章明徐，陳婉燕，謝小紅，張?？担畎l(fā)科，陳 鳴，鄧少麗

（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗(yàn)科，重慶400042）

結(jié)核病的控制一直以來(lái)備受關(guān)注，全世界每年新增結(jié)核病例1 000萬(wàn)左右，而在我國(guó)每年新增病例100萬(wàn)左右，是我國(guó)重點(diǎn)控制的重大疾病之一。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為在結(jié)核免疫機(jī)制中發(fā)揮主要作用的是細(xì)胞免疫［1］，近年來(lái)，體液免疫在結(jié)核發(fā)病機(jī)制中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。目前已發(fā)現(xiàn)的調(diào)控體液免疫過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子主要有BCL6、Bli mp1、IRF4、MITF、MTA3、PAX5和XBP-1等，其中Bli mp1是1991年發(fā)現(xiàn)的由pr d m1基因編碼的蛋白，是漿細(xì)胞分化的主調(diào)控子［2-3］。有研究表明，Blimp1不僅可以調(diào)控B細(xì)胞和漿細(xì)胞的分化發(fā)育，還可參與調(diào)控免疫系統(tǒng)中髓系細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的發(fā)育與功能。近期研究發(fā)現(xiàn)，Bli mp1對(duì)T細(xì)胞的增殖分化和免疫自穩(wěn)亦發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［4-6］。那么，在機(jī)體的抗結(jié)核免疫反應(yīng)中，Bli mp1是否會(huì)參與其中？本研究擬通過(guò)分析結(jié)核病患者與健康體檢者外周血單個(gè)核細(xì)胞中Blimp1 mRNA的表達(dá)情況，探討B(tài)limp1是否參與到機(jī)體抗結(jié)核免疫反應(yīng)過(guò)程中，為進(jìn)一步探明結(jié)核發(fā)病機(jī)制、結(jié)核桿菌免疫清除及結(jié)核病診斷新分子提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選擇2012年2月至2013年5月來(lái)本院就診的結(jié)核患者110例，根據(jù)病史、實(shí)驗(yàn)室檢查將其分為活動(dòng)期組（60例）和潛伏期組（50例）?；顒?dòng)期組男34例，女26例，年齡13～65歲，平均（34．0±5．6）歲；潛伏期組男31例，女19例，年齡13～65歲，平均（34．0±6．4）歲。上述患者診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病分會(huì)制定的肺結(jié)核診斷和治療指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］。同時(shí)排除肝、腎功能障礙患者，全身免疫性疾病患者，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物或免疫抑制劑患者。選擇同期到本院的50例健康體檢者為對(duì)照組，排除吸煙、酗酒者，結(jié)核菌素試驗(yàn)均為陰性，其中男23例，女27例，年齡16～78歲，平均（35．0±6．8）歲。

1．2 主要試劑與儀器 Ficoll細(xì)胞分離液購(gòu)自GE公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自北京中衫公司，Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，焦碳酸乙二酯原液購(gòu)自Sig ma試劑公司，無(wú)核酸酶雙蒸水購(gòu)自美國(guó)Pro mega公司，75%乙醇、異丙醇和氯仿購(gòu)自重慶川東公司。熒光定量PCR試劑盒、Taq聚合酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司，PCR MIX混合液購(gòu)自杭州博日科技有限公司，引物和探針在上海生工生物工程有限公司合成。美國(guó)CFX-96 Bio-Rad熒光定量PCR儀，美國(guó)ND-1000紫外分光光度計(jì)。

1．3 方法

1．3．1 分離外周血單個(gè)核細(xì)胞與提取總RNA 抽取結(jié)核病患者及健康體檢者的乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝靜脈血2 mL，取EDTA抗凝血1 mL，加至1 mL Ficoll細(xì)胞分離液表面，常溫下2 000 r／min離心20 min，用毛細(xì)吸管將標(biāo)本中的單個(gè)核細(xì)胞分離出來(lái)，收集并用1%PBS洗滌，常溫下2 500 r／min離心10 min，去上清液留單個(gè)核細(xì)胞于管底。然后使用Trizol將細(xì)胞破裂，利用三氯甲烷、異丙醇和75%乙醇萃取、沉淀的原理，提取出細(xì)胞中的RNA。再將RNA溶解在無(wú)核酸酶水中，利用ND-1000紫外分光光度計(jì)定量檢測(cè)RNA的質(zhì)量和水平。

1．3．2 將RNA逆轉(zhuǎn)錄為c DNA 根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)取1 mg的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，42℃孵育40 min得到c DNA，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．3 熒光定量PCR檢測(cè) 對(duì)上述逆轉(zhuǎn)錄后得到的c DNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，引物設(shè)計(jì)如下：Bli mp1上游5′-TCC AGC ACT GTG AGG TTT CA-3′，Blimp1下游5′-TCA AAC TCA GCC TCT GTC CA-3′。熒光探針，Blimp1 FAM-5′-ATG GAC ATG GAG GAT GCG GAT ATG-3′。內(nèi)參：B2M上游5′-TCC ATC CGA CAT TGA AGT TGA C-3′，B2M下游5′-ACT ATC TTG GGC TGT GAC AAA G-3′，B2M探針FA M-5′-TGG TTC ACA CGG CAG GCA TAC TCA-3′。熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃3 min；95℃10 s，55℃30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)熒光定量PCR儀得出的結(jié)果，計(jì)算活動(dòng)期組、潛伏期組和對(duì)照組中每例標(biāo)本的靶基因Bli mp1和相應(yīng)內(nèi)參基因B2M的ct值差值△ct，并計(jì)算活動(dòng)期組、潛伏期組的和對(duì)照組，利用相對(duì)定量2-△△ct法（-△△ct＝活動(dòng)期組／潛伏期組-對(duì)照組）計(jì)算活動(dòng)期組、潛伏期組和對(duì)照組之間Bli mp1 mRNA表達(dá)的差異。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用Graphpad Pris m軟件將對(duì)照組、活動(dòng)期組及潛伏期組的ct值和△ct值繪圖分析。采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間差異比較，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。t檢驗(yàn)以△ct均值計(jì)算△△ct，并利用相對(duì)定量2-△△ct法計(jì)算Bli mp1基因表達(dá)差異倍數(shù)。

2 結(jié) 果

2．1 外周血單個(gè)核細(xì)胞RNA質(zhì)量及擴(kuò)增特異性 所有樣本提取總RNA水平均不小于300 ng／μL，吸樂(lè)度260／280均在1．75～1．95，提示總RNA質(zhì)量較好。靶基因Bli mp1和內(nèi)參基因B2M mRNA擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖1，溶解曲線見(jiàn)圖2。

圖1 熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

2．2 Blimp1 mRNA在3組中表達(dá)的差異 活動(dòng)期組、潛伏期組和對(duì)照組Bli mp1和B2M基因的△ct值均呈正態(tài)分布。活動(dòng)期組Bli mp1相對(duì)于B2M的平均△ct值為5．36±2．45，潛伏期組相對(duì)于B2M的平均△ct值為2．40±1．86，對(duì)照組Bli mp1相對(duì)于B2M的平均△ct值為1．44±0．80，活動(dòng)期組、潛伏期組與對(duì)照組之間平均△ct值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．000），見(jiàn)表1。通過(guò)相對(duì)定量2-△△ct法計(jì)算，活動(dòng)期組的Bli mp1 mRNA水平是對(duì)照組的15．35倍，潛伏期組的Bli mp1 mRNA水平是對(duì)照組的2．21倍，且組間Blimp1 mRNA表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

圖2 溶解曲線

表1 各組間Bli mp1 mRNA相對(duì)定量表達(dá)差異

3 討 論

機(jī)體對(duì)結(jié)核桿菌的免疫反應(yīng)相當(dāng)復(fù)雜，大體上可分為固有免疫和適應(yīng)性免疫。固有免疫主要包括被激活的巨噬細(xì)胞和致敏的T淋巴細(xì)胞；適應(yīng)性免疫主要依賴于特異性的細(xì)胞免疫，包括抗原呈遞與T細(xì)胞的識(shí)別、活化、應(yīng)答幾個(gè)階段。雖然細(xì)胞免疫在結(jié)核免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，但近年來(lái)體液免疫在結(jié)核病發(fā)病機(jī)制中的作用也引起了一定關(guān)注，研究提示細(xì)胞免疫與體液免疫在結(jié)核病發(fā)展過(guò)程中的作用是相輔相成、缺一不可的［1-2］。

調(diào)控體液免疫過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子Blimp1可以靶向結(jié)合多種基因，通過(guò)招募包括組蛋白去乙?；负图谆D(zhuǎn)移酶在內(nèi)的染色體修飾酶到特定核酸序列如啟動(dòng)子序列，來(lái)抑制靶基因的表達(dá)，起著轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用［7-8］。Bli mp1蛋白是促進(jìn)成熟B淋巴細(xì)胞向漿細(xì)胞終末分化的主調(diào)控因子［9］，它可抑制與B淋巴細(xì)胞增殖有關(guān)的一系列基因的表達(dá)，如BCL6、PAX5、CMYC、CⅡTA、Id等，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞向漿細(xì)胞分化。Bli mp1蛋白還可以誘導(dǎo)成熟漿細(xì)胞分泌抗體，是維持骨髓中長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞所必需的轉(zhuǎn)錄因子。Bli mp1功能不僅局限于B細(xì)胞和漿細(xì)胞，還可參與調(diào)控免疫系統(tǒng)中髓系細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的發(fā)育與功能。此外，Blimp1對(duì)T細(xì)胞的增殖分化和免疫自穩(wěn)亦發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，Bli mp1在Th2細(xì)胞中表達(dá)高于Th1細(xì)胞，而且缺乏Bli mp1的CD4＋T細(xì)胞將表現(xiàn)出受損的Th2體液反應(yīng)效應(yīng)，說(shuō)明Bli mp1對(duì)Th2細(xì)胞的分化及功能的必要性。而且，在Blimp1缺失的兩個(gè)動(dòng)物模型中，也發(fā)現(xiàn)受抗原刺激后CD4＋T細(xì)胞和Th1細(xì)胞均表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗凋亡能力［10-11］，說(shuō)明Bli mp1的正常功能之一就是促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞的凋亡。

那么，在結(jié)核發(fā)病及機(jī)體抗結(jié)核免疫反應(yīng)過(guò)程中，Bli mp1是否會(huì)參與其中？本研究發(fā)現(xiàn)，在活動(dòng)期組血液中Blimp1 mRNA的表達(dá)水平為對(duì)照組的15．35倍，是潛伏期組結(jié)核患者的2．21倍，初步說(shuō)明Bli mp1參與到機(jī)體抗結(jié)核的免疫反應(yīng)中。Bli mp1有可能作為診斷結(jié)核的新指標(biāo)，作為診療結(jié)核的新靶點(diǎn)。Bli mp1在機(jī)體抗結(jié)核免疫反應(yīng)的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

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