李炎璐, 王清印, 陳 超, 宋振鑫, 吳雷明, 賈瑞錦, 王曉梅, 李文升

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071; 2. 上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院, 上海201306; 3. 萊州明波水產(chǎn)有限公司, 山東 煙臺 261418)

云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)受精過程的觀察

李炎璐1,2, 王清印1,2, 陳 超1,2, 宋振鑫1,2, 吳雷明1,2, 賈瑞錦1,2, 王曉梅3, 李文升3

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071; 2. 上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院, 上海201306; 3. 萊州明波水產(chǎn)有限公司, 山東 煙臺 261418)

為研究雜交過程中精卵的結(jié)合以及相關(guān)生物學特征, 作者利用掃描電鏡觀察了云紋石斑魚(Epinephelus moara)卵子形態(tài)結(jié)構(gòu)以及云紋石斑魚♀×七帶石斑魚(E. septemfasciatus)♂雜交時的精子入卵過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)雜交與親本自交的精子入卵過程沒有本質(zhì)的區(qū)別。云紋石斑魚卵表面布滿縱橫交錯、走向不確定的網(wǎng)紋, 在受精孔區(qū)可觀察到前庭、受精孔和微小孔。成熟的精卵相遇時相互激活, 產(chǎn)生一系列胞間反應(yīng)。受精后0～25 s, 可觀察到精子附著在卵子受精孔周圍; 受精30～45 s, 已有精子進入卵子, 并且明顯可見精子尾部留在受精孔外; 精子入卵后, 受精孔內(nèi)有受精錐形成, 周圍可觀察到絮狀的受精塞, 將受精孔封閉; 授精90 s～3 min, 卵表面處于修復(fù)狀態(tài)。整個過程未發(fā)現(xiàn)有多精入卵的現(xiàn)象。

云紋石斑魚(Epinephelus moara)(♀); 七帶石斑魚(E. septemfasciatus)(♂); 雜交; 精子入卵; 掃描電鏡

國內(nèi)外有關(guān)利用掃描電鏡對魚類卵子結(jié)構(gòu)及其受精過程的形態(tài)學觀察已有不少報道[1-12]。主要研究內(nèi)容是對魚的卵子結(jié)構(gòu)、受精孔及其周圍的形狀、結(jié)構(gòu)的觀察以及精卵激活發(fā)生的一系列反應(yīng)、精子如何進入受精孔, 并對受精前后精卵的變化等過程進行了較為詳細的描述。

近年來, 在海水養(yǎng)殖過程中應(yīng)用人工雜交技術(shù)開展石斑魚種間雜交的研究已有不少報道, 但有關(guān)其精子入卵過程的研究還未見報道。云紋石斑魚(Epinephelus moara)和七帶石斑魚(E. septemfasciatus)同屬于鱸形目(Perciformes)、 科(Serranidae)、石斑魚亞科(Epinephelinae)、石斑魚屬(Epinephelus), 云紋石斑魚具有生長快、肉質(zhì)好、耐高溫、可在中國南方養(yǎng)殖的特性; 七帶石斑魚具有耐低溫特性, 是可在北方沿海開展養(yǎng)殖生產(chǎn)的優(yōu)良品種[13-17]。作者以云紋石斑魚(♀)和七帶石斑魚(♂)為材料進行雜交[18], 并利用掃描電鏡觀察了云紋石斑魚卵子形態(tài)結(jié)構(gòu)以及云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)的精子入卵過程, 分析了雜交過程中精卵的結(jié)合以及相關(guān)生物學特征, 為闡明石斑魚種間雜交的受精生物學過程提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 取材

試驗材料于2011 年6 月13日取自萊州明波水產(chǎn)有限公司, 挑選性腺成熟飽滿的 5～6齡云紋石斑魚親魚母本與 4～5齡七帶石斑魚親魚父本進行人工授精, 受精卵孵化溫度為21～22.5℃。

1.2 樣品的固定

精卵混合后每間隔 5 s 取樣1次, 至混合后 3 min,所取樣品用 5%的戊二醛固定, 次日, 更換一次固定液, 置于4℃冰箱保存。

取l mL已激活的七帶石斑魚精液, 用等體積的5%的戊二醛固定, 置于4℃冰箱保存。

1.3 樣品的制備

將固定的樣品用磷酸緩沖液沖洗, 經(jīng)酒精系列脫水, 加入乙酸異戊酯進行置換, 放入型號為Eiko.Model No.DX-1 的零界點干燥儀中干燥, 經(jīng)Eiko IB-3 型離子濺射儀噴金后, 于 JEOL JSM-840型掃描電鏡下觀察和拍照。精子掃描電鏡樣品的制備方法與受精卵相同。

2 結(jié)果

2.1 云紋石斑魚卵子的形態(tài)結(jié)構(gòu)

云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)雜交的成熟卵子呈圓球形, 無色透明, 浮性, 卵徑(862.7±31.2) μm。卵膜包被于卵子外層, 卵表面凹凸不平, 布滿縱橫交錯、走向不確定的網(wǎng)紋, 網(wǎng)紋較淺(圖 1-1)。在掃描電鏡下可觀察到卵膜表面有一個較小、較淺的凹陷區(qū)域, 為精孔區(qū), 呈漏斗狀; 在凹陷區(qū)域中央位置的是受精孔(Micropyle), 受精孔完全敞開(圖1-2, 圖1-3); 周圍有呈放射狀排列的微小孔(Micropore); 受精孔是穿過卵膜的管狀結(jié)構(gòu), 稱為精孔管, 管道上粗下細, 管壁呈環(huán)紋螺旋狀。

2.2 七帶石斑魚精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖1 云紋石斑魚卵子Fig.1 Mature egg of E.moara

七帶石斑魚精子(圖 2-1, 圖 2-2)由頭部和尾部兩部分組成。頭部無頂體, 呈橢球形, 頭部前端主要分布有高電子密度染色質(zhì)的球形細胞核, 細胞核由核膜包圍, 將其與細胞質(zhì)分開; 頭部后端是由質(zhì)膜包圍的延伸至后部袖套結(jié)構(gòu), 其中分布有線粒體、中心粒復(fù)合體和囊泡等。尾部(鞭毛)細長, 與頭部細胞核緊密連接, 主要結(jié)構(gòu)為軸絲, 軸絲與鞭毛間的質(zhì)膜空隙狹窄, 僅有少量細胞質(zhì)[19]。

2.3 精子入卵過程的觀察

精子與卵子接觸, 卵子本身發(fā)生一系列的變化。卵子的變化主要表現(xiàn)為受精膜舉起及皮層反應(yīng)。精子與卵子表面接觸后, 與卵子表面的受體相結(jié)合, 并激發(fā)卵黃膜舉起。卵黃膜舉起變成受精膜, 受精膜盡管沒有增厚, 但由軟變硬。皮層顆粒胞吐時, 沒有方向性。胞吐的介質(zhì)形成不規(guī)則棘狀突起。

從掃描電鏡的結(jié)果發(fā)現(xiàn), 精子入卵的過程大致可分為4個階段: 即卵膜對精子的吸引、精子對內(nèi)膜的錨定、精核的進入和受精孔封閉等。精子入卵的速度很快。授精后0～25 s, 可觀察到精子附著在卵子受精孔周圍(圖2-3); 授精30～45 s, 已有精子進入卵子, 明顯可見精子尾部留在受精孔外(圖 2-4); 精子入卵后, 授精50～60 s , 卵表面的微絨毛將精子的頭部包裹, 形成受精錐(圖 2-5), 可協(xié)助精子入卵, 周圍可觀察到呈絮狀的受精塞, 將受精孔封閉(圖2-6); 授精70～80 s, 受精孔周圍呈蜂窩狀, 并可看到大小不一的分泌物(圖2-7);授精 90 s～3 min, 卵表面處于修復(fù)狀態(tài), 逐漸變平坦(圖2-8)。整個過程未發(fā)現(xiàn)有多精入卵的現(xiàn)象。

3 討論與結(jié)論

3.1 異源精卵的相互識別與結(jié)合

精卵的相互識別與結(jié)合是受精過程發(fā)生的前提條件, 其實質(zhì)是性細胞表面的糖蛋白及其受體的相互作用。據(jù)報道, 在一些雙殼類如牡蠣(Conchaostreae)、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)和珍珠貝(Pinctada)等的遠緣雜交中, 受精一般沒有問題[20]。本實驗也可正常受精, 說明異源精卵能夠互相識別,其機理可能是異源精卵接觸后, 精卵表面的識別分子間啟動了一系列復(fù)雜的分子水平上的變化, 精子結(jié)合素與受體蛋白之間相互誘導, 造成蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化, 使結(jié)合素與受體緊密結(jié)合。異源精卵相互識別機制的深入研究, 將有助于對遠緣雜交的認識和更廣泛深入的利用。

從染色體組型方面來看, 云紋石斑魚與七帶石斑魚染色體數(shù)目均為2n= 48, 但在核型上存在一定差異。七帶石斑魚染色體的核型為 2n=48t, NF=48,屬于原始類群, 染色體均為單臂染色體[21]; 云紋石斑魚染色體的核型為2n= 2st + 46t(st, 亞端著絲粒染色體; t, 端著絲粒染色體), 染色體臂數(shù) NF = 50,屬于特化類群, 有1對特征性的雙臂染色體[22]。據(jù)有關(guān)報道, 魚類雜交育種中核型越相近雜交成功的可能性越大[23]。在本實驗中, 云紋石斑魚與七帶石斑魚雖屬不同類群, 但雜交依然成功, 說明云紋石斑魚與七帶石斑魚具有相近的親緣關(guān)系。

圖2 七帶石斑魚精子及精子入卵過程Fig.2 Sperm and initial stages of penetration of E. Septemfasciatus

3.2 云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)精子入卵過程的特點

云紋石斑魚卵殼膜表面布滿縱橫交錯、走向不確定的網(wǎng)紋結(jié)構(gòu), 并且均勻分布著微小孔, 微小孔內(nèi)未發(fā)現(xiàn)其他物質(zhì)。大量研究表明, 多數(shù)硬骨魚類的卵表面均有微孔分布[24], 但不同魚種的卵表面形態(tài)和結(jié)構(gòu)具有一定差異, 例如金魚(Carassius auratus)卵動物極殼膜表面有5～10條寬度不一的溝和脊, 并向卵膜孔匯集[7]; 鲃魚(Barbus conchonius)卵膜孔區(qū)也有7～10條溝和脊的特異結(jié)構(gòu), Amanze[25]指出精子一旦位于該區(qū), 其受精率就能提高到99.7%, 這種結(jié)構(gòu)可能與數(shù)學物理的動力因素有關(guān), 為精子集中于卵膜孔區(qū)提供了有利條件; 赤眼鱒(Squaliobarbus curriculus)卵表面平滑光潔, 除了均勻分布著微小孔外, 無明顯的溝或嵴[10]。

掃描電鏡觀察顯示, 云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)的受精過程中精子入卵是相當迅速的, 在授精30 s后已有精子開始進入, 授精 60 s 受精孔完全被堵塞, 因此, 在做人工授精時操作要迅速。云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)的受精與其他硬骨魚一樣, 精子是通過卵子獨有的一個卵膜孔入卵。有學者認為,卵膜孔區(qū)有一種小肽物質(zhì)能吸引精子進入[26]; Laale[27]認為精子是被卵膜孔釋放的一種物質(zhì)吸引入卵的。整個受精過程未發(fā)現(xiàn)有多精入卵的現(xiàn)象。據(jù)報道其原因是精孔管內(nèi)孔直徑比精子頭部直徑略大,只能允許一個精子進入, 這一特點保證了單精受精,第一個精子入卵后精孔管內(nèi)立刻形成有一團絮狀物質(zhì), 能堵塞受精孔, 阻止其他精子的進入[1,8,28-37],是保證單精入卵的有力屏障。受精錐是在精子入卵處形成的形狀不同的細胞質(zhì)突起, 并不是所有魚類的受精過程都會出現(xiàn)受精錐。吳瑩瑩[35]等發(fā)現(xiàn)大菱鲆(Psetta maxima)的精子入卵時會形成受精錐; Kudo[2]發(fā)現(xiàn)鯉魚(Cyprinus carpio)在精子入卵時有受精錐的形成; 張?zhí)焓a等[7]在鳙魚(Hypophthalmichthysnobilis)精卵結(jié)合過程未觀察到明顯的受精錐; 孫際佳[10]等觀察赤眼鱒精卵結(jié)合過程的觀察中也未發(fā)現(xiàn)有明顯的受精錐形成。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Observation of the fertilization process of F1byEpinephelus moara(♀)×E. septemfasciatus(♂)

LI Yan-lu1,2, WANG Qing-yin1,2, CHEN Chao1,2, SONG Zhen-xin1,2, WU Lei-ming1,2, JIA Rui-jin1,2, WANG Xiao-mei3, LI Wen-sheng3
(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2. College of Fisheries and Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Laizhou Mingbo Fisheries Limited Company, Yantai 261418, China)

Jan., 24, 2013

Epinephelus moara(♀);E.septemfasciatus(♂); crossbreeding; sperm penetration; scanning electron microscopy

To study the sperm penetration during hybrid process and the biological characteristics, the morphology of mature egg ofEpinephelus moaraand the fertilization process of F1byE.moara(♀)×E.septemfasciatus(♂) were observed by using scanning electron microscopy. The results showed that there were no significant differences in the process of fertilization between crossbreeding and inbreeding of these two species.Some reticulate structures with Criss-cross and uncertain towards were found on the outer chorionic surface ofE.moara.Vestibule, micropyle and micropore can be observed in the micropyle area. When the mature eggs and sperms encountered, they activated mutually and caused a series of responses. During 0～25 seconds post insemination, sperm attaching to the micropyle of mature egg was observed; during 30～45 seconds post insemination, the spermatozoon entering into the egg and the flagellum from the outside of micropyle were observed; The fertilization cone was formed in micropyle after the spermatozoon entered into the egg, and the fertilization plug was observed around the fertilization cone, and close to the micropyle. During 90 seconds～3 minutes post insemination, the egg surface began to repair. The polyspermy was not observed during the crossbreeding insemination.

S917.4

A

1000-3096(2014)04-0039-05

10.11759/hykx20130124001

2013-01-24;

2013-07-16

科技部國際合作項目(2012DFA30360); 國家科技支撐項目(2011BAD13B01)

李炎璐(1986-), 女, 山東菏澤人, 碩士研究生, 主要從事動物遺傳育種與繁殖研究, 電話: 0532- 85844459, E-mail: ysfriliyanlu @126.com; 陳超, 通信作者, 電話: 0532- 85844459, E-mail: ysfrichenchao@126.com