傅明洋 趙春生 李德洪 朱學(xué)亮

山東省德州市林業(yè)局果樹站·253046

1 分子標(biāo)記技術(shù)

分子標(biāo)記是一種以生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)——核酸（DNA）的多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是隨著各種生物技術(shù)的不斷創(chuàng)新而進(jìn)步和發(fā)展的，經(jīng)歷了從基于酶切的限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP），到基于微衛(wèi)星的簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR），再到以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）為基礎(chǔ)的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD），一直到以酶切和PCR相結(jié)合的擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphis，AFLP）。 與形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和同工酶標(biāo)記相比，分子標(biāo)記具有多態(tài)性高，檢測方法簡便、快捷，不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點。分子標(biāo)記的產(chǎn)生和發(fā)展為當(dāng)代果樹育種工作提供了新方法、新思路，充分體現(xiàn)了生物技術(shù)革新帶來的促進(jìn)作用。

2 分子標(biāo)記術(shù)在果樹育種中的應(yīng)用

分子標(biāo)記技術(shù)的諸多優(yōu)越性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于果樹遺傳圖譜構(gòu)建、重要農(nóng)藝性狀的基因定位、遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析、種質(zhì)資源鑒定和分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面，并取得了驚人的成績。

2.1 親緣關(guān)系與遺傳多樣性 分子標(biāo)記數(shù)量巨大，廣泛存在于基因組DNA的各個區(qū)域。通過對基因組中分子標(biāo)記的多態(tài)性進(jìn)行比較，能夠準(zhǔn)確區(qū)分同一物種不同的基因型，甚至是親緣關(guān)系相近的材料，從而揭示其遺傳本質(zhì)。張開春和李榮旗用38個RAPD引物對平邑甜茶的遺傳一致性進(jìn)行分析，共獲得173條穩(wěn)定的DNA譜帶，其中僅有2條譜帶表現(xiàn)出多態(tài)性，進(jìn)一步證明了通過無融合生殖的平邑甜茶具有較高的遺傳一致性。Geibel等將RAPD和ISSR相結(jié)合，用來分析新疆野蘋果的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)來自中亞的7個群體有很大的遺傳差異。Lin等利用AFLP對中國梨屬的10個種做了親緣關(guān)系分析，結(jié)果表明，供試材料在遺傳距離為0.166～0.169時被分為兩大類，一類為原產(chǎn)于中國的8個種，其中遺傳距離最近的白梨和砂梨首先聚在一起；另一類由西洋梨和杏葉梨組成。高源等利用篩選出的12對SSR引物分析蘋果屬資源的親緣關(guān)系，共獲得176個等位基因，其中3對引物就可以將所有59份材料加以區(qū)分；聚類圖中，具有親本血緣的品種緊密聚在一起，親本相同的個體也有較高的遺傳相似系數(shù)，起源于新疆野生蘋果與地方品種交錯在一起，反映了其復(fù)雜的遺傳關(guān)系。徐興興等利用SSR分析了20個蘋果栽培品種的遺傳多樣性，將供試蘋果品種分為四大類，與傳統(tǒng)系譜分類基本一致，并初步建立了蘋果品種的SSR基因型圖譜庫。Yan等采用RAPD分析了新疆野蘋果群體的遺傳多樣性，結(jié)果表明，83.1%的遺傳多樣性存在于群體內(nèi)部，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于群體之間的遺傳多樣性。Zhang等通過對4個新疆野蘋果群體進(jìn)行SSR分析，確定了新疆野蘋果遺傳多樣性水平遠(yuǎn)高于栽培品種，揭示了新疆野蘋果豐富的遺傳多樣性。

2.2 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建與基因定位 遺傳圖譜既是遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容，又是分子育種工作的理論基礎(chǔ)。構(gòu)建高密度分子遺傳圖譜對于基因定位至關(guān)重要，圖譜上包括的標(biāo)記數(shù)量越多，分布越均勻，則基因定位就越精細(xì)。King構(gòu)建的歐洲蘋果遺傳圖譜包括了控制生長、果實性狀、抗病性、抗寒性等基因的標(biāo)記。Maliepaard等利用Prima×Fiesta產(chǎn)生的152株實生苗為作圖群體構(gòu)建了一份蘋果連鎖圖譜，此圖譜成為以后幾年蘋果基因組研究的重要參考資料，含17個連鎖群，對應(yīng)蘋果的17條同源染色體，Prima連鎖群平均長度為50 cM，F(xiàn)iesta連鎖群平均長度為58 cM，比一般農(nóng)作物（100～150 cM）小得多，包含 200多個標(biāo)記 （30多個 RAPD、24個同功酶，124個RFLP，10 個 SSR，9 個 AFLP 標(biāo) 記 和 1 個SCAR標(biāo)記），是蘋果基因組研究的一張核心圖譜。Dalbó等以58個雜交后代為作圖群體，對早期構(gòu)建的一份葡萄連鎖圖譜進(jìn)行加密，將 25個 SSR、4個 CAPS以及 12個 AFLP標(biāo)記重新定位在該圖譜上，并且發(fā)現(xiàn)了一個與性別基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記。Liebhard等在前人研究的基礎(chǔ)上以Fiesta×Discovery群體構(gòu)建了當(dāng)時最完整、飽和度最大的蘋果遺傳連鎖圖譜，其中大量的共顯性標(biāo)記，使該圖譜可以快速轉(zhuǎn)移到其他物種中。該圖譜包含840個分子標(biāo)記（475 個 AFLPs，235 個 RAPDs，129個SSRs和1個SCAR標(biāo)記），與以前的遺傳圖譜相比共增加了511個新的分子標(biāo)記。高密度分子遺傳圖譜的繪制使部分植物的遺傳學(xué)研究取得重大進(jìn)展，并對分子標(biāo)記輔助選擇和基因圖位克隆技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動作用。Howad等利用扁桃與杏構(gòu)建的F2群體，從401對SSR引物中篩選出的264個SSR標(biāo)記定位在已有的李的遺傳圖譜上，從而提高了該圖譜的飽和度。曹珂等以桃與山桃的雜交后代為作圖群體，采用多種分子標(biāo)記構(gòu)建包了含11個連鎖群的遺傳圖譜，同時將雌蕊發(fā)育和單瓣/重瓣基因進(jìn)行定位，為這2個基因的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

2.3 種質(zhì)資源鑒定 果樹生命周期長，并且長期通過無性方式繁殖，加上不同地域間的相互引種，同名異物和同物異名現(xiàn)象十分普遍。如何準(zhǔn)確地對現(xiàn)有果樹品種進(jìn)行鑒定和分類，是進(jìn)一步科學(xué)、有效地利用果樹資源的基礎(chǔ)。過去進(jìn)行品種分類和鑒定主要采用比較植物學(xué)形態(tài)特征，并結(jié)合細(xì)胞學(xué)、胞粉學(xué)和酶學(xué)等方法，但都有其局限性，因誤差大、效率低，而不能對性狀相近的材料準(zhǔn)確區(qū)分。分子標(biāo)記建立在基因組DNA多態(tài)性基礎(chǔ)上，標(biāo)記數(shù)目多、檢測迅速，是繪制指紋圖譜的強(qiáng)有力工具，能夠?qū)麡淦贩N進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定與分類，對保護(hù)我國名、特、優(yōu)果樹品種及新育品種的知識產(chǎn)權(quán)具有重要意義。羅正榮用RAPD技術(shù)鑒定柿樹，僅用1條引物就區(qū)分了15個品種。Botta等用4對引物對24份意大利葡萄品種進(jìn)行鑒定，除Favotita、Pigato和Vermentino 3個品種擴(kuò)增片段一樣，可能為同物異名外，其它品種均可以區(qū)分開。Guifford等用3個SSR標(biāo)記將21份蘋果品種區(qū)分開。周愛琴等以篩選出的OPQ15為引物，繪制了19種蘋果砧木基因型的DNA指紋圖譜，區(qū)分了其中的17種，區(qū)分效率達(dá)95%。唐建民等對小金海棠和山荊子的79株雜交后代進(jìn)行RAPD分析，并用SSR對RAPD的初步鑒定結(jié)果進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示，RAPD鑒定出的雜種實生苗有72.2%得到SSR標(biāo)記的證實。韓宏偉等根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的DNA序列設(shè)計開發(fā)SSR引物，用篩選出的6對SSR引物可以對19份梨的主要栽培品種進(jìn)行鑒別。

2.4 分子標(biāo)記輔助選擇育種 分子標(biāo)記輔助選擇就是通過遺傳標(biāo)記對目標(biāo)性狀進(jìn)行間接選擇。通過分子標(biāo)記分析，可以在早期選擇與目標(biāo)基因（性狀）緊密連鎖的DNA片段作為輔助育種的標(biāo)記，大大縮短育種周期，從而省時、省力，并且其結(jié)果因不受其它基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響而較為可靠。分子標(biāo)記輔助選擇在果樹育種中主要應(yīng)用于雜種實生苗的早期鑒定，雜交親本的選配，雌雄異株果樹幼苗的鑒定，多種抗病性狀的同時篩選，染色體片段去向追蹤，遺傳轉(zhuǎn)化中目的基因的檢測等方面。田義軻等將蘋果柱型基因的AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記對蘋果柱型性狀檢測的準(zhǔn)確率達(dá)90%以上，可以用于柱型苗木的早期鑒定及柱型蘋果雜交育種中對群體材料的早期選擇。Warburton等利用分子標(biāo)記結(jié)合群體分離分析法 （Bulked segregation analysis，BSA），從油桃和桃的雜交后代中篩選出與果肉硬度、離核以及黃肉性狀連鎖的RAPD標(biāo)記。Hormaza用RAPD和胚培養(yǎng)技術(shù)對櫻桃進(jìn)行早期育種選擇，能夠判斷出用混合花粉授粉后所得到胚的父本。Katula-Debreceni等利用SSR技術(shù)得到兩個白粉病抗性基因，并且成功地對葡萄雜種群體中的抗病個體進(jìn)行早期選擇，大大降低了后代中的感病個體，充分顯示了分子標(biāo)記輔助育種的優(yōu)越性。

3 展望

實踐證明，分子標(biāo)記技術(shù)具有很強(qiáng)的實用性，為傳統(tǒng)果樹育種工作提供了有力的輔助手段，使育種研究的目的性與效率得到提高。盡管分子標(biāo)記技術(shù)有許多優(yōu)勢，但作為一種技術(shù)方法，任何分子標(biāo)記技術(shù)均不能滿足作為理想遺傳標(biāo)記的所有要求，這就要求育種工作者在實際工作中要結(jié)合育種目標(biāo)，選擇合適的分子標(biāo)記，制定完善的育種計劃，充分發(fā)揮分子標(biāo)記的技術(shù)優(yōu)勢?？梢韵嘈?，隨著更多果樹基因組測序工作的完成，以及功能基因組學(xué)與生物信息學(xué)的深入發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)在果樹育種工作中的應(yīng)用必將有更廣闊的前景。

23篇（略）。