龍致科，黃柳云，周傳檢，胡永志，王 韌，李秋芳，周 慧

（柳州兩面針股份有限公司，廣西 柳州 545001）

抑菌中藥的性能及其在家用洗滌劑中的應(yīng)用研究

龍致科，黃柳云，周傳檢，胡永志，王 韌，李秋芳，周 慧

（柳州兩面針股份有限公司，廣西 柳州 545001）

測試了黃芩、甘草、苦參、白鮮皮、當歸等中藥的提取物和含中藥成分的洗滌劑對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果。同時，對比了甲基異噻唑啉酮、三氯生和對氯間二甲苯酚等化學防腐/抑菌劑的抑菌效果、刺激性和毒性。結(jié)果顯示，中藥抑菌成分有較好的抑菌效果，刺激性和毒性都很低。

洗滌劑；抑菌；中草藥；大腸桿菌；金黃色葡萄球菌

我國中草藥的應(yīng)用具有系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)和豐富的臨床實踐，將中草藥應(yīng)用于抗菌抑菌、治療病毒類疾病的歷史悠久。最新的諸多研究表明，多種中草藥的提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有較好的抑制效果。同現(xiàn)今廣泛使用的抗生素以及化學防腐劑相比，中草藥中所含的抗菌物質(zhì)具有毒副作用小、安全性高等優(yōu)點。因此，以中草藥提取物代替化學防腐/抑菌劑，已成為諸多領(lǐng)域研究的新熱點。

以《中國藥典》的相關(guān)記載為依據(jù)，選取黃芩、甘草、苦參、白鮮皮、當歸等5種中草藥進行抑菌效果研究。通過抑菌圈法和抑菌率法，測試分析中藥成分對大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌的抑菌作用，為進一步研究開發(fā)中草藥抑菌成分在洗滌劑中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

目前，市場上的家用除菌類洗滌劑大都使用甲基異噻唑啉酮、三氯生和對氯間二甲苯酚（PCMX）等化學防腐/抑菌劑來達到除菌效果。然而，由于化學防腐抑菌劑容易存在刺激性和毒副作用較大等不良反應(yīng)，其在洗滌劑或化妝品中的用量受到相關(guān)法規(guī)的限制。所以，一般日用除菌產(chǎn)品的除菌效果不是很理想。另外，如果長期使用含化學防腐/抑菌劑的洗滌用品，其刺激性和毒副作用還會威脅人體健康，存在安全隱患。因此，合理運用中藥成分來防腐/抑菌，能夠有效降低洗滌產(chǎn)品的刺激性和毒副作用，有助于開發(fā)出更加安全有效的植物抑菌產(chǎn)品，從而更有利于人們享受健康生活。

1 材料與方法

1.1 材料

供試中藥材：黃芩、甘草、苦參、白鮮皮和當歸。

供試菌種：大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC 6538），菌種均由廣東省微生物分析檢測中心提供。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

潔凈操作臺，立式高壓滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱，抑菌圈測量儀，微量移液槍等。

1.2.2 試劑

1）硬水：標準硬水，硬度342mg/L（氯化鈣0.034g，氯化鎂0.139g，蒸餾水加至1L）。

2）磷酸鹽緩沖液（PBS），0.03mol/L，pH值7.2～7.4（無水磷酸氫二鈉2.83g，磷酸二氫鉀1.36g，蒸餾水加至1L）。

3）營養(yǎng)瓊脂。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

用75%乙醇溶液，按產(chǎn)出藥水∶藥材＝1∶1比例提取濃縮，制備中藥提取物，控制提取液酒精濃度小于25%。

將按上述方法制備的黃芩、甘草、苦參、白鮮皮和當歸提取物等量制成中藥混合藥水。

1.4 抑菌圈試驗

菌液的制備：取菌種第3～14代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物（18～24h），用5mL的0.03mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）洗下菌苔；使菌懸浮均勻后，用PBS稀釋至所需濃度。菌懸液為5×105～5×106cfu/mL。

采用管碟法，用微量移液槍吸取上述菌懸液100μL至已完全凝固的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，立即用無菌玻璃涂布棒均勻涂布，蓋好平皿，置室溫干燥5～10min。然后，用無菌鑷子將無菌牛津杯立在培養(yǎng)基表面，各牛津杯中心距離25cm以上，與平皿周邊距離15cm以上，切勿弄破培養(yǎng)基。最后，用硬水將中藥醇提取物分別稀釋成1∶1、1∶50、1∶100三個作用濃度，并將其滴加至液面與牛津杯表面平行，將培養(yǎng)皿放置在37℃溫箱，培養(yǎng)16h～18h后觀察結(jié)果。

采用“十字交叉法”測定抑菌圈大小。參照《消毒技術(shù)規(guī)范》和《中藥藥理學》的抑菌圈結(jié)果判定標準：抑菌圈直徑≥20mm為高度敏感，10～19mm為中度敏感，≤10mm為低敏感，0mm為無抑菌效果。

1.5 抑菌率試驗

將試驗菌18～24h斜面培養(yǎng)物用PBS洗下，制成菌懸液。要求的濃度為：用100μL滴于5mL樣液內(nèi)，回收菌數(shù)為1×104～9×104cfu/mL。

取被試樣液（按1∶1的比例用硬水稀釋被試樣液）和對照樣液各5mL，分別再向其內(nèi)滴加100μL菌懸液，均勻混合，開始計時；作用2min后，分別吸取樣液0.5mL加入含5mL PBS的試管內(nèi)，充分混勻；然后，適當進行稀釋，取其中2～3個稀釋度，分別吸取1mL，置于平皿，用晾涼至40～45℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（細菌）作傾注，轉(zhuǎn)動平皿，使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板，35℃±2℃培養(yǎng)48h，作活菌菌落計數(shù)。

試驗重復(fù)3次，取其平均值，抑菌率＞50%為有抑菌作用，＞90%為有較強抑菌作用。按下式計算抑菌率：

X＝(A-B)÷A×100%

式中，A代表對照樣菌數(shù)，B代表試驗樣菌數(shù)。

1.6 抑菌穩(wěn)定性試驗

在一定比例的中藥混合提取物中加入表面活性劑，制得抑菌洗滌劑。將洗滌劑按1∶1進行稀釋，按抑菌率測試方法分別對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進行抑菌試驗。作用時間2min，測定和計算洗滌劑的平均抑菌率。之后，將它們密封保存在40℃的恒溫箱內(nèi)135天。最后，取出恢復(fù)至室溫，再進行同樣的測試。通過比較封存前后抑菌率的變化，評價其抑菌穩(wěn)定性。

1.7 刺激性試驗

使用孵化到第9天的受精雞蛋，剪開氣室端的蛋殼；在卵殼膜上加幾滴蒸餾水，讓絨毛囊膜（CAM）與卵殼膜分離，剝?nèi)サ澳ぢ冻鲅芑腃AM，選用不受損的CAM進行試驗。

在CAM上滴加0.1mL樣品，30s后用0.75%的鹽水沖洗CAM至干凈。觀察和記錄5min內(nèi)血管充血、出血和凝血出現(xiàn)的初始時間，并計算刺激分值。刺激分值越大，則表示樣品的刺激性越大。

刺激分值的計算公式為：

IS＝[(301-A)×5+(301-B)×7 +(301-C)×9]÷300

式中：A—充血初始時間（s）；B—出血初始時間（s）；C—凝血初始時間（s）。

1.8 毒理試驗

選用20只昆明小鼠進行毒理試驗，雌、雄各半。采用一次最大限度試驗法，劑量設(shè)定為5000mg/kg體重。試驗前，動物禁食16h，不限飲水。按0.4mL/20g體重的量給動物灌喂樣品。灌喂后，觀察、記錄動物的中毒癥狀和死亡情況，連續(xù)觀察14天。

2. 結(jié)果和分析

2.1 抑菌圈試驗結(jié)果

2.1.1 中藥提取物對大腸桿菌的抑菌效果

黃芩、甘草、苦參、白鮮皮和當歸這5種中草藥的提取物對大腸桿菌的抑菌效果見表1。

由表1可知，在對大腸桿菌的抑菌圈試驗中，測試的中藥醇提取物的抑菌效果隨著其作用濃度的增大而增強。當作用濃度為1∶100時，僅有當歸醇提物出現(xiàn)低敏抑菌作用，其他均無抑菌作用；當作用濃度為1∶50時，有4種中藥提取物有抑菌作用，其敏感度由大到小依次為：甘草＞白鮮皮＞苦參＞當歸；當作用濃度為1∶1時，5種中藥提取物均具有高敏抑菌作用，且抑菌圈直徑在25.00～29.00mm。

2.1.2 中藥醇提物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

黃芩、甘草、苦參、白鮮皮和當歸5種中草藥的醇提物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果見表2。

由表2可知，這5種中藥提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用與藥水濃度的關(guān)系是：藥水濃度越大，抑菌效果越好。在1∶50與1∶100的作用濃度條件下，抑菌效果僅有甘草、苦參、當歸3種存在較為明顯的區(qū)別，兩個作用濃度的抑菌圈差值在4.00mm以上，而黃芩、白鮮皮在這兩個作用濃度下的抑菌作用區(qū)別并不大；當作用濃度為1∶1時，5種中藥醇提物均出現(xiàn)明顯的抑菌圈，抑菌圈直徑在22.00～33.00mm，均為高敏抑菌作用。

2.2 抑菌率試驗結(jié)果

按1.5的步驟，通過實驗測試了各種中草藥提取物對試驗菌的抑菌率，并與甲基異噻唑啉酮、三氯生和對氯間二甲苯酚（PCMX）等化學防腐/抑菌劑的抑菌率進行了對比，結(jié)果見表3。

由表3可以看出：1）與空白樣對比，證明酒精含量低于25%的黃芩、甘草、苦參、白鮮皮、當歸等中藥提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有一定的抑菌作用。2）0.3%的三氯生溶液抑菌效果最好，對兩個試驗菌的抑菌率都能達到99.99%。3）黃芩、甘草、苦參、白鮮皮、當歸等中藥提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用強于甲基異噻唑啉酮；0.5%對氯間二甲苯酚（PCMX）溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌率達到99.85%，稍高于各中藥提取物的抑菌率；0.5% PCMX對大腸桿菌的抑菌率則低于中藥提取物。

2.3 抑菌穩(wěn)定性試驗結(jié)果

含中藥混合提取物的洗滌劑樣品密封保存于40℃，保存135天后分別以50%和80%的濃度，洗滌劑對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作用2min，測試了含中藥提取物的洗滌劑的抑菌穩(wěn)定性。結(jié)果見表4。

表1 中草藥提取物對大腸桿菌的抑菌效果（抑菌圈直徑：mm）

表2 中草藥提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果（抑菌圈直徑：mm）

表3 中草藥提取物對試驗菌的抑菌率

表4的結(jié)果顯示，含50%中藥混合提取物的樣品對金黃色葡萄球菌的抑菌率＞90%，對大腸桿菌的抑菌率＞50%；含80%中藥混合提取物的樣品對金黃色葡萄球菌的抑菌率＞90%，對大腸桿菌的抑菌率＞80%。與存放前相比幾乎都沒有變化。這表明，含中藥提取物洗滌劑的抑菌穩(wěn)定性良好。

2.4 刺激性實驗結(jié)果

按1.7的方法，通過實驗測試了各種中草藥提取物的刺激性，并與甲基異噻唑啉酮、三氯生和PCMX等化學防腐/抑菌劑進行了對比，結(jié)果見表5。

表5的數(shù)據(jù)顯示：1）不同濃度（原液、1%和0.01%）的黃芩、甘草、苦參、白鮮皮、當歸等中藥提取物，在5min內(nèi)血管未出現(xiàn)充血和出血現(xiàn)象，刺激分值為最低值0.07，屬于無刺激。2）0.01%和1%的三氯生溶液和對氯間二甲苯酚（PCMX）溶液刺激分值為0.07，屬于無刺激。3）0.01%甲基異噻唑啉酮溶液的刺激分值為0.57，屬于微刺激；而1%甲基異噻唑啉酮溶液的刺激分值為21.07，有較大刺激性。

2.5 毒性試驗結(jié)果

按1.8的方法，通過實驗測試了各種中草藥提取物的毒性，并與甲基異噻唑啉酮、三氯生和PCMX等化學防腐/抑菌劑進行了對比，結(jié)果見表6。

表6結(jié)果表明，各中藥提取物的LD50都大于5000，均屬于實際無毒級；而0.01%甲基異噻唑啉酮、0.3%三氯生和0.5%對氯間二甲苯酚（PCMX）均屬于低毒。

3. 結(jié)論與探討

由于大多數(shù)化學防腐抑菌劑都具有一定的腐蝕刺激性和毒性，所以相關(guān)法規(guī)對這些成分在日用產(chǎn)品中使用有限量要求。例如，甲基異噻唑啉酮、三氯生和對氯間二甲苯酚（PCMX）等防腐抑菌劑在《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中規(guī)定使用的上限值分別為0.01%、0.3%和0.5%。

表4 含中藥提取物洗滌劑的抑菌穩(wěn)定性試驗結(jié)果

表5 中藥提取物和化學除菌劑的刺激性對比

表6 毒性試驗數(shù)據(jù)

通過實驗對比，采用黃芩、甘草、苦參、白鮮皮和當歸等中藥抑菌成分，可以實現(xiàn)與使用化學防腐/抑菌劑（不超過規(guī)定使用劑量）同樣的抑菌效果，甚至效果會更好。這些中藥抑菌成分具有較強的抑菌效果，而且無毒、無刺激，因而適合替代化學防腐抑菌劑，用于開發(fā)家用除菌洗護產(chǎn)品，更有益于人體健康。同時，中藥作為抑菌成分的應(yīng)用，也順應(yīng)了日化產(chǎn)品追求“無添加、更安全”的發(fā)展趨勢，將會受到越來越多的關(guān)注。

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