雷翔慧，湯 瑤，吳自勍，趙 彤△

（1.南方醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學系，廣州510515；2.南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科，廣州510515）

SH2 結(jié)構(gòu)域酪氨酸磷酸化酶（SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase，SHP-l），主要表達于造血細胞的細胞質(zhì)，是白血病、淋巴瘤細胞的抑癌基因，其異常表達與淋巴瘤的增殖、分化、凋亡有密切關(guān)系，表達缺失會導致淋巴瘤的發(fā)生［1-3］?；羝娼鹆馨土觯╤odgkin lymphoma，HL）是淋巴造血系統(tǒng)的一類腫瘤，SHP1 表達在HL 情況，尚未見文獻報道，國外和本課題組之前研究發(fā)現(xiàn)HL的發(fā)生與CD99 蛋白表達缺失密切相關(guān)，CD99表達缺失是H L形成的一個重要分子事件［4-5］，但SHP1表達與CD99表達的關(guān)系如何，非常值得探討，為此本文在以往研究基礎(chǔ)上，檢測SHP1 在HL中的表達及其與CD99 的作用關(guān)系，探討SHP1 表達在HL中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與細菌B 淋巴母細胞株IM9 細胞、漿母細胞株KM3 細胞、HL 細胞株L428 細胞和L428-CD99（上調(diào)CD99 的L428 細胞）細胞，由南方醫(yī)科大學病理學系保存。采用澳洲進口胎牛血清（無需額外滅活），RPMI-1640 培基配制成含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，37 ℃恒溫，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.1.2 試劑與材料RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購自南美洲Gibeco 公司；蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF和BCA-100 蛋白質(zhì)定量測定試劑盒購自凱基公司；β-ac t in 抗體、二抗購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒購自碧云天公司，試劑盒組成：30% AcroBis、1 mo L Tris-Hcl（p H 8.8）、10%SDS、過硫酸銨、TEMED、1 mo L Tris-Hcl（p H 6.8）；SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液（5 ×）、蛋白預染Marker、PVDF膜、脫脂奶粉購自廣州斯佳公司；Beyo ECL Plus 發(fā)光試劑盒購自凱基公司。人SHP1抗體購于美國CST公司，CD99抗體購于Epitomic 公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR（RT-PCR）Trizol、RT-PCR提純試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司），7500Software v2.0.1，引物構(gòu)建于Invitrogen 公司，GAPDH上游引物：5′-ACA GTC AGC CGC ATC TTC TT-3′，下游引物：5′-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3′；CD99上游引物：5′-GCC CAG CAA CAA GCA AAG CAC AT-3′，下游引物：5′-CCC AAC CAC CCT AGT TCC TCC G-3′92 ℃2 min 30 s、72 ℃40 s、55 ℃退32 s 40 s；SHP1上游引物：5′-ATC TGA GGC TTA GTC CCT GAG C-3′，下游引物5′-CTG AGG TCT CGG TGA AAC CAC-3′，92 ℃2 min 30 s、72 ℃40 s、55 ℃32 s 40 s。20μL體系。

1.2.2 Western blot 檢測 Western blot 培養(yǎng)的細胞收集各樣本蛋白（蛋白裂解液購自碧云天），SDS-PAGE電泳：配置10%濃度的分離膠，5%的積層膠；取50μg 蛋白質(zhì)與5 ×SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液混合上樣量，積層膠80 V 30 min，分離膠100 V 120 min；冰浴下轉(zhuǎn)膜100 m A 120 min。5% TBST封閉1.5～2.0 h；SHP1 兔抗人單抗（1∶2000 稀釋），CD99 兔抗人單抗（1∶5000 稀釋），4 ℃孵育過夜，二抗（1∶5000稀釋）室溫孵育1 h，熒光成像儀內(nèi)曝光。

1.2.3 熒光共聚焦實驗6 孔板培養(yǎng)L428 細胞48 h，再用無血清培養(yǎng)24 h，收取對數(shù)生長期的細胞，細胞懸液密度為1 ×106個／mL，1000 r／min，離心5 min，細胞沉淀0.01 mol／L，PBS 洗滌2～3 次；1000 r／min，離心5 min，棄去上清液；95%乙醇固定15 min，Triton X-100 破膜10 min。0.01 mol／L PBS洗滌3 次，5min，3% H2O28min，0.01mol／L PBS洗滌3 次，5 min，血清封閉5 min，甩去血清，分別用鼠抗人CD99、SHP1抗體孵育，4 ℃過 夜；0.01 mol／L PBS洗滌3次滴加相應的二抗，37 ℃避光孵育30 min；PBS 沖洗；DPAI 復染，觀察拍照。

1.2.4 Si-RNA片段瞬時干擾6 孔板細胞培養(yǎng)，細胞密度為1 ×106個／mL，實驗組加入10μL干擾片段＋240μL OPTIIMEN，靜置20 min，240μL OPTIIMEN＋10μL Lip2000，混合后靜置20 min，加入細胞中；對照組加入500μL 培基；37 ℃孵育，分別于48、72 h 進行細胞相關(guān)檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行分析；采用兩個獨立樣本的非參數(shù)檢驗進行組間比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 L428、IM9、KM3 淋巴瘤細胞SHP1和CD99 mRNA表達IM9中SHP1 mRNA高表達，而KM3、L428細胞中SHP1 mRNA表達較低；且與CD99 的表達趨勢相一致，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1 RT-PCR 檢測IM9、KM3、L428 細胞中SHP1 和CD99 m RNA表 達

2.2 L428細 胞 和L428-CD99細 胞SHP1 mRNA表 達L428-CD99 細胞較L428細胞SHP1 mRNA表達要高，且與CD99 的表達趨勢相一致，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2。

2.3 L428、L428-CD99、IM9、KM3 淋巴瘤細胞SHP1 和CD99蛋白表達Western blot 結(jié)果與m RNA基因表達水平相一致，IM9、KM3、L428-CD99 細胞中SHP1 表達較L428 細胞中高，且與CD99 的表達趨勢相一致。見圖3。

圖2 RT-PCR 檢測L428-CD99（L99）與L428 細胞株中SHP1 與CD99 m RNA的表達

圖3 Western blot 檢測IM9、KM3、L428、L428-CD99中SHP1 與CD99 的蛋白水平表達

圖4 在L428 細胞中熒光共聚焦檢測CD99 與SHP1 的表達

圖5 瞬時干擾CD99 后SHP1 在基因和蛋白水平的表達

2.4 L428 細胞CD99 與SHP1 的表達及其共定位 采用熒光共聚焦實驗在L428細胞中檢測CD 99與SHP 1的表達部位，同時對其進行共定位，結(jié)果顯示CD99 主要表達于細胞膜，SHP1 主要表達于細胞質(zhì)，紫色為共定位部分。見圖4。

2.5 瞬時干擾CD99 后SHP1 在基因和蛋白水平的表達 在IM9 細胞中Si-RNA瞬時干擾CD99 后，用RT-PCR及Western blot 檢測SHP1 在基因和蛋白水平的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)CD99 后，SHP1 m RNA表達降低（圖5A、B），且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；蛋白水平表達趨勢與基因水平相一致（圖5C）。

3 討 論

SHP1 主要表達于造血細胞的細胞質(zhì)，是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)磷酸化水平的關(guān)鍵調(diào)控因子，在多數(shù)淋巴瘤和白血病細胞系（如NK-YS2、IWA3、MT1、EDS、ATLIK等）中低表達，其啟動子高甲基化狀態(tài)導致的基因沉默是淋巴瘤、白血病發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一［6-7］。相反，SHP1蛋白在正常細胞中可以表現(xiàn)為正常表達或過度表達。SHP1 調(diào)節(jié)機能障礙可導致細胞的過度增長，從而導致腫瘤的發(fā)生［8-9］。HL是一種淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，1832年由英國的Thomas Hodgkin 最早描述，該疾病的典型形態(tài)特點是在大量的炎性反應背景細胞中浸潤少數(shù)的腫瘤性H／RS（hodgkin／reed-stern-berg）細 胞［5-10］。人CD99（Mic2）是一種相對分子質(zhì)量為32 ×103的跨膜糖蛋白，是HL 的潛在致瘤基因，參與造血細胞的分化等。研究報道H／RS 細胞的形態(tài)特征及免疫表型的變化與CD99蛋白表達缺失有關(guān)，CD99 是HL 形成的一個重要機制［11］。本研究熒光共聚焦檢測也發(fā)現(xiàn)SHP1 為細胞質(zhì)表達，CD99 為細胞膜表達，且二者有共定位部分。

Oka 等［12］通過表達譜芯片及組織微陣列技術(shù)證實SHP1基因在惡性淋巴瘤中表達明顯下降。本研究在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測3 株B 系淋巴細胞IM9、KM3、L428 中SHP1 的表達，結(jié)果顯示SHP1 在HL細胞株L428 中表達最低；與CD99 的基因和蛋白水平表達趨勢有一致性。

JAK／STAT信號轉(zhuǎn)導途徑參與細胞增殖、分化、凋亡生物學作用的相關(guān)調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，該途徑異常激活是HL 形成的一個重要分子機制，但其異常激活的具體機制尚未完全明確［13-14］。SHP1 基因為存在于細胞質(zhì)中的一種酪氨酸磷酸酶，是JAK／STAT信號轉(zhuǎn)導途徑負性調(diào)控因子之一。SHP1 基因沉默可以導致JAK／STAT信號轉(zhuǎn)導分子活性增強，從而促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展。本研究在課題組前期構(gòu)建的上調(diào)CD99 穩(wěn)定細胞株L428-CD99 中同樣在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測SHP 1 基因和蛋白水平的表達，發(fā)現(xiàn)SHP1 隨著CD99 的上調(diào)而基因和蛋白水平表達升高。證實SHP1 在HL 中低表達可能與其CD99缺失有關(guān)，熒光共聚焦實驗以及在IM9細胞株中瞬時干擾CD99 時，均 發(fā) 現(xiàn)CD99與SHP 1有相互關(guān)系。而CD 99與SHP1 的相互關(guān)系是否與SHP1 基因表達下調(diào)從而導致JAK／STAT信號轉(zhuǎn)導途徑失調(diào)有關(guān)，有待于進一步研究。

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