劉珂珂等

摘要 研制了一種基于聚（3，4乙烯二氧噻吩）（PEDOT）與天青Ⅰ（Azure Ⅰ）為基體的電化學(xué)免疫傳感器，可靈敏檢測(cè)甲胎蛋白（AFP）。在鉑盤(pán)電極表面，電化學(xué)聚合PEDOT為基體，利用靜電組裝技術(shù)固定Azure Ⅰ和納米金顆粒（nanoAus），將甲胎蛋白抗體（antiAFP）組裝到nanoAus的表面。采用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）封閉非特異性吸附位點(diǎn)，制得電流型AFP免疫傳感器。采用循環(huán)伏安、掃描電鏡技術(shù)研究組裝過(guò)程及電極性質(zhì)，探討了影響免疫傳感器性能的因素。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，電極響應(yīng)與AFP的濃度在0.01～120 μg/L的范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，檢出限為0.003 μg/L。取臨床血清樣品用本方法檢測(cè)AFP含量，得到的結(jié)果與臨床常用的ELISA法得到的結(jié)果無(wú)顯著性差異。

關(guān)鍵詞 聚（3，4乙烯二氧噻吩）； 電化學(xué)免疫傳感器； 甲胎蛋白； 天青Ⅰ

1引言

血清中甲胎蛋白（AFP）的含量是臨床用于原發(fā)性肝癌和畸胎瘤的早期診斷、療效觀察和愈后判斷的重要指標(biāo)。目前，臨床用于AFP檢測(cè)的方法有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、放射免疫測(cè)定法、化學(xué)發(fā)光法、熒光免疫法等[1，2]，但存在靈敏度不高、步驟繁瑣或者放射性危害等不足。電流型免疫傳感器將電化學(xué)檢測(cè)與ELISA的特點(diǎn)結(jié)合，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、干擾少等特點(diǎn)。在電化學(xué)免疫分析中，標(biāo)記抗體的數(shù)量直接影響免疫傳感器的靈敏度[3～6]。因此， 開(kāi)發(fā)新型的抗體標(biāo)記材料，增加抗體的負(fù)載量，是提高免疫傳感器靈敏度的關(guān)鍵。

聚（3，4乙烯二氧噻吩）（PEDOT）是一類(lèi)功能高分子，可直接用做電極功能基質(zhì)膜[7，8]。天青Ⅰ（Azure Ⅰ）作為一種生物染料，是一種比較活潑的電子轉(zhuǎn)移體 [9，10]?；谝陨显恚緦?shí)驗(yàn)研究了PEDOTAzure Ⅰ納米復(fù)合物、納米金（nanoAus）共修飾于鉑盤(pán)電極表面固定甲胎蛋白抗體（antiAFP）的電流型免疫傳感器。該免疫傳感器基于PEDOT與Azure Ⅰ的協(xié)同效應(yīng)，促進(jìn)酶活性中心與電極表面的電子傳遞；同時(shí)，基于靜電吸附的原理將帶負(fù)電荷的nanoAus固定在PEDOT/Azure Ⅰ復(fù)合物表面，固定antiAFP；用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）代替常用的牛血清蛋白（BSA）封閉非特異性吸附位點(diǎn)。由于PEDOT具有疏松多孔的納米結(jié)構(gòu)，可有效增大電極的比表面積，增加抗體的固載量；同時(shí)HRP對(duì)H2O2有電催化作用，可擴(kuò)增電流響應(yīng)，這種納米技術(shù)增強(qiáng)與酶催化底物信號(hào)增強(qiáng)的聯(lián)用，可實(shí)現(xiàn)信號(hào)雙重放大，制得高靈敏的電化學(xué)免疫傳感器。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

CHI 660B電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司），S4800 掃描電子顯微鏡（Hitachi公司）。

EDOT（純度>97%，Bayer AG）。Azure Ⅰ（Coleman & Bell公司）， AFP試劑盒（鄭州博賽生物技術(shù)研究所），HRP（Sigma公司），H2O2（30%， w/V，上?；瘜W(xué)試劑公司）。[Bmim]BF4（>99%，蘭州綠色化學(xué)與催化中心），氯金酸（Sigma公司）。其它試劑均為分析純。

nanoAus在100 ℃的溫度下還原氯金酸制得[11]，電鏡結(jié)構(gòu)表征其平均粒徑為16 nm。所有溶液均采用超純水配制。

2.2免疫傳感器的制備

鉑盤(pán)電極（=1 mm）經(jīng)氧化鋁粉末拋光成鏡面，超純水沖洗，然后依次用乙醇和超純水超聲清洗，氮?dú)獯蹈?。清洗好的電極浸入含有0.1 mol/L EDOT的[Bmim]BF4中，+1.25 V （vs Ag wire）的工作電位恒電位電聚合得到藍(lán)色的PEDOT薄膜，用超純水洗凈；取2 μL 5% Azure Ⅰ溶液滴涂于修飾電極表面，晾干后，洗去結(jié)合不夠穩(wěn)定的的Azure Ⅰ，浸入nanoAus溶液中浸泡8 h；將該修飾電極置于30 μL 含有0.25 mg/mL antiAFP的0.05 mol/L PBS溶液（pH 7.4）中，于4 ℃放置過(guò)夜；用pH 7.4的PBS溶液洗凈，浸入含0.4 mg/mL HRP的0.05 mol/L PBS溶液（pH 7.4）中，4 ℃放置4 h。將制備好的電極在4 ℃下保存?zhèn)溆?。該免疫傳感器的制備過(guò)程見(jiàn)圖1。

2.3免疫傳感器的檢測(cè)原理及方法

通過(guò)對(duì)免疫傳感器與待測(cè)抗原發(fā)生特異性結(jié)合前后的電流變化值來(lái)對(duì)抗原進(jìn)行定量分析。當(dāng)待測(cè)抗原與抗體特異性結(jié)合后，生成的免疫復(fù)合物阻礙了H2O2靠近酶催化中，響應(yīng)電流下降，電流下降值會(huì)隨著抗原濃度的增加而增大。

電化學(xué)免疫傳感器的檢測(cè)采用循環(huán)伏安法（CV），以免疫電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑片為對(duì)電極。每次實(shí)驗(yàn)前通氮?dú)?0 min，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程保持在氮?dú)夥諊?。掃描電位?0.6～0.3 V，掃速為50 mV/s。免疫測(cè)定時(shí)，將修飾有抗體的工作電極置于不同濃度的抗原溶液中孵育20 min（25 ℃），然后取出，用0.05 mol/L PBS溶液（pH 7.4）洗凈，浸入含有2.5 mmol/L H2O2的PBS溶液（0.1 mol/L， pH 6.5）中，進(jìn)行CV實(shí)驗(yàn)。

3結(jié)果與討論

3.1免疫傳感器的電化學(xué)表征

用CV法研究了電極在不同修飾狀態(tài)下的電化學(xué)行為（圖2）。從圖2可知，當(dāng)鉑電極表面電聚合修飾一層PEDOT薄膜后，循環(huán)伏安電流明顯增加（曲線(xiàn)b），說(shuō)明在離子液體電解液中聚合得到的PEDOT具有良好的電子傳遞性能[12，13]。當(dāng)修飾了一層Azure Ⅰ后，電極呈現(xiàn)一對(duì)峰形良好的氧化還原峰（曲線(xiàn)c），說(shuō)明Azure Ⅰ在電極表面形成了很好的導(dǎo)電膜。當(dāng)nanoAus修飾在電極上后，氧化還原峰電流進(jìn)一步增大（曲線(xiàn)d），這是由于nanoAus的電子通道作用，有助于電極表面電子的傳輸。當(dāng)antiAFP（曲線(xiàn)e）進(jìn)一步修飾在電極上，由于蛋白的絕緣性，阻礙電子的傳輸，氧化還原峰電流明顯下降。最后，用HRP封閉電極上的活性位點(diǎn)，氧化還原峰電流進(jìn)一步減?。ㄇ€(xiàn)f）。

3.2免疫傳感器的形貌表征

采用掃描電鏡（SEM）技術(shù)對(duì)組裝過(guò)程進(jìn)行了形貌表征。圖3為不同修飾電極的SEM圖。從圖3a可見(jiàn)，離子液體中聚合得到的PEDOT具有疏松多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這是由于離子液體較高的粘度，降低了單體的擴(kuò)散速率，從而有助于形成多層的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[14]。該材料具有較大的比表面積，可有效增加電極的比表面積，提高電活性物質(zhì)Azure Ⅰ和antiAFP的固載量，加快電活性物質(zhì)與電極之間的電子傳遞，提高免疫傳感器的靈敏度。經(jīng)AzureⅠ修飾后，整個(gè)表面交聯(lián)形成一個(gè)比較致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖3b）。當(dāng)nanoAus修飾到電極表面，可以觀察到表面覆蓋了一層粒徑為10Symbolm@@ 8 m的顆粒（圖3c）。 antiAFP被吸附到修飾電極上時(shí)由于蛋白的絕緣性，其表面變得模糊，表明antiAFP已成功修飾到電極表面（圖3d）。

3.3免疫傳感器的催化特性

修飾在電極表面的HRP具有兩方面作用，一是封閉電極表面未被占據(jù)的活性點(diǎn)，避免非特異性反應(yīng)；二是基于HRP對(duì)H2O2的催化作用來(lái)放大免疫反應(yīng)信號(hào)。圖4a為修飾電極在pH 6.5的PBS中添加以及未添加H2O2的CV圖。當(dāng)溶液中不含有H2O2時(shí)，曲線(xiàn)2出現(xiàn)一對(duì)Azure Ⅰ的氧化還原峰；當(dāng)加入2.5 mmol/L H2O2后（曲線(xiàn)1），氧化電流減小，還原峰電流從2.3 μA增加到3.7 μA，說(shuō)明采用HRP代替BSA封閉活性位點(diǎn)的同時(shí)還可以放大電流信號(hào)[9]。

摘要 研制了一種基于聚（3，4乙烯二氧噻吩）（PEDOT）與天青Ⅰ（Azure Ⅰ）為基體的電化學(xué)免疫傳感器，可靈敏檢測(cè)甲胎蛋白（AFP）。在鉑盤(pán)電極表面，電化學(xué)聚合PEDOT為基體，利用靜電組裝技術(shù)固定Azure Ⅰ和納米金顆粒（nanoAus），將甲胎蛋白抗體（antiAFP）組裝到nanoAus的表面。采用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）封閉非特異性吸附位點(diǎn)，制得電流型AFP免疫傳感器。采用循環(huán)伏安、掃描電鏡技術(shù)研究組裝過(guò)程及電極性質(zhì)，探討了影響免疫傳感器性能的因素。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，電極響應(yīng)與AFP的濃度在0.01～120 μg/L的范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，檢出限為0.003 μg/L。取臨床血清樣品用本方法檢測(cè)AFP含量，得到的結(jié)果與臨床常用的ELISA法得到的結(jié)果無(wú)顯著性差異。

關(guān)鍵詞 聚（3，4乙烯二氧噻吩）； 電化學(xué)免疫傳感器； 甲胎蛋白； 天青Ⅰ

1引言

血清中甲胎蛋白（AFP）的含量是臨床用于原發(fā)性肝癌和畸胎瘤的早期診斷、療效觀察和愈后判斷的重要指標(biāo)。目前，臨床用于AFP檢測(cè)的方法有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、放射免疫測(cè)定法、化學(xué)發(fā)光法、熒光免疫法等[1，2]，但存在靈敏度不高、步驟繁瑣或者放射性危害等不足。電流型免疫傳感器將電化學(xué)檢測(cè)與ELISA的特點(diǎn)結(jié)合，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、干擾少等特點(diǎn)。在電化學(xué)免疫分析中，標(biāo)記抗體的數(shù)量直接影響免疫傳感器的靈敏度[3～6]。因此， 開(kāi)發(fā)新型的抗體標(biāo)記材料，增加抗體的負(fù)載量，是提高免疫傳感器靈敏度的關(guān)鍵。

聚（3，4乙烯二氧噻吩）（PEDOT）是一類(lèi)功能高分子，可直接用做電極功能基質(zhì)膜[7，8]。天青Ⅰ（Azure Ⅰ）作為一種生物染料，是一種比較活潑的電子轉(zhuǎn)移體 [9，10]?；谝陨显?，本實(shí)驗(yàn)研究了PEDOTAzure Ⅰ納米復(fù)合物、納米金（nanoAus）共修飾于鉑盤(pán)電極表面固定甲胎蛋白抗體（antiAFP）的電流型免疫傳感器。該免疫傳感器基于PEDOT與Azure Ⅰ的協(xié)同效應(yīng)，促進(jìn)酶活性中心與電極表面的電子傳遞；同時(shí)，基于靜電吸附的原理將帶負(fù)電荷的nanoAus固定在PEDOT/Azure Ⅰ復(fù)合物表面，固定antiAFP；用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）代替常用的牛血清蛋白（BSA）封閉非特異性吸附位點(diǎn)。由于PEDOT具有疏松多孔的納米結(jié)構(gòu)，可有效增大電極的比表面積，增加抗體的固載量；同時(shí)HRP對(duì)H2O2有電催化作用，可擴(kuò)增電流響應(yīng)，這種納米技術(shù)增強(qiáng)與酶催化底物信號(hào)增強(qiáng)的聯(lián)用，可實(shí)現(xiàn)信號(hào)雙重放大，制得高靈敏的電化學(xué)免疫傳感器。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

CHI 660B電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司），S4800 掃描電子顯微鏡（Hitachi公司）。

EDOT（純度>97%，Bayer AG）。Azure Ⅰ（Coleman & Bell公司）， AFP試劑盒（鄭州博賽生物技術(shù)研究所），HRP（Sigma公司），H2O2（30%， w/V，上海化學(xué)試劑公司）。[Bmim]BF4（>99%，蘭州綠色化學(xué)與催化中心），氯金酸（Sigma公司）。其它試劑均為分析純。

nanoAus在100 ℃的溫度下還原氯金酸制得[11]，電鏡結(jié)構(gòu)表征其平均粒徑為16 nm。所有溶液均采用超純水配制。

2.2免疫傳感器的制備

鉑盤(pán)電極（=1 mm）經(jīng)氧化鋁粉末拋光成鏡面，超純水沖洗，然后依次用乙醇和超純水超聲清洗，氮?dú)獯蹈?。清洗好的電極浸入含有0.1 mol/L EDOT的[Bmim]BF4中，+1.25 V （vs Ag wire）的工作電位恒電位電聚合得到藍(lán)色的PEDOT薄膜，用超純水洗凈；取2 μL 5% Azure Ⅰ溶液滴涂于修飾電極表面，晾干后，洗去結(jié)合不夠穩(wěn)定的的Azure Ⅰ，浸入nanoAus溶液中浸泡8 h；將該修飾電極置于30 μL 含有0.25 mg/mL antiAFP的0.05 mol/L PBS溶液（pH 7.4）中，于4 ℃放置過(guò)夜；用pH 7.4的PBS溶液洗凈，浸入含0.4 mg/mL HRP的0.05 mol/L PBS溶液（pH 7.4）中，4 ℃放置4 h。將制備好的電極在4 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｔ撁庖邆鞲衅鞯闹苽溥^(guò)程見(jiàn)圖1。

2.3免疫傳感器的檢測(cè)原理及方法

通過(guò)對(duì)免疫傳感器與待測(cè)抗原發(fā)生特異性結(jié)合前后的電流變化值來(lái)對(duì)抗原進(jìn)行定量分析。當(dāng)待測(cè)抗原與抗體特異性結(jié)合后，生成的免疫復(fù)合物阻礙了H2O2靠近酶催化中，響應(yīng)電流下降，電流下降值會(huì)隨著抗原濃度的增加而增大。

電化學(xué)免疫傳感器的檢測(cè)采用循環(huán)伏安法（CV），以免疫電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑片為對(duì)電極。每次實(shí)驗(yàn)前通氮?dú)?0 min，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程保持在氮?dú)夥諊?。掃描電位?0.6～0.3 V，掃速為50 mV/s。免疫測(cè)定時(shí)，將修飾有抗體的工作電極置于不同濃度的抗原溶液中孵育20 min（25 ℃），然后取出，用0.05 mol/L PBS溶液（pH 7.4）洗凈，浸入含有2.5 mmol/L H2O2的PBS溶液（0.1 mol/L， pH 6.5）中，進(jìn)行CV實(shí)驗(yàn)。

3結(jié)果與討論

3.1免疫傳感器的電化學(xué)表征

用CV法研究了電極在不同修飾狀態(tài)下的電化學(xué)行為（圖2）。從圖2可知，當(dāng)鉑電極表面電聚合修飾一層PEDOT薄膜后，循環(huán)伏安電流明顯增加（曲線(xiàn)b），說(shuō)明在離子液體電解液中聚合得到的PEDOT具有良好的電子傳遞性能[12，13]。當(dāng)修飾了一層Azure Ⅰ后，電極呈現(xiàn)一對(duì)峰形良好的氧化還原峰（曲線(xiàn)c），說(shuō)明Azure Ⅰ在電極表面形成了很好的導(dǎo)電膜。當(dāng)nanoAus修飾在電極上后，氧化還原峰電流進(jìn)一步增大（曲線(xiàn)d），這是由于nanoAus的電子通道作用，有助于電極表面電子的傳輸。當(dāng)antiAFP（曲線(xiàn)e）進(jìn)一步修飾在電極上，由于蛋白的絕緣性，阻礙電子的傳輸，氧化還原峰電流明顯下降。最后，用HRP封閉電極上的活性位點(diǎn)，氧化還原峰電流進(jìn)一步減?。ㄇ€(xiàn)f）。

3.2免疫傳感器的形貌表征

采用掃描電鏡（SEM）技術(shù)對(duì)組裝過(guò)程進(jìn)行了形貌表征。圖3為不同修飾電極的SEM圖。從圖3a可見(jiàn)，離子液體中聚合得到的PEDOT具有疏松多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這是由于離子液體較高的粘度，降低了單體的擴(kuò)散速率，從而有助于形成多層的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[14]。該材料具有較大的比表面積，可有效增加電極的比表面積，提高電活性物質(zhì)Azure Ⅰ和antiAFP的固載量，加快電活性物質(zhì)與電極之間的電子傳遞，提高免疫傳感器的靈敏度。經(jīng)AzureⅠ修飾后，整個(gè)表面交聯(lián)形成一個(gè)比較致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖3b）。當(dāng)nanoAus修飾到電極表面，可以觀察到表面覆蓋了一層粒徑為10Symbolm@@ 8 m的顆粒（圖3c）。 antiAFP被吸附到修飾電極上時(shí)由于蛋白的絕緣性，其表面變得模糊，表明antiAFP已成功修飾到電極表面（圖3d）。

3.3免疫傳感器的催化特性

修飾在電極表面的HRP具有兩方面作用，一是封閉電極表面未被占據(jù)的活性點(diǎn)，避免非特異性反應(yīng)；二是基于HRP對(duì)H2O2的催化作用來(lái)放大免疫反應(yīng)信號(hào)。圖4a為修飾電極在pH 6.5的PBS中添加以及未添加H2O2的CV圖。當(dāng)溶液中不含有H2O2時(shí)，曲線(xiàn)2出現(xiàn)一對(duì)Azure Ⅰ的氧化還原峰；當(dāng)加入2.5 mmol/L H2O2后（曲線(xiàn)1），氧化電流減小，還原峰電流從2.3 μA增加到3.7 μA，說(shuō)明采用HRP代替BSA封閉活性位點(diǎn)的同時(shí)還可以放大電流信號(hào)[9]。

摘要 研制了一種基于聚（3，4乙烯二氧噻吩）（PEDOT）與天青Ⅰ（Azure Ⅰ）為基體的電化學(xué)免疫傳感器，可靈敏檢測(cè)甲胎蛋白（AFP）。在鉑盤(pán)電極表面，電化學(xué)聚合PEDOT為基體，利用靜電組裝技術(shù)固定Azure Ⅰ和納米金顆粒（nanoAus），將甲胎蛋白抗體（antiAFP）組裝到nanoAus的表面。采用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）封閉非特異性吸附位點(diǎn)，制得電流型AFP免疫傳感器。采用循環(huán)伏安、掃描電鏡技術(shù)研究組裝過(guò)程及電極性質(zhì)，探討了影響免疫傳感器性能的因素。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，電極響應(yīng)與AFP的濃度在0.01～120 μg/L的范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，檢出限為0.003 μg/L。取臨床血清樣品用本方法檢測(cè)AFP含量，得到的結(jié)果與臨床常用的ELISA法得到的結(jié)果無(wú)顯著性差異。

關(guān)鍵詞 聚（3，4乙烯二氧噻吩）； 電化學(xué)免疫傳感器； 甲胎蛋白； 天青Ⅰ

1引言

血清中甲胎蛋白（AFP）的含量是臨床用于原發(fā)性肝癌和畸胎瘤的早期診斷、療效觀察和愈后判斷的重要指標(biāo)。目前，臨床用于AFP檢測(cè)的方法有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、放射免疫測(cè)定法、化學(xué)發(fā)光法、熒光免疫法等[1，2]，但存在靈敏度不高、步驟繁瑣或者放射性危害等不足。電流型免疫傳感器將電化學(xué)檢測(cè)與ELISA的特點(diǎn)結(jié)合，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、干擾少等特點(diǎn)。在電化學(xué)免疫分析中，標(biāo)記抗體的數(shù)量直接影響免疫傳感器的靈敏度[3～6]。因此， 開(kāi)發(fā)新型的抗體標(biāo)記材料，增加抗體的負(fù)載量，是提高免疫傳感器靈敏度的關(guān)鍵。

聚（3，4乙烯二氧噻吩）（PEDOT）是一類(lèi)功能高分子，可直接用做電極功能基質(zhì)膜[7，8]。天青Ⅰ（Azure Ⅰ）作為一種生物染料，是一種比較活潑的電子轉(zhuǎn)移體 [9，10]?；谝陨显?，本實(shí)驗(yàn)研究了PEDOTAzure Ⅰ納米復(fù)合物、納米金（nanoAus）共修飾于鉑盤(pán)電極表面固定甲胎蛋白抗體（antiAFP）的電流型免疫傳感器。該免疫傳感器基于PEDOT與Azure Ⅰ的協(xié)同效應(yīng)，促進(jìn)酶活性中心與電極表面的電子傳遞；同時(shí)，基于靜電吸附的原理將帶負(fù)電荷的nanoAus固定在PEDOT/Azure Ⅰ復(fù)合物表面，固定antiAFP；用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）代替常用的牛血清蛋白（BSA）封閉非特異性吸附位點(diǎn)。由于PEDOT具有疏松多孔的納米結(jié)構(gòu)，可有效增大電極的比表面積，增加抗體的固載量；同時(shí)HRP對(duì)H2O2有電催化作用，可擴(kuò)增電流響應(yīng)，這種納米技術(shù)增強(qiáng)與酶催化底物信號(hào)增強(qiáng)的聯(lián)用，可實(shí)現(xiàn)信號(hào)雙重放大，制得高靈敏的電化學(xué)免疫傳感器。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

CHI 660B電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司），S4800 掃描電子顯微鏡（Hitachi公司）。

EDOT（純度>97%，Bayer AG）。Azure Ⅰ（Coleman & Bell公司）， AFP試劑盒（鄭州博賽生物技術(shù)研究所），HRP（Sigma公司），H2O2（30%， w/V，上海化學(xué)試劑公司）。[Bmim]BF4（>99%，蘭州綠色化學(xué)與催化中心），氯金酸（Sigma公司）。其它試劑均為分析純。

nanoAus在100 ℃的溫度下還原氯金酸制得[11]，電鏡結(jié)構(gòu)表征其平均粒徑為16 nm。所有溶液均采用超純水配制。

2.2免疫傳感器的制備

鉑盤(pán)電極（=1 mm）經(jīng)氧化鋁粉末拋光成鏡面，超純水沖洗，然后依次用乙醇和超純水超聲清洗，氮?dú)獯蹈伞Ｇ逑春玫碾姌O浸入含有0.1 mol/L EDOT的[Bmim]BF4中，+1.25 V （vs Ag wire）的工作電位恒電位電聚合得到藍(lán)色的PEDOT薄膜，用超純水洗凈；取2 μL 5% Azure Ⅰ溶液滴涂于修飾電極表面，晾干后，洗去結(jié)合不夠穩(wěn)定的的Azure Ⅰ，浸入nanoAus溶液中浸泡8 h；將該修飾電極置于30 μL 含有0.25 mg/mL antiAFP的0.05 mol/L PBS溶液（pH 7.4）中，于4 ℃放置過(guò)夜；用pH 7.4的PBS溶液洗凈，浸入含0.4 mg/mL HRP的0.05 mol/L PBS溶液（pH 7.4）中，4 ℃放置4 h。將制備好的電極在4 ℃下保存?zhèn)溆?。該免疫傳感器的制備過(guò)程見(jiàn)圖1。

2.3免疫傳感器的檢測(cè)原理及方法

通過(guò)對(duì)免疫傳感器與待測(cè)抗原發(fā)生特異性結(jié)合前后的電流變化值來(lái)對(duì)抗原進(jìn)行定量分析。當(dāng)待測(cè)抗原與抗體特異性結(jié)合后，生成的免疫復(fù)合物阻礙了H2O2靠近酶催化中，響應(yīng)電流下降，電流下降值會(huì)隨著抗原濃度的增加而增大。

電化學(xué)免疫傳感器的檢測(cè)采用循環(huán)伏安法（CV），以免疫電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑片為對(duì)電極。每次實(shí)驗(yàn)前通氮?dú)?0 min，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程保持在氮?dú)夥諊?。掃描電位?0.6～0.3 V，掃速為50 mV/s。免疫測(cè)定時(shí)，將修飾有抗體的工作電極置于不同濃度的抗原溶液中孵育20 min（25 ℃），然后取出，用0.05 mol/L PBS溶液（pH 7.4）洗凈，浸入含有2.5 mmol/L H2O2的PBS溶液（0.1 mol/L， pH 6.5）中，進(jìn)行CV實(shí)驗(yàn)。

3結(jié)果與討論

3.1免疫傳感器的電化學(xué)表征

用CV法研究了電極在不同修飾狀態(tài)下的電化學(xué)行為（圖2）。從圖2可知，當(dāng)鉑電極表面電聚合修飾一層PEDOT薄膜后，循環(huán)伏安電流明顯增加（曲線(xiàn)b），說(shuō)明在離子液體電解液中聚合得到的PEDOT具有良好的電子傳遞性能[12，13]。當(dāng)修飾了一層Azure Ⅰ后，電極呈現(xiàn)一對(duì)峰形良好的氧化還原峰（曲線(xiàn)c），說(shuō)明Azure Ⅰ在電極表面形成了很好的導(dǎo)電膜。當(dāng)nanoAus修飾在電極上后，氧化還原峰電流進(jìn)一步增大（曲線(xiàn)d），這是由于nanoAus的電子通道作用，有助于電極表面電子的傳輸。當(dāng)antiAFP（曲線(xiàn)e）進(jìn)一步修飾在電極上，由于蛋白的絕緣性，阻礙電子的傳輸，氧化還原峰電流明顯下降。最后，用HRP封閉電極上的活性位點(diǎn)，氧化還原峰電流進(jìn)一步減小（曲線(xiàn)f）。

3.2免疫傳感器的形貌表征

采用掃描電鏡（SEM）技術(shù)對(duì)組裝過(guò)程進(jìn)行了形貌表征。圖3為不同修飾電極的SEM圖。從圖3a可見(jiàn)，離子液體中聚合得到的PEDOT具有疏松多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這是由于離子液體較高的粘度，降低了單體的擴(kuò)散速率，從而有助于形成多層的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[14]。該材料具有較大的比表面積，可有效增加電極的比表面積，提高電活性物質(zhì)Azure Ⅰ和antiAFP的固載量，加快電活性物質(zhì)與電極之間的電子傳遞，提高免疫傳感器的靈敏度。經(jīng)AzureⅠ修飾后，整個(gè)表面交聯(lián)形成一個(gè)比較致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖3b）。當(dāng)nanoAus修飾到電極表面，可以觀察到表面覆蓋了一層粒徑為10Symbolm@@ 8 m的顆粒（圖3c）。 antiAFP被吸附到修飾電極上時(shí)由于蛋白的絕緣性，其表面變得模糊，表明antiAFP已成功修飾到電極表面（圖3d）。

3.3免疫傳感器的催化特性

修飾在電極表面的HRP具有兩方面作用，一是封閉電極表面未被占據(jù)的活性點(diǎn)，避免非特異性反應(yīng)；二是基于HRP對(duì)H2O2的催化作用來(lái)放大免疫反應(yīng)信號(hào)。圖4a為修飾電極在pH 6.5的PBS中添加以及未添加H2O2的CV圖。當(dāng)溶液中不含有H2O2時(shí)，曲線(xiàn)2出現(xiàn)一對(duì)Azure Ⅰ的氧化還原峰；當(dāng)加入2.5 mmol/L H2O2后（曲線(xiàn)1），氧化電流減小，還原峰電流從2.3 μA增加到3.7 μA，說(shuō)明采用HRP代替BSA封閉活性位點(diǎn)的同時(shí)還可以放大電流信號(hào)[9]。