（1西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲(chóng)研究所，重慶400715；2開(kāi)封市農(nóng)林科學(xué)研究院，河南開(kāi)封475004；3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京100193）

溫度對(duì)白僵菌加拿大1號(hào)菌株侵染煙粉虱的影響

劉 召1張先亮2雷仲仁3*

（1西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲(chóng)研究所，重慶400715；2開(kāi)封市農(nóng)林科學(xué)研究院，河南開(kāi)封475004；3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京100193）

為明確溫度對(duì)白僵菌侵染煙粉虱的影響，在5個(gè)溫度（19、22、25、28、31 ℃）條件下觀察研究白僵菌加拿大1號(hào)菌株的孢子萌發(fā)率、菌絲生長(zhǎng)速度、胞外蛋白酶及幾丁質(zhì)酶活性的變化情況。結(jié)果表明：28 ℃時(shí)，加拿大1號(hào)菌株的上述參數(shù)值均最大，對(duì)煙粉虱的致病力最高；溫度過(guò)低或過(guò)高，孢子萌發(fā)率、菌絲生長(zhǎng)速率、胞外蛋白酶及幾丁質(zhì)酶活性均顯著降低，對(duì)煙粉虱的致病力也顯著減弱。

溫度；白僵菌；加拿大1號(hào)；煙粉虱

煙粉虱〔Bemisia tabaci（Gennadius）〕屬同翅目粉虱科，是花卉和溫室蔬菜的重要害蟲(chóng)，在我國(guó)多省份均有分布，且危害日益嚴(yán)重。在生產(chǎn)實(shí)踐中，其蟲(chóng)口密度的控制在很大程度上依賴化學(xué)殺蟲(chóng)劑。但由于煙粉虱世代周期短，繁殖力強(qiáng)，且若蟲(chóng)體表密布蠟質(zhì)，對(duì)有機(jī)磷、擬除蟲(chóng)菊酯和氨基甲酸酯等常規(guī)殺蟲(chóng)劑均產(chǎn)生了高水平抗性，對(duì)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和煙堿類殺蟲(chóng)劑也產(chǎn)生了抗性（何玉仙和黃建，2005）。因此，發(fā)展包括利用白僵菌等生物防治手段在內(nèi)的多種防控策略，實(shí)現(xiàn)煙粉虱種群的有效控制已經(jīng)成為目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一個(gè)亟需解決的問(wèn)題。

已有的研究表明，包括白僵菌在內(nèi)的多種蟲(chóng)生真菌是控制煙粉虱的重要生物防治手段之一（Wraight et al.，1998；Poprawski et al.，2000；Faria & Wraight，2001；Charnley，2003），但由于受環(huán)境條件影響大，殺蟲(chóng)效果不穩(wěn)定，在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用及推廣存在著很大限制。本研究從環(huán)境因子中的溫度著手，明確溫度對(duì)白僵菌加拿大1號(hào)菌株毒力的影響，為其在溫室等保護(hù)地的煙粉虱治理應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源及菌株

煙粉虱采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所溫室，在（25±1）℃、L∶D＝14 h∶10 h條件下用四葉一心的甘藍(lán)苗飼養(yǎng)。白僵菌加拿大1號(hào)（加1）菌株為加拿大同行友情贈(zèng)送，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用薩氏培養(yǎng)基培養(yǎng)，前7 d完全黑暗、25 ℃培養(yǎng)，后7 d完全光照、22 ℃培養(yǎng)，獲得的分生孢子粉用0.1%吐溫-80溶液配制成1×108個(gè)·mL-1的孢子懸浮液。

1.2 溫度對(duì)加拿大1號(hào)菌株毒力影響的測(cè)定

選取帶有30頭左右的2齡煙粉虱若蟲(chóng)的甘藍(lán)葉片，放入1×108個(gè)·mL-1的孢子懸浮液中浸泡30 s；以0.1%吐溫-80溶液處理為對(duì)照。室溫下風(fēng)干，放入盛有瓊脂∶蒸餾水＝1.5 m∶100 V的培養(yǎng)皿中，用封口膜封口保濕，隨后分別放入19、22、25、28、31 ℃的光照培養(yǎng)箱中，每處理重復(fù)6次。隨后8 d中，每12 h觀察1次若蟲(chóng)存活及感染情況，并將感染若蟲(chóng)保濕處理，待長(zhǎng)出菌絲后鏡檢以確定其是否為白僵菌侵染。

1.3 溫度對(duì)加拿大1號(hào)菌株菌落生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)影響的測(cè)定

將直徑為9 cm的培養(yǎng)皿滅菌后，倒入15 mL的薩氏培養(yǎng)基冷卻，取50 μL 1×108個(gè)·mL-1的加1孢子懸浮液點(diǎn)于培養(yǎng)基中央，分別置于19、22、25、28、31 ℃的光照培養(yǎng)箱中，光照周期設(shè)定為L(zhǎng)∶D＝14 h∶10 h。每天定時(shí)測(cè)定菌落直徑以此判定菌絲生長(zhǎng)速率，并記錄初始產(chǎn)孢時(shí)間。以0.1%吐溫-80溶液處理為對(duì)照，每處理重復(fù)6次。

取滅菌后的蓋玻片，四周涂上凡士林，中央滴上30 μL營(yíng)養(yǎng)液（水1 L、葡萄糖1 g、蛋白胨1 g、吐溫-80 1 mL），再滴上10 μL的1×108個(gè)·mL-1的孢子懸浮液。蓋上蓋玻片，制成萌發(fā)微環(huán)境，并將其放入盛無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中保濕，分別在19、22、25、28、31 ℃條件下培養(yǎng)，測(cè)定孢子萌發(fā)率（張立欽 等，2000）。

1.4 溫度對(duì)加拿大1號(hào)菌株表皮降解酶產(chǎn)量影響的測(cè)定

胞外蛋白酶產(chǎn)量水平測(cè)定：參照Bidochka和Khachatourians（1990）的方法，用明膠瓊脂平板法測(cè)定產(chǎn)酶量。其中，明膠含量1%（m/V）、瓊脂1.5%（m/V）。取50 μL 1×108個(gè)·mL-1的孢子懸浮液點(diǎn)于平板上，分別在19、22、25、28、31 ℃條件下培養(yǎng)8 d后，用15%（m/V）HgCl2溶液（溶于2 moL·L-1的HCl中）處理平板，菌落周圍即可顯示透明環(huán)，以透明環(huán)直徑與菌落直徑的比值表示蛋白酶的產(chǎn)量。以0.1%吐溫-80溶液處理為對(duì)照，每處理每次測(cè)6個(gè)菌落，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量水平測(cè)定：用平板法測(cè)定幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量水平（張宇 等 2010），并做適當(dāng)改動(dòng)。培養(yǎng)基配方為：葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、KCl、MgSO4·7H2O各0.5%（m/V），F(xiàn)eSO4·2H2O、ZnSO4·7H2O各0.01%（m/V），脫殼幾丁質(zhì)1%（m/ V），瓊脂1.5%（m/V）。取50 μL的1×108個(gè)·mL-1孢子懸浮液點(diǎn)于培養(yǎng)皿中，分別在19、22、25、28、31 ℃條件下培養(yǎng)8 d后測(cè)量菌落直徑與透明環(huán)直徑，根據(jù)透明環(huán)直徑與菌落直徑的比值計(jì)算幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量。以0.1%吐溫-80溶液處理為對(duì)照，每處理每次測(cè)量6個(gè)菌落，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算毒力回歸方程、半致死時(shí)間（LT50）及相關(guān)參數(shù)；采用SAS軟件對(duì)孢子的萌發(fā)率、菌絲生長(zhǎng)速率及胞外蛋白酶、幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量水平進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)加拿大1號(hào)菌株毒力的影響

在19～31 ℃范圍內(nèi)，加1菌株對(duì)煙粉虱2齡若蟲(chóng)均能進(jìn)行侵染，但煙粉虱的死亡率具有顯著性差異，且LT50也不同（表1）。28 ℃為白僵菌侵染煙粉虱的最適宜溫度，且此溫度條件下的LT50最短；其余依次為25、31、22 ℃；最不適宜侵染溫度為19 ℃，LT50最長(zhǎng)。在19～28 ℃范圍內(nèi)，加1菌株對(duì)煙粉虱的侵染能力隨溫度升高而增強(qiáng)，LT50隨溫度升高而變短；當(dāng)溫度高于28 ℃時(shí)，加1菌株對(duì)煙粉虱的致病力明顯下降，LT50變長(zhǎng)。說(shuō)明在一定范圍內(nèi)，溫度升高有助于白僵菌的入侵，但過(guò)高的溫度（＞28 ℃）則抑制白僵菌的入侵。

表1不同溫度條件下加拿大1號(hào)菌株對(duì)煙粉虱2齡若蟲(chóng)的毒力測(cè)定結(jié)果

2.2 溫度對(duì)加拿大1號(hào)菌株菌落生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響

在19～28 ℃范圍內(nèi)，菌落生長(zhǎng)速度隨溫度的升高逐漸增大；當(dāng)溫度高于28 ℃時(shí)，菌落生長(zhǎng)受到抑制（表2）。28 ℃時(shí)，培養(yǎng)8 d的加1菌株菌落直徑最大，為菌株最適生長(zhǎng)發(fā)育的溫度。當(dāng)溫度過(guò)高或者過(guò)低，加1菌株的生長(zhǎng)速率均受到抑制。

表2不同溫度條件下加拿大1號(hào)菌株孢子萌發(fā)及菌落生長(zhǎng)的測(cè)定結(jié)果

溫度對(duì)加1菌株孢子的萌發(fā)率也有顯著影響，其中28 ℃為孢子最適宜萌發(fā)的溫度（表2）。在萌發(fā)微室中培養(yǎng)12 h后，加1菌株孢子萌發(fā)率在19～28 ℃范圍內(nèi)隨溫度的升高而增大，28 ℃時(shí)達(dá)最大，為89.21%；當(dāng)溫度超過(guò)28 ℃時(shí)，孢子萌發(fā)率則降低。

溫度對(duì)加1菌株初始產(chǎn)孢時(shí)間影響不大，除19 ℃時(shí)為5 d外其余均為6 d。

2.3 溫度對(duì)加拿大1號(hào)菌株表皮降解酶產(chǎn)量的影響

加1菌株在不同溫度條件下的胞外蛋白酶產(chǎn)生水平具有顯著性差異（表3）。由胞外蛋白酶分解明膠所產(chǎn)生的透明環(huán)直徑與菌落直徑的比值可知，28 ℃時(shí)胞外蛋白酶產(chǎn)量最大；在19～28 ℃的溫度范圍內(nèi)，胞外蛋白酶的產(chǎn)量隨溫度的升高逐漸增大，而在31 ℃時(shí)的產(chǎn)量又降低，說(shuō)明過(guò)高的溫度對(duì)胞外蛋白酶的產(chǎn)量有明顯的抑制作用。

幾丁質(zhì)酶在不同溫度條件下的產(chǎn)量同樣具有顯著性差異（表3），白僵菌加1菌液接種到平板上第2天開(kāi)始能觀測(cè)到菌斑周圍出現(xiàn)透明圓環(huán)，說(shuō)明已經(jīng)開(kāi)始產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。在19～28 ℃的溫度范圍內(nèi)，隨溫度增加，酶的產(chǎn)量逐漸增加，但當(dāng)溫度高于31 ℃時(shí)產(chǎn)量又降低。在所測(cè)定的溫度下，幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量呈現(xiàn)顯著性差異，說(shuō)明28 ℃條件下，幾丁質(zhì)酶分泌活動(dòng)最旺盛，是最適合幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生的溫度。

表3不同溫度條件下加拿大1號(hào)菌株胞外蛋白酶及幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

溫度是影響白僵菌對(duì)煙粉虱致病力高低的重要因素（Walstad et al.，1970）。本試驗(yàn)首先明確了不同溫度條件下白僵菌加拿大1號(hào)菌株對(duì)煙粉虱毒力的影響。在適溫條件下，加1孢子的萌發(fā)率較高，對(duì)煙粉虱具有較高的致病力；當(dāng)溫度過(guò)高或者過(guò)低時(shí)，白僵菌孢子的萌發(fā)率顯著降低，對(duì)煙粉虱的致病力也顯著降低。這種現(xiàn)象在白僵菌侵染棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）、葉螨（Tetranychus evansi）、綠盲蝽（Apolygus lucorum）的研究中也有報(bào)道（Clark et al.，1968；Doberski，1981；孫魯娟 等，2001；Bugeme et al.，2008；Liu & Stansly，2009；仝亞娟 等，2010），說(shuō)明溫度通過(guò)控制白僵菌孢子的萌發(fā)率從而成為影響白僵菌侵染煙粉虱的關(guān)鍵因子，適宜的溫度是白僵菌侵染煙粉虱的必要條件之一。

胞外蛋白酶、幾丁質(zhì)酶在蟲(chóng)生真菌入侵過(guò)程中起著打破寄主昆蟲(chóng)體壁防御的作用（Leger et al.，1987；Gupta et al.，1992；Leger，1995；Li et al.，2012），有研究表明胞外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量水平可作為判斷蟲(chóng)生真菌的毒力高低的指標(biāo)（Bidochka & Khachatourians，1990）。為進(jìn)一步明確溫度對(duì)白僵菌毒力的影響，本試驗(yàn)比較了不同溫度條件下白僵菌加拿大1號(hào)菌株的胞外蛋白酶、幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的變化情況，發(fā)現(xiàn)胞外蛋白酶與幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量能顯著影響加1菌株對(duì)煙粉虱的毒力。溫度能影響白僵菌的菌落生長(zhǎng)速度，進(jìn)而影響各種酶產(chǎn)量的高低；同時(shí)溫度能影響酶活力高低，從而影響白僵菌對(duì)寄主昆蟲(chóng)的致病力。綜合溫度對(duì)白僵菌加拿大1號(hào)菌株毒力的影響研究發(fā)現(xiàn)，在施用白僵菌相關(guān)制劑時(shí)，應(yīng)在適宜的溫度條件下（尤其是在溫室及保護(hù)地等溫、濕度較易調(diào)控的條件下），從而在最大程度上發(fā)揮其毒力，實(shí)現(xiàn)其對(duì)煙粉虱的生物防治。

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Impact of Temperature on Virulence of Beauveria bassiana Canada No.1 Isolate to Bemisia tabaci（Gennadius）

LIU Zhao1，ZHANG Xian-liang2，LEI Zhong-ren3*

（1Institute of Entomology，College of Plant Protection，Southwest University，Chongqing 400715，China；2Kaifeng Research Academy of Agriculture and Forestry，Kaifeng 475004，Henan，China；3Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

To identify the effects of temperature on the infection of Beauveria bassiana Cananda No.1 isolate against the tobacco whitefly， Bemisia tabaci（Gennadius），the spore germination rate，mycelial growth speed，changes in activities of extracellular proteinase and chitinase were observed and studied under 5 different temperature conditions（19，22，25，28，31℃）. The results showed that the isolate Cananda No.1 owned the maximum parameter values and the highest virulence against B. tabaci at temperature of 28 ℃. The spore germination rate，mycelial growth speed，activities of extracellular proteinase and chitinase，and virulence against B. Tabaci were significantly reduced when the temperature was higher or lower than 28 ℃.

Temperature; Beauveria bassiana; Canada No.1；Bemisia tabaci

劉召，男，講師，主要從事害蟲(chóng)綜合治理及化學(xué)生態(tài)學(xué)方面的研究，E-mail：liuzhao@swu.edu.cn

*通訊作者（Corresponding author）：雷仲仁，男，研究員，主要從事蔬菜害蟲(chóng)的綜合防治利用方面的研究，E-mail：leizhr@sina.com

2013-11-22；接受日期：2014-01-26

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303019），國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技城產(chǎn)業(yè)培育項(xiàng)目（Z121100001212006），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201515），中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2013M531929），中央高?；緲I(yè)務(wù)科研項(xiàng)目（XDJK2012C080）