劉鴻　姚鋆　楊芃原　樊惠芝

摘要 利用肽段固相膠條等電聚焦技術(shù)對(duì)大鼠鼠肝組織蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)分離，反相色譜分離所得預(yù)分離組分后，用LTQOrbitrap MS進(jìn)行分析。共鑒定到2039個(gè)蛋白質(zhì)，包括18個(gè)乙酰化蛋白，其中4個(gè)乙?；鞍孜幢粓?bào)道過(guò)。對(duì)這些蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，將肽段等電聚焦與LCMS/MS結(jié)合起來(lái)，是一種有效的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，適合于大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定分析。

關(guān)鍵詞 固相等電聚焦； 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用； 鼠肝蛋白質(zhì)

1引言

蛋白質(zhì)的分離與鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要內(nèi)容，但由于生物樣品的復(fù)雜性，在進(jìn)行蛋白鑒定分析前，往往需要預(yù)分離簡(jiǎn)化體系后再進(jìn)行鑒定分析。蛋白質(zhì)等電聚焦分離技術(shù)是一種有效的預(yù)分離方法，被用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，取得了很好的成果[1～5]。但蛋白質(zhì)的液相等電聚焦在研究中存在一些問(wèn)題，例如聚焦結(jié)束后需對(duì)分離的各組分蛋白質(zhì)分別酶解，溶液中pH值不穩(wěn)定，同時(shí)在線分析能力不強(qiáng)，所以科學(xué)家又發(fā)展了肽段固相等電聚焦的方法。

基于固相pH梯度（Immobilized pH gradients，IPG） 膠條的肽段等電聚焦分離技術(shù)（Peptide IPG IEF）是液相等電聚焦的重大發(fā)展。它利用傳統(tǒng)的2 DE分離儀器，在IPG 膠條上對(duì)肽段進(jìn)行等電聚焦分離。2008年，Hubner等[6]采用Peptide IPG IEF代替膠內(nèi)酶解技術(shù)，將其引入蛋白質(zhì)組學(xué)分析中。同年，Chick等[7]將Peptide IPGIEF與LCMS/MS聯(lián)用，分析了鼠肝中的膜蛋白，他們通過(guò)此方法共發(fā)現(xiàn)了1549個(gè)非冗余膜蛋白。 2009年，McQuade等[8]將Peptide IPGIEF與LCMS/MS聯(lián)用，分析了人類胚胎干細(xì)胞，這種技術(shù)提高了蛋白檢測(cè)的覆蓋率，是一種有效的蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程。 Peptide IPGIEF簡(jiǎn)便易行，上樣量大（mg級(jí)），同時(shí)膠條上pH值穩(wěn)定，并且對(duì)肽段的提取和后續(xù)處理非常簡(jiǎn)便，非常適合與LCMS/MS聯(lián)用，是一種非常有效的蛋白質(zhì)組學(xué)分離分析工具[7，9，10]。

本研究將Peptide IPG IEF分離分析技術(shù)運(yùn)用于復(fù)雜生物樣品——鼠肝組織蛋白表達(dá)譜研究。利用Peptide IPGIEF良好的預(yù)分離能力和LTQ Orbitrap質(zhì)譜的高分辨能力，對(duì)大鼠肝臟組織全蛋白進(jìn)行鑒定分析，同時(shí)也對(duì)其乙酰化修飾進(jìn)行了鑒定。在大鼠鼠肝中共鑒定到2039個(gè)蛋白，其中鑒定到18個(gè)賴氨酸乙?；揎椀鞍准?8個(gè)賴氨基酸乙?；揎椢稽c(diǎn)。在鑒定到的乙?；鞍字?，包括4個(gè)新的乙?；鞍缀?個(gè)新的乙?；稽c(diǎn)，這些結(jié)果也為乙酰化蛋白研究提供了重要數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和方法參考。 同時(shí)，本研究對(duì)樣品分離富集，降低樣品的復(fù)雜度，提高蛋白的上樣量，為無(wú)合適抗體的蛋白質(zhì)分析奠定基礎(chǔ)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

等電聚焦儀；Protean II垂直電泳儀（BioRad公司）；真空冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司）；MilliQ超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；系統(tǒng)： Nano Aquity液相色譜（Waters公司），納升級(jí)LC20AD（島津公司）。LTQ Orbitrap質(zhì)譜儀（Thermo Fisher公司）。Peptide captrap C18色譜捕集柱 （2 mm×0.5 mm， Michrom公司）；Magic C18 AQ分析柱 （100 μm×150 mm，5 μm ，Michrom公司）。

pH 310 NL 18 cm IPG膠條， Ampholyte （GE Healthcare）； Trypsin （Proteomics Sequencing Grade Modified， Sigma公司）；蛋白酶抑制劑（Protease inhibitor cocktail，Roche公司）；TSA（Tocris Bioscience公司）；煙酰胺（US Biological公司）；其余試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)試劑分裝。色譜所用試劑均為HPLC級(jí)。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)主要流程見(jiàn)圖1： 首先提取鼠肝全蛋白，用胰蛋白酶進(jìn)行溶液酶解，得到的酶解肽段用18 cm 的pH 3～10 NL IPG 膠條進(jìn)行Peptide IPG IEF分離，分離完全后將膠條分割為18份，并用0.1%甲酸溶液分別提取肽段，提取的肽段溶液用LCMS/MS分離鑒定，最后將得到的蛋白進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

摘要 利用肽段固相膠條等電聚焦技術(shù)對(duì)大鼠鼠肝組織蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)分離，反相色譜分離所得預(yù)分離組分后，用LTQOrbitrap MS進(jìn)行分析。共鑒定到2039個(gè)蛋白質(zhì)，包括18個(gè)乙酰化蛋白，其中4個(gè)乙?；鞍孜幢粓?bào)道過(guò)。對(duì)這些蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，將肽段等電聚焦與LCMS/MS結(jié)合起來(lái)，是一種有效的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，適合于大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定分析。

關(guān)鍵詞 固相等電聚焦； 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用； 鼠肝蛋白質(zhì)

1引言

蛋白質(zhì)的分離與鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要內(nèi)容，但由于生物樣品的復(fù)雜性，在進(jìn)行蛋白鑒定分析前，往往需要預(yù)分離簡(jiǎn)化體系后再進(jìn)行鑒定分析。蛋白質(zhì)等電聚焦分離技術(shù)是一種有效的預(yù)分離方法，被用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，取得了很好的成果[1～5]。但蛋白質(zhì)的液相等電聚焦在研究中存在一些問(wèn)題，例如聚焦結(jié)束后需對(duì)分離的各組分蛋白質(zhì)分別酶解，溶液中pH值不穩(wěn)定，同時(shí)在線分析能力不強(qiáng)，所以科學(xué)家又發(fā)展了肽段固相等電聚焦的方法。

基于固相pH梯度（Immobilized pH gradients，IPG） 膠條的肽段等電聚焦分離技術(shù)（Peptide IPG IEF）是液相等電聚焦的重大發(fā)展。它利用傳統(tǒng)的2 DE分離儀器，在IPG 膠條上對(duì)肽段進(jìn)行等電聚焦分離。2008年，Hubner等[6]采用Peptide IPG IEF代替膠內(nèi)酶解技術(shù)，將其引入蛋白質(zhì)組學(xué)分析中。同年，Chick等[7]將Peptide IPGIEF與LCMS/MS聯(lián)用，分析了鼠肝中的膜蛋白，他們通過(guò)此方法共發(fā)現(xiàn)了1549個(gè)非冗余膜蛋白。 2009年，McQuade等[8]將Peptide IPGIEF與LCMS/MS聯(lián)用，分析了人類胚胎干細(xì)胞，這種技術(shù)提高了蛋白檢測(cè)的覆蓋率，是一種有效的蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程。 Peptide IPGIEF簡(jiǎn)便易行，上樣量大（mg級(jí)），同時(shí)膠條上pH值穩(wěn)定，并且對(duì)肽段的提取和后續(xù)處理非常簡(jiǎn)便，非常適合與LCMS/MS聯(lián)用，是一種非常有效的蛋白質(zhì)組學(xué)分離分析工具[7，9，10]。

本研究將Peptide IPG IEF分離分析技術(shù)運(yùn)用于復(fù)雜生物樣品——鼠肝組織蛋白表達(dá)譜研究。利用Peptide IPGIEF良好的預(yù)分離能力和LTQ Orbitrap質(zhì)譜的高分辨能力，對(duì)大鼠肝臟組織全蛋白進(jìn)行鑒定分析，同時(shí)也對(duì)其乙酰化修飾進(jìn)行了鑒定。在大鼠鼠肝中共鑒定到2039個(gè)蛋白，其中鑒定到18個(gè)賴氨酸乙?；揎椀鞍准?8個(gè)賴氨基酸乙?；揎椢稽c(diǎn)。在鑒定到的乙?；鞍字?，包括4個(gè)新的乙酰化蛋白和8個(gè)新的乙?；稽c(diǎn)，這些結(jié)果也為乙?；鞍籽芯刻峁┝酥匾獢?shù)據(jù)基礎(chǔ)和方法參考。 同時(shí)，本研究對(duì)樣品分離富集，降低樣品的復(fù)雜度，提高蛋白的上樣量，為無(wú)合適抗體的蛋白質(zhì)分析奠定基礎(chǔ)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

等電聚焦儀；Protean II垂直電泳儀（BioRad公司）；真空冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司）；MilliQ超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；系統(tǒng)： Nano Aquity液相色譜（Waters公司），納升級(jí)LC20AD（島津公司）。LTQ Orbitrap質(zhì)譜儀（Thermo Fisher公司）。Peptide captrap C18色譜捕集柱 （2 mm×0.5 mm， Michrom公司）；Magic C18 AQ分析柱 （100 μm×150 mm，5 μm ，Michrom公司）。

pH 310 NL 18 cm IPG膠條， Ampholyte （GE Healthcare）； Trypsin （Proteomics Sequencing Grade Modified， Sigma公司）；蛋白酶抑制劑（Protease inhibitor cocktail，Roche公司）；TSA（Tocris Bioscience公司）；煙酰胺（US Biological公司）；其余試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)試劑分裝。色譜所用試劑均為HPLC級(jí)。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)主要流程見(jiàn)圖1： 首先提取鼠肝全蛋白，用胰蛋白酶進(jìn)行溶液酶解，得到的酶解肽段用18 cm 的pH 3～10 NL IPG 膠條進(jìn)行Peptide IPG IEF分離，分離完全后將膠條分割為18份，并用0.1%甲酸溶液分別提取肽段，提取的肽段溶液用LCMS/MS分離鑒定，最后將得到的蛋白進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

摘要 利用肽段固相膠條等電聚焦技術(shù)對(duì)大鼠鼠肝組織蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)分離，反相色譜分離所得預(yù)分離組分后，用LTQOrbitrap MS進(jìn)行分析。共鑒定到2039個(gè)蛋白質(zhì)，包括18個(gè)乙酰化蛋白，其中4個(gè)乙酰化蛋白未被報(bào)道過(guò)。對(duì)這些蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，將肽段等電聚焦與LCMS/MS結(jié)合起來(lái)，是一種有效的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，適合于大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定分析。

關(guān)鍵詞 固相等電聚焦； 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用； 鼠肝蛋白質(zhì)

1引言

蛋白質(zhì)的分離與鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要內(nèi)容，但由于生物樣品的復(fù)雜性，在進(jìn)行蛋白鑒定分析前，往往需要預(yù)分離簡(jiǎn)化體系后再進(jìn)行鑒定分析。蛋白質(zhì)等電聚焦分離技術(shù)是一種有效的預(yù)分離方法，被用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，取得了很好的成果[1～5]。但蛋白質(zhì)的液相等電聚焦在研究中存在一些問(wèn)題，例如聚焦結(jié)束后需對(duì)分離的各組分蛋白質(zhì)分別酶解，溶液中pH值不穩(wěn)定，同時(shí)在線分析能力不強(qiáng)，所以科學(xué)家又發(fā)展了肽段固相等電聚焦的方法。

基于固相pH梯度（Immobilized pH gradients，IPG） 膠條的肽段等電聚焦分離技術(shù)（Peptide IPG IEF）是液相等電聚焦的重大發(fā)展。它利用傳統(tǒng)的2 DE分離儀器，在IPG 膠條上對(duì)肽段進(jìn)行等電聚焦分離。2008年，Hubner等[6]采用Peptide IPG IEF代替膠內(nèi)酶解技術(shù)，將其引入蛋白質(zhì)組學(xué)分析中。同年，Chick等[7]將Peptide IPGIEF與LCMS/MS聯(lián)用，分析了鼠肝中的膜蛋白，他們通過(guò)此方法共發(fā)現(xiàn)了1549個(gè)非冗余膜蛋白。 2009年，McQuade等[8]將Peptide IPGIEF與LCMS/MS聯(lián)用，分析了人類胚胎干細(xì)胞，這種技術(shù)提高了蛋白檢測(cè)的覆蓋率，是一種有效的蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程。 Peptide IPGIEF簡(jiǎn)便易行，上樣量大（mg級(jí)），同時(shí)膠條上pH值穩(wěn)定，并且對(duì)肽段的提取和后續(xù)處理非常簡(jiǎn)便，非常適合與LCMS/MS聯(lián)用，是一種非常有效的蛋白質(zhì)組學(xué)分離分析工具[7，9，10]。

本研究將Peptide IPG IEF分離分析技術(shù)運(yùn)用于復(fù)雜生物樣品——鼠肝組織蛋白表達(dá)譜研究。利用Peptide IPGIEF良好的預(yù)分離能力和LTQ Orbitrap質(zhì)譜的高分辨能力，對(duì)大鼠肝臟組織全蛋白進(jìn)行鑒定分析，同時(shí)也對(duì)其乙酰化修飾進(jìn)行了鑒定。在大鼠鼠肝中共鑒定到2039個(gè)蛋白，其中鑒定到18個(gè)賴氨酸乙?；揎椀鞍准?8個(gè)賴氨基酸乙酰化修飾位點(diǎn)。在鑒定到的乙?；鞍字?，包括4個(gè)新的乙?；鞍缀?個(gè)新的乙?；稽c(diǎn)，這些結(jié)果也為乙?；鞍籽芯刻峁┝酥匾獢?shù)據(jù)基礎(chǔ)和方法參考。 同時(shí)，本研究對(duì)樣品分離富集，降低樣品的復(fù)雜度，提高蛋白的上樣量，為無(wú)合適抗體的蛋白質(zhì)分析奠定基礎(chǔ)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

等電聚焦儀；Protean II垂直電泳儀（BioRad公司）；真空冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司）；MilliQ超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；系統(tǒng)： Nano Aquity液相色譜（Waters公司），納升級(jí)LC20AD（島津公司）。LTQ Orbitrap質(zhì)譜儀（Thermo Fisher公司）。Peptide captrap C18色譜捕集柱 （2 mm×0.5 mm， Michrom公司）；Magic C18 AQ分析柱 （100 μm×150 mm，5 μm ，Michrom公司）。

pH 310 NL 18 cm IPG膠條， Ampholyte （GE Healthcare）； Trypsin （Proteomics Sequencing Grade Modified， Sigma公司）；蛋白酶抑制劑（Protease inhibitor cocktail，Roche公司）；TSA（Tocris Bioscience公司）；煙酰胺（US Biological公司）；其余試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)試劑分裝。色譜所用試劑均為HPLC級(jí)。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)主要流程見(jiàn)圖1： 首先提取鼠肝全蛋白，用胰蛋白酶進(jìn)行溶液酶解，得到的酶解肽段用18 cm 的pH 3～10 NL IPG 膠條進(jìn)行Peptide IPG IEF分離，分離完全后將膠條分割為18份，并用0.1%甲酸溶液分別提取肽段，提取的肽段溶液用LCMS/MS分離鑒定，最后將得到的蛋白進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。