彭 齊，陳曉英，宋 杰

華法林是目前臨床最常用的口服抗凝藥物，但其用藥劑量在不同種族間及個(gè)體間存在較大差異，甚至可相差10～20倍［1-2］。即使使用相同抗凝劑量，不同個(gè)體發(fā)生出血或血栓事件概率也不同，這與個(gè)體差異有關(guān)。近年研究顯示，細(xì)胞色素P450酶2C9基因(CYP2C9)和維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體1基因(VKORC1)多態(tài)性是造成個(gè)體間華法林維持劑量差異的主要原因［3-4］。本文旨在研究湖北地區(qū)漢族人群中CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性分布特點(diǎn)及基因變異位點(diǎn)對(duì)華法林穩(wěn)態(tài)劑量的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2012年3—8月在武漢亞洲心臟病醫(yī)院心臟外科行心瓣膜置換術(shù)患者108例為華法林組，入選標(biāo)準(zhǔn)為:漢族、＞18歲、穩(wěn)定華法林抗凝至少3個(gè)月、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)控制在2.0～3.0。排除標(biāo)準(zhǔn):肝、腎及甲狀腺功能異常;服用阿司匹林、氯吡格雷、肝素及維生素K等影響INR的藥物。所有入選對(duì)象均來(lái)自湖北省各地區(qū)就診的漢族居民，相互間無(wú)血緣關(guān)系及異族通婚史。選擇同期健康受試者85名為對(duì)照組。華法林組男50例，女58例，年齡(50.51±13.10)歲;對(duì)照組男39例，女46例，年齡(48.78±12.82)歲。兩組年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集:收集入選受試者的靜脈血(枸櫞酸鈉抗凝)3 ml用于檢測(cè) INR值、CYP2C9以及VKORC1基因型。同時(shí)觀察患者年齡、性別、體重、身高及華法林穩(wěn)態(tài)劑量。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.1 總DNA提取:采用天根血液基因組DNA提取試劑盒提取樣本的血液基因組DNA，1.0%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總基因組條帶。

1.2.2.2 目的片段的PCR擴(kuò)增:引物由大連寶生物公司合成(表1)，采用50μl的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增(表2)，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，50 ～65℃退火 30 s，72℃ 延伸 1 min，共 30個(gè)循環(huán)，72℃保溫10 min。PCR反應(yīng)在 ABI 9700 PCR儀上進(jìn)行，采用2.0%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶，得到預(yù)期大小的片段后，采用百泰克PCR產(chǎn)物回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行純化回收。

1.2.2.3 目的片段的測(cè)序反應(yīng):對(duì)目的片段進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng)后，并對(duì)測(cè)序PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。最后把目的片段上機(jī)測(cè)序并讀取結(jié)果(圖1～3)，測(cè)序儀為ABI 3500基因分析儀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，Pearsonχ2檢驗(yàn)用于檢查基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，Spearman等級(jí)相關(guān)用于分析華法林劑量與年齡、身高、體重以及INR值的關(guān)系，CYP2C9、VKORC1基因型之間華法林穩(wěn)態(tài)劑量的比較使用兩樣本t檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 基因型分布 兩組中基因型分布與華法林國(guó)際藥理學(xué)聯(lián)盟(IWPC)提供的臨床和遺傳學(xué)數(shù)據(jù)相符［1］。兩組CYP2C9和VKORC1基因型頻率和等位基因頻率分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表3～4。

2.2 不同基因型患者臨床資料及華法林穩(wěn)態(tài)劑量的比較 108例CYP2C9和VKORC1基因型臨床資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但CYP2C9基因*1/* 3型較*1/*1型華法林穩(wěn)態(tài)劑量小，VKORC1基因AA型較GA型華法林穩(wěn)態(tài)劑量小(P＜0.05，P ＜0.01)，VKORC1基因型 GG 型僅 3例，未做比較，見(jiàn)表5。

表1 擴(kuò)增VKORC1-1639G＞A、CYP2C9*2和CYP2C9*3目的片段的上下游引物

表2 擴(kuò)增VKORC1-1639G＞A、CYP2C9*2和CYP2C9*3目的片段的反應(yīng)體系

圖1 VKORC1-1639G＞A測(cè)序結(jié)果

2.3 基因序列 37例較長(zhǎng)時(shí)間達(dá)到目標(biāo)INR且穩(wěn)態(tài)劑量不太穩(wěn)定的患者基因非檢測(cè)位點(diǎn)突變很多，見(jiàn)圖4。CYP2C9基因變異位點(diǎn)非常多的患者和大多數(shù)人的基因圖譜見(jiàn)圖5～6。

2.4 非典型突變氨基酸表達(dá)情況 除了檢測(cè)的3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，還發(fā)現(xiàn)了50余個(gè)變異位點(diǎn)，在這些變異中有14種變異引起了氨基酸表達(dá)的變化。這些非典型變異中有一些文獻(xiàn)報(bào)道的如 rs28371686、rs28371685、rs5750570等。無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道的有8種，包括CYP2C9*2 Ile 177 Leu(A→C)55例(50.9%，MAF 25.5%)，CYP2C9*3 His 353 Asp(C→G)5例(4.63%，MAF 2.31%)，VKORC1-1691(T＞G)1例(0.93%，MAF 0.46%)，其中CYP2C9*3 His 353 Asp的變異可能對(duì)蛋白質(zhì)的活性影響比較大，因?yàn)榻M氨酸(His)為酸性帶正電荷，天冬氨酸(Asp)為堿性帶負(fù)電荷，兩種氨基酸性質(zhì)相差太大?，F(xiàn)檢測(cè)華法林用量的3個(gè)基因位點(diǎn)，其MAF分別為8%、4.2%和＜0.1%。我們發(fā)現(xiàn)的上述3個(gè)位點(diǎn)的MAF已經(jīng)和這通用的3個(gè)位點(diǎn)相當(dāng)。

圖2 CYP2C9*2測(cè)序結(jié)果

圖3 CYP2C9*3測(cè)序結(jié)果

表3 兩組CYP2C9基因型頻率和等位基因頻率分布［例(%)］

表4 兩組VKORC1基因型頻率和等位基因頻率分布［例(%)］

表5 CYP2C9和VKORC1不同基因型患者臨床資料及華法林穩(wěn)態(tài)劑量的比較(x±s)

圖4 兩批樣本基因序列比較非黑色部分表示此位點(diǎn)有樣本突變;a.穩(wěn)態(tài)劑量穩(wěn)定樣本;b.穩(wěn)態(tài)劑量不穩(wěn)定樣本

圖5 CYP2C9*3基因變異位點(diǎn)多的患者基因圖譜

圖6 多數(shù)人CYP2C9基因圖譜

3 討論

影響華法林劑量的因素主要有遺傳因素以及身高、體重、年齡、性別、種族、藥物相互作用等。華法林IWPC發(fā)表的研究顯示，加入藥物基因組學(xué)的預(yù)測(cè)模型(包括基因型)比臨床預(yù)測(cè)模型(不包括基因型)準(zhǔn)確性提高了80%［1］。所以個(gè)體的遺傳特征對(duì)于華法林的劑量影響很大［2-4］。目前研究發(fā)現(xiàn)與華法林藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)相關(guān)的基因達(dá)30多種，其中起主要作用的有CYP2C9和VKORC1基因［5-6］。美國(guó)FDA在華法林用藥說(shuō)明書(shū)中介紹了 CYP2C9和VKORC1基因?qū)┝康挠绊懖⒔ㄗh在用藥之前做基因檢測(cè)。

CYP2C9是人類肝臟中一種重要的由CYP超基因家族編碼的藥物代謝酶系統(tǒng)。CYP2C9是CYP2C亞家族中的一種同工酶，約占肝微粒體中CYP總量的20%。CYP2C9基因存在很多多肽位點(diǎn)，研究較多的也最常見(jiàn)的是CYP2C9*2和CYP2C9*3。在中國(guó)人群中CYP2C9*3變異位點(diǎn)相對(duì)更多［6-7］，主要是第359位的氨基酸由異亮氨酸變成亮氨酸。CYP2C9*2和CYP2C9*3突變攜帶者華法林劑量需求較野生型患者低，且CYP2C9*3攜帶者出血風(fēng)險(xiǎn)較高［5］。VKORC1基因位于16號(hào)染色體，此蛋白質(zhì)為組成維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位之一，主導(dǎo)維生素K依賴性凝血因子的生成，是華法林的作用靶點(diǎn)。VKORC1基因啟動(dòng)子區(qū)-1639G＞A多態(tài)性與華法林臨床用藥劑量相關(guān)，AA基因型華法林劑量需求較AG和GG型低。在中國(guó)患者中三者的頻率分別是79.7%、17.6%和2.7%。

本研究探討了湖北地區(qū)漢族人群中這兩種基因型的分布、不同基因型患者需要的華法林穩(wěn)態(tài)劑量比較以及年齡、身高、體重與華法林穩(wěn)定劑量的關(guān)系。在湖北地區(qū)漢族人群中，存在 CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性，且不同基因型患者間華法林用量存在差異，CYP2C9*1/*3型較*1/*1型華法林需求量少，考慮突變型的CYP2C9酶(中國(guó)人群中主要為*1/*3)與野生型(*1/*1)酶相比，對(duì)華法林的代謝能力下降，導(dǎo)致患者對(duì)華法林治療敏感，故所需劑量減少［8-9］;VKORC1 AA型較GA型華法林需求量少，VKORC1啟動(dòng)子的基因多態(tài)性是影響華法林穩(wěn)態(tài)劑量種族差異和個(gè)體差異的主要因素，華法林敏感者的基因型為純合子AA，而華法林抵抗者則為基因型 GA或者 GG，進(jìn)一步說(shuō)明CYP2C9和VKORC1的基因多態(tài)性是造成個(gè)體間華法林穩(wěn)態(tài)劑量差異的主要原因［10］。

以往眾多研究已表明，影響華法林劑量的因素主要有遺傳因素以及身高、體重、年齡、性別、種族、藥物相互作用等［11-12］。我們將在以后的研究中進(jìn)一步關(guān)注和探討此問(wèn)題。鑒于CYP2C9和VKORC1的不同基因型華法林用量存在明顯差異，本中心目前對(duì)臨床需口服華法林的患者進(jìn)行基因型檢測(cè)，并根據(jù)基因分型指導(dǎo)華法林初始劑量的選擇，希望能借此減少患者反復(fù)抽血檢測(cè)，以及降低抗凝出血的風(fēng)險(xiǎn)［13-14］。

本研究中37例INR維持量不太穩(wěn)定的患者，非檢測(cè)位點(diǎn)突變很多，提示除目前3個(gè)位點(diǎn)外仍有其他位點(diǎn)變異因素，如果其中任何一個(gè)被證明和華法林用藥相關(guān)，都會(huì)是一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)，對(duì)臨床用藥、科學(xué)研究都會(huì)有較大的影響。目前需要更多的樣本、數(shù)據(jù)給予支持。近年來(lái)，隨著研究的深入，針對(duì)國(guó)人華法林劑量構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型已越來(lái)越多，且納入了遺傳因素，可解釋約40% ～74%的個(gè)體劑量差異［15］。但是，目前基于中國(guó)人群構(gòu)建的劑量預(yù)測(cè)模型存在樣本量較小、納入的影響因素少，以及缺少外部驗(yàn)證等弊端。因此，我們需要更大樣本量的研究，對(duì)已構(gòu)建的模型進(jìn)行驗(yàn)證或是構(gòu)建新模型。我們也需要納入更多的遺傳和非遺傳因素，以期提高對(duì)華法林個(gè)體差異的解釋百分比。

［1］ International Warfarin Pharmacogenetics Consortium，Klein T E，Altman R B，et al.Estimation of the warfarin dose with clinical and pharmacogenetic data［J］.N Engl J Med，2009，360(8):753-764.

［2］ Mariamma Kuruvilla，Pharm D，Cheryle Gurk-Turner.A review of warfarin dosing and monitoring［J］.Proc(Bayl Univ Med Cent)，2001，14(3):305-306.

［3］ Zhao F，Loke C，Rankin SC，et al.Novel CYP2C9 genetic variants in Asian subjects and their influence on maintenance warfarin dose［J］.Clin Pharmacol Ther，2004，76(3):210-219.

［4］ Yuan H Y，Chen JJ，Lee M T，et al.A novel functional VKORC1 promoter polymorphism is associated with interindividual and inter-ethnic differences in warfarin sensitivity［J］.Hum Mol Genet，2005，14(13):1745-1751.

［5］ Breckenridge A，Orme M，Wesseling H，et al.Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the enantiomers of warfarin in man［J］.Clin Pharmacol Ther，1974，15(4):424-430.

［6］ Huang SW，Chen H S，Wang X Q，et al.Validation of VKORC1 and CYP2C9 genotypes on interindividual warfarin maintenance dose:a prospective study in Chinese patients［J］.Pharmacogenet Genomics，2009，19(3):226-234.

［7］ 李銳，邱健.細(xì)胞色素氧化酶CYP2C9基因多態(tài)性及其與心血管藥物代謝及疾病關(guān)系研究進(jìn)展［J］.心血管病學(xué)進(jìn)展，2010，31(2):279-282.

［8］ Takahashi H，Echizen H.Pharmacogenetics of warfarin elimination and its clinical implications［J］.Clin Pharmacokinet，2001，40(8):587-603.

［9］ Goodstadt L，Ponting CP.Vitamin K epoxide reductase:homology，active site and catalytic mechanism ［J］.Trends Biochem Sci，2004，29(6):289-292.

［10］Chern H D，Ueng T H，F(xiàn)u Y P，et al.CYP2C9 polymorphism and warfarin sensitivity in Taiwan Chinese［J］.Clin Chim Acta，2006，367(1-2):108-113.

［11］ Miao L，Yang J，Huang C，et al.Contribution of age，body weight，and CYP2C9 and VKORC1 genotype to the anticoagulant response to warfarin:proposal for a new dosing regimen in Chinese patients［J］.Eur J Clin Pharmacol，2007，63(12):1135-1141.

［12］ Aquilante C L，Langaee T Y，Lopez L M，et al.Influence of coagulation factor，vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，and cytochrome P450 2C9 gene polymorphisms on warfarin dose requirements［J］.Clin Pharmacol Ther，2006，79(4):291-302.

［13］Higashi M K，Veenstra D L，Kondo L M，et al.Association between CYP2C9 genetic variants and anticoagulation-related outcomes during warfarin therapy［J］.JAMA，2002，287(13):1690-1698.

［14］Lindh J D，Holm L，Andersson M L，et al.Influence of CYP2C9 genotype on warfarin dose requirements-a systematic review and meta-analysis［J］.Eur J Clin Pharmacol，2009，65(4):365-375.

［15］Ye C，Jin H，Zhang R，et al.Variability of warfarin dose response associated with CYP2C9 and VKORC1 gene polymorphisms in Chinese patients［J］.JInt Med Res，2014，42(1):67-76.