劉 超, 趙 培, 梁 艷, 高 強(qiáng), 劉升平 黃 倢

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院, 山東 青島 266000; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071)

中國明對蝦精氨酸激酶與白斑綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白 VP31的作用初探

劉 超1,2, 趙 培2, 梁 艷2, 高 強(qiáng)2, 劉升平1, 黃 倢2

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院, 山東 青島 266000; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071)

白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)是危害對蝦的主要病原, 給全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失。為研究阻斷WSSV的途徑, 前期研究WSSV與宿主相結(jié)合的受體蛋白發(fā)現(xiàn), 白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP31可以與中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)精氨酸激酶(FcAK)發(fā)生結(jié)合作用。精氨酸激酶(AK)通過調(diào)節(jié)無脊椎動物體內(nèi)磷酸精氨酸與三磷酸腺苷(ATP)之間平衡在能量代謝、儲存和利用方面具有重要作用。作者通過重組表達(dá)的rFcAK與rVP31的far-Western blotting分析, 證實(shí)兩者有結(jié)合作用, 此外, rFcAK還與WSSV的VP19、VP28等6種結(jié)構(gòu)蛋白有結(jié)合作用。雙向電泳分析觀察到, rFcAK與rVP31的磷酸化反應(yīng)后, rVP31部分發(fā)生pI降低現(xiàn)象, 提示rVP31可能發(fā)生了磷酸化。生物信息學(xué)分析表明VP31存在21個精氨酸殘基, FcAK具有12個精氨酸結(jié)合位點(diǎn), 這可能為VP31和FcAK的結(jié)合活性提供了靶位。為進(jìn)一步研究WSSV與宿主結(jié)合機(jī)理及阻斷感染的機(jī)制提供思路。

精氨酸激酶(AK); 白斑綜合征病毒(WSSV); 中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis); 結(jié)合

對蝦白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)是導(dǎo)致1992年以來對蝦爆發(fā)性死亡的主要病原, 至今仍給中國對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失[1-6]。通過尋找 WSSV與宿主相結(jié)合的受體蛋白, 可以研究阻斷WSSV的途徑[7-8]。

精氨酸激酶(AK)是一種主要存在于無脊椎動物體內(nèi)的磷酸原激酶, 可以催化三磷酸腺苷(ATP)與精氨酸之間磷酸基團(tuán)的可逆性交換, 生成二磷酸腺苷(ADP)和磷酸精氨酸, 在調(diào)節(jié)無脊椎動物體內(nèi)磷酸精氨酸與ATP之間的能量平衡、代謝、儲存和利用具有重要作用[9-11]。目前對 AK的研究主要集中在進(jìn)化[12-13]、結(jié)構(gòu)研究[14]、活性[15-23]、結(jié)合位點(diǎn)[24]及調(diào)節(jié)[25]等方面。AK 在與機(jī)體病原識別和免疫反應(yīng)[26-31]等多種重要生理過程中所起的作用也日益引起重視。

本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中重組表達(dá)了WSSV VP31蛋白, 通過Pull-down找到與VP31有相互作用的中國明對蝦的 AK蛋白(FcAK), 用 ELISA驗(yàn)證了WSSV VP31與FcAK的結(jié)合活性(另文報道)。在此基礎(chǔ)上, 作者探索了FcAK與WSSV囊膜蛋白VP31的作用方式, 為揭示 WSSV感染宿主機(jī)理的深入研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒和表達(dá)菌株

純化WSSV由本實(shí)驗(yàn)室制備, 濃度為4.8×105個/μL,保存于-80℃。WSSVvp31和中國明對蝦 AK基因(Fcak)的表達(dá)載體pET30a-vp31和pET30a-fcak的E. coliBL21菌株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建(另文報道), 該表達(dá)載體帶有卡那霉素抗性基因, 所表達(dá)的目的蛋白帶有6×His標(biāo)簽。

1.2 rVP31和rFcAK的分別表達(dá)及產(chǎn)物純化

分別取-80℃保存的含pET30a-vp31和pET30afcak的E. coliBL21菌株, 按1∶1000的體積比接種于200 mL LB液體培養(yǎng)基(含30 μg/mL卡那霉素)中, 37℃振蕩過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長期。加入 IPTG 至0.4 mmol/L, 37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h。分別將菌液以10 000×g離心5 min。收集離心沉淀, 加入20 mL裂解液(10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, 10 mmol/L CaCl2)重懸, 200W超聲破碎300次(每次超聲1 s間隔2 s), 10 000×g離心5 min, 收集包涵體沉淀, 用足量A液(9.5 mmol/L NaH2PO4, 40.6 mmol/L Na2HPO4, 6 mol/L鹽酸胍, 0.3 mol/L NaCl, pH7.0)充分溶解2 h, 經(jīng)0.45 μm濾膜過濾, 添加到5 mL Co2+親和層析柱, 用A液過柱清洗非特異性結(jié)合蛋白, 再用 C液(4.3 mmol/L NaH2PO4, 18.2 mmol/L Na2HPO4, 5.4 mol/L 鹽酸胍, 0.27 mol/L NaCl, 0.15 mol/L 咪唑, pH7.0)洗脫目標(biāo)蛋白并收集。

1.3 rVP31和rFcAK的復(fù)性

洗脫的rVP31和rFcAK溶液各40 mL分別裝入2只透析袋, 置于2 L尿素透析復(fù)性緩沖液(50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 10%甘油, 1%甘氨酸, 50 mmol/L Tris-HCl, 6 mol/L尿素, pH8.0)在4℃透析10 h, 依次換入尿素濃度為4、2 和0 mol/L的透析復(fù)性緩沖液中各10 h, 用離心超濾管(Ultra-15, Millipore)各濃縮蛋白至4 mL, 5000×g, 4℃離心30 min。

1.4 rFcAK的地高辛(DIG)標(biāo)記

取地高辛蛋白標(biāo)記物(Roche)按 20 μg/μL溶于DMSO, 將50 μL上述溶液加入100 μL 360 μg/mL的rFcAK蛋白中, 室溫孵育2 h, 然后在PBS中透析過夜至無多余 DIG蛋白標(biāo)記物, 所得地高辛標(biāo)記的rFcAK(DIG-rFcAK)經(jīng)Bradford測定蛋白濃度, 保存于-75℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 rFcAK與rVP31及WSSV的far-Western檢測

rVP31和WSSV分別經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜, 再將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜放入1% BSA封閉液(用 PBST配制)內(nèi) 4℃過夜封閉。用 1× PBST (PBS含0.05% Tween-20)室溫漂洗10 min。將PVDF膜置于5 mL 180 μg/mL DIG-rFcAK 37℃, 孵育2 h。1×PBST漂洗3次, 每次10 min后, 將印跡膜放入1∶10000稀釋的堿性磷酸酶(AP)偶聯(lián)抗 DIG抗體(Anti-DIG-AP)(Roche)中, 37℃孵育1.5 h。1× PBST漂洗3次, 每次10 min后, 將PVDF膜放入顯色盒中,加入NBT/BCIP顯色液(Sigma)反應(yīng)約1～5 min。最后將PVDF膜轉(zhuǎn)入凝膠成像儀中拍照。

1.6 體外磷酸化反應(yīng)中rFcAK對rVP31的作用

按 Duan[32]和劉斌[33]的方法, 略作改動, 將 rFcAK(360 μg/mL)和rVP31(360 μg/mL)各1 mL分別置于透析袋放入激酶緩沖液(50 mmol/L HEPES, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L NaF, 1 mmol/L Na3VO4, 1 mmol/L DTT, 10 mmol/L MnCl2, 1% Tween 20, 0.2% NP-40, pH7.5)中進(jìn)行透析。混合rVP31和rFcAK, 然后加入ATP (100 mmol/L, pH7.5)母液至2.5 mmol/L, 30℃振蕩孵育20 min進(jìn)行體外磷酸化反應(yīng)。

1.7 雙向電泳

用 2D Clean-up 試劑盒(GE)處理體外磷酸化反應(yīng)前后的rVP31樣本。選擇18 cm的IPG膠條(pH3-10, GE), 上樣蛋白各120 μg/350 μL, 進(jìn)行第一向等電聚焦(Ettan IPGphor, GE), 運(yùn)行參數(shù)為: 30V 10～12 h水化, 梯度升高電壓500 V 3 h, 1 000V 3 h, 2 000V 1 h, 5 000V 3 h, 8 000 V 3 h, 8 000 V Step-n-hold 32000 V·h, 20℃。聚焦完成的 IPG膠條用平衡緩沖液 I (50 mmol/L Tris-HCl, 6 mol/L 尿素, 30%甘油, 2% SDS, 0.002% 溴酚藍(lán), 1% DTT, pH8.8), 平衡緩沖液II(50 mmol/L Tris-HCl, 6 mol/L尿素, 30%甘油, 2% SDS, 0.002%溴酚藍(lán), 2.5%碘乙酰胺, pH8.8)各平衡15 min。

將平衡后的 IPG膠條轉(zhuǎn)移至制備好的 12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠頂面, IPG膠條與 SDS-聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液。按 1W 恒功率垂直電泳使樣品濃縮進(jìn)膠后, 再用16W恒功率進(jìn)行第二向垂直電泳(Ettan DALTsix, GE), 溫度控制在10～15℃。

1.8 凝膠染色與掃描分析

將2D凝膠置于固定液(40% 甲醇, 10% 乙酸)30 min,不停搖動。倒掉固定液, 用去離子水清洗4遍, 每次搖動 15 min。將去離子水倒掉, 加入染色液(0.12%考馬斯亮藍(lán)G250, 10% (NH4)2SO4, 10% H3PO4, 20%甲醇)振蕩染色過夜。倒掉染色液, 用去離子水清洗凝膠數(shù)遍, 或振蕩至背景比較低為止。對膠體進(jìn)行掃描(ImageScanner掃描儀)。

1.9 VP31和FcAK氨基酸序列的生物信息學(xué)分析

對VP31和FcAK (GenBank: AAV83993)的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用Expasy中的工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/) 分 析VP31和FcAK蛋白的pI和氨基酸含量; 利用在線分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)程序 Tmpred(http://www.ch.embnet. org/software/TMPRED_form.html)檢測VP31和FcAK蛋白潛在跨膜區(qū); 利用在線工具 SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對 VP31和 FcAK 蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測; 利用 NCBI/ BLAST(http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi) 對VP31和FcAK蛋白進(jìn)行蛋白序列同源性分析; 利用在 線 工 具 TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)對VP31和FcAK蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測; 通過工具 PSORT (http://psort.nibb.ac.jp/form2.html)預(yù)測 FcAK蛋白的亞細(xì)胞定位; 使用在線工 具 NLStradamus (http://www.moseslab.csb. utoronto.ca/NLStradamus/)對 FcAK蛋白進(jìn)行核定位信號(NLS)預(yù)測; 利用 kinasephos2(http://kinasephos2. mbc.nctu.edu.tw/)對VP31蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析。

2 結(jié)果

2.1 rVP31和rFcAK的原核表達(dá)和純化

含pET30a-vp31和pET30a-fcak的E. coliBL21菌株經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物用 Co2+親和層析柱純化和復(fù)性后, SDS-PAGE顯示(圖1), 相應(yīng)泳道分別在35和 45kD大小處有單一蛋白條帶, 表明 rVP31和rFcAK得到成功表達(dá)和有效純化。

圖1 純化的rVP31和rFcAK的SDS-PAGEFig. 1 SDS-PAGE of purified rVP31 and rFcAK

2.2 rVP31和 rFcAK結(jié)合的 far-Western blotting驗(yàn)證

將表達(dá)純化的rVP31進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜, 與 DIG-rFcAK進(jìn)行 far-Western blotting,結(jié)果顯示, 在約35KD左右出現(xiàn)了顯色條帶, 條帶位置與表達(dá)純化的rVP31相同, 證明rFcAK與rVP31有結(jié)合反應(yīng)。

圖2 rVP31與DIG-rFcAK的Far-Western blottingFig. 2 Far-Western blotting of rVP31 and DIG-rFcAK

2.3 rFcAK與WSSV結(jié)構(gòu)蛋白的far-Western blotting分析

將純化的WSSV進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜, 與DIG-rFcAK進(jìn)行far-Western blotting。經(jīng)顯色后, 在VP31條帶大小約31.4kD處[34]有條帶顯色(圖3)。Far-Western顯示W(wǎng)SSV結(jié)構(gòu)蛋白中還有一些蛋白帶與 rFcAK結(jié)合后呈現(xiàn)顯色反應(yīng),使用 Gel-Pro Analyzer 計算分子量, 這些顯色帶的分子量分別為90、74、47、36、27、20.7 kD, 表明FcAK可能還與WSSV的其他結(jié)構(gòu)蛋白能發(fā)生結(jié)合作用。

圖3 WSSV與DIG-rFcAK的Far-Western blotting分析Fig. 3 Far-Western blotting of WSSV and DIG-rFcAK

2.4 雙向電泳檢測rFcAK對rVP31的體外磷酸化作用

FcAK與VP31的結(jié)合如果能導(dǎo)致VP31的精氨酸殘基的磷酸化反應(yīng), 將使VP31帶有一個到多個磷酸基團(tuán), 等電點(diǎn)降低, 通過雙向電泳就能區(qū)分出磷酸化的VP31(圖4)。將rFcAK和rVP31分別放入激酶緩沖液中透析后, 加入ATP, 進(jìn)行體外磷酸化反應(yīng),用雙向電泳檢測, 結(jié)果顯示, 純化的rVP31和rFcAK的等電點(diǎn)pI分別為6.51±0.20和6.52±0.15; 經(jīng)磷酸化反應(yīng)后, 在與rVP31蛋白基本相同分子量的低pH側(cè)出現(xiàn) 1個較淡的新的蛋白點(diǎn)(pI=5.4), 新蛋白點(diǎn)的強(qiáng)度為原始位置蛋白點(diǎn)強(qiáng)度的 8.6%, 符合磷酸化蛋白質(zhì)的雙向電泳變化規(guī)律, 表明約8%的rVP31可能發(fā)生了磷酸化反應(yīng)。

圖4 rVP31和rFcAK體外磷酸化的雙向電泳檢測結(jié)果Fig. 4 Two-dimensional electrophoresis results after in vitro phosphorylation of rVP31 and rFcAK

2.5 VP31和FcAK氨基酸序列的生物信息學(xué)分析

經(jīng)在線生物信息學(xué)工具的分析表明, VP31含261aa, 理論分子量為 29.8kD, 理論等電點(diǎn)為 6.68,含21個精氨酸殘基(8.0%), 該蛋白含有共36個潛在磷酸化位點(diǎn), 不含有跨膜結(jié)構(gòu)域和明顯的線粒體和胞外分泌導(dǎo)肽。FcAK含356aa, 理論分子量40.1kD,理論等電點(diǎn)為5.87, 含有15個ADP結(jié)合位點(diǎn), 12個精氨酸結(jié)合位點(diǎn), 以及22個位于近C端的底物特異性環(huán)形結(jié)構(gòu), 在 267～283位有一個從外向內(nèi)的跨膜螺旋, N端位于膜外, 不含明顯的線粒體和胞外分泌導(dǎo)肽, 不包含明顯的核定位信號, 其亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)中的可能性為 65.2%, 在線粒體中可能性為21.7%, 在液泡中的可能性為4.3%, 在囊泡中的可能性4.3%, 在細(xì)胞核中的可能性為4.3%。

3 討論

激酶是催化ATP上的5′-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到特定靶分子上的酶。精氨酸激酶主要存在于無脊椎動物體內(nèi), 它不僅具有調(diào)節(jié)能量平衡等的重要作用, 還可能參與病原識別與免疫反應(yīng)。

Astrofsky等[35]用 RNA差異顯示技術(shù)對健康和感染W(wǎng)SSV的細(xì)角濱對蝦(Litopenaeus stylirostris)進(jìn)行比較, 發(fā)現(xiàn) WSSV感染后精氨酸激酶上調(diào)。而Wang等[36]利用基因芯片技術(shù)對感染W(wǎng)SSV后6 h和自然感染 WSSV垂死的中國明對蝦分析, 顯示精氨酸激酶基因在感染W(wǎng)SSV后下調(diào)。Zeng等[37]利用抑制消減雜交技術(shù)和基因芯片檢測感染W(wǎng)SSV的克氏原螯蝦的上調(diào)基因中有精氨酸激酶。這說明 AK基因的表達(dá)的確受WSSV感染的影響, 可能在WSSV感染過程中發(fā)揮作用, 但具體是上調(diào)或下調(diào)可能取決于病毒感染的進(jìn)程。

VP31為WSSV囊膜蛋白[34,38], 帶有與細(xì)胞相互作用的RGD位點(diǎn), 含有8%的精氨酸, 具有36個潛在磷酸化位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究采用原核表達(dá)的rVP31對中國明對蝦細(xì)胞的蛋白質(zhì)進(jìn)行 far-Western blotting發(fā)現(xiàn)FcAK是VP31的一種潛在結(jié)合蛋白(另文報道)。作者采用原核表達(dá)的rFcAK對原核表達(dá)的rVP31進(jìn)行far-Western blotting證實(shí)了這種結(jié)合作用的存在, 進(jìn)而通過 rFcAK與 WSSV結(jié)構(gòu)蛋白的far-Western blotting發(fā)現(xiàn), 除了VP31以外, rFcAK還可能與WSSV VP19、VP28、VP26以及其他3種蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的結(jié)合反應(yīng), 表明WSSV與FcAK之間可能具有多方面的重要作用。

作者嘗試采用磷酸化反應(yīng)和雙向電泳對 rFcAK與 rVP31的相互作用進(jìn)行檢測, 觀察到磷酸化反應(yīng)后 rVP31可能存在磷酸化的形式, 生物信息學(xué)分析表明, VP31含21個精氨酸殘基, 而FcAK有12個精氨酸結(jié)合位點(diǎn), 這可能為VP31和FcAK的結(jié)合的提供了靶位, 并可能引起VP31的磷酸化。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Preliminary study on the conjunction between arginine kinase ofFenneropenaeus chinensisand the structure proteins of white spot syndrome virus (WSSV)

LIU Chao1,2, ZHAO Pei2, LIANG Yan2, GAO Qiang2, LIU Sheng-ping1, HUANG Jie2
(1. Animal Science College, Qingdao Agriculture University, Qingdao 266000, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)

Jul., 2, 2012

Arginine kinase (AK); WSSV;Fenneropenaeus chinensis; binding activity

White spot syndrome virus (WSSV) is a major shrimp pathogen causing big economic losses all over the world. Inorder ro explore ways to block WSSV infection, we worked on WSSV-binding host receptor proteins, , and we found that envelope protein VP31 of WSSV was able to engage with arginine kinase ofFenneropenaeus chinensis(FcAK). Arginine kinase (AK) plays important roles in the metabolism, storage and utilization of energy by regulation of the balance between phosphorylation of arginine and ATP in invertebrate. The present study proves the binding between the recombinant FcAK (rFcAK) and VP31 (rVP31) using far-Western blotting. Furthermore, the far-Western blotting also showed that rFcAK was able to bind other 6 structural proteins of WSSV, including VP19 and VP28. Two-dimensional electrophoresis analysis showed that part of VP31 migrated to the spot with reduced pI after thein vitrophosphorylating incubation between rFcAK and rVP31, suggesting that the rVP31 might be phosphorylated. The bioinformatics analysis showed that VP31 had 21 arginine residents and FcAK had 12 arginine binding sites. They may provide the loci for the binding activity between VP31 and FcAK. We’ll further elucidate the underlying binding mechanism between WSSV and host, and try to find ways to block the infection of WSSV.

S917.4

A

1000-3096(2014)03-0104-07

10.11759/hykx20120702003

2012-07-02

2012-12-18

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資助項(xiàng)目(CARS-47); 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(201103034)

劉超(1986-), 女, 山東青島人, 碩士研究生, 主要從事對蝦病毒 WSSV 的生化及分子生物學(xué)研究, 電話: 0532-85823062, E-mail: lucy.mary@163.com; 黃倢, 通信作者: E-mail: huangjie@ysfri.ac.cn