用是否主要通過抑制細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，目前仍不清楚。因此，關(guān)于凋亡在缺血/再灌注損傷中的具體作用以及CO在缺血/再灌注損傷中抗凋亡的信號(hào)機(jī)制，都有待于深入研究。

5 小 結(jié)

在各種動(dòng)物移植模型的研究中，CO可通過改善微循環(huán)、抗炎作用、抑制DC成熟與遷徙、抑制凋亡等機(jī)制，明顯減輕器官移植物缺血/再灌注損傷。此外，CO可應(yīng)用于邊緣性供體、已切除的移植物及受體，符合獨(dú)特的移植環(huán)境，是最有希望用于臨床移植的方法之一。但目前臨床應(yīng)用CO的研究較少，且部分結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果并不一致，這可能與外源性CO作用的不同模型、持續(xù)時(shí)間、吸入濃度以及作用的靶組織和靶細(xì)胞的差異性有關(guān)。此外，尚需進(jìn)一步研究CO保護(hù)器官移植物相關(guān)機(jī)制并深入探討CO的毒性、藥動(dòng)學(xué)及其生物學(xué)功能，以利于把這些研究成果應(yīng)用于臨床。

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