張麗娟，張 欣

吖啶類熒光探針與蛋白質相互作用的研究

張麗娟，張 欣

（福建生物工程職業(yè)技術學院藥學系，福建福州350002）

文章研究3種新型吖啶類熒光探針（N-（2-二甲氨基）乙基-9-氯吖啶-4-甲酰胺（NCAF）、9-[（N-2-二甲氨乙基）吖啶-4-甲酰胺]-α-丙氨酸（NAFA）和4,9-二[N-（2-二甲氨基）乙基]-9-吖啶胺-4-甲酰胺（DNAF））與牛血清白蛋白（BSA）的相互結合作用機理。分別對3種吖啶類探針自聚集情況、與牛血清白蛋白結合常數(shù)KA和結合位點數(shù)n、熱力學參數(shù)H、G以及S、能量轉移效率E和結合距離R0進行比較，并對實驗數(shù)據(jù)進行分析。研究了3種吖啶類探針對蛋白質內源熒光猝滅的猝滅機制和主要作用力類型，為進一步研究新的生物探針及其在生物大分子識別分析應用提供了一定的實驗和理論支持。

吖啶類熒光探針；蛋白質；相互作用

目前，研究蛋白質分子探針是生物化學中的熱點之一。吖啶類衍生物具有良好的發(fā)光效應，是一類很有前途的生物探針。吖啶-4-甲酰胺衍生物探針在國內外的應用研究較少，開展這方面的研究對于拓展吖啶類熒光探針的應用范圍，開發(fā)性能更優(yōu)良的生物大分子熒光探針具有重要意義。以下是3種新合成的吖啶類熒光染料探針，以4-羧基吖啶酮為母體，在4位上引入N-（2-二甲氨基）乙基，合成了N-（2-二甲氨基）乙基-9-氯吖啶-4-甲酰胺（NCAF），結構簡單，具有3個平面六元環(huán)共軛結構；在此基礎上，通過在9位上引入支鏈α-丙氨酸，合成了9-[（N-2-二甲氨乙基）吖啶-4-甲酰胺]-α-丙氨酸（NAFA），大大改善了吖啶類化合物與生物大分子的親和性；通過在9位上引入N-（2-二甲氨基）乙基，合成了4,9-二[N-（2-二甲氨基）乙基]-9-吖啶胺-4-甲酰胺（DNAF），強化分子正電性，且不受體系酸度影響[1]。本文基于吖啶類探針的良好生物活性和發(fā)光性能，在新型吖啶類探針與牛血清白蛋白（簡寫B(tài)SA）相互作用方面進行研究探索。

1 儀器與試劑

Varian Cary Eclipse熒光光譜儀（美國VARIAN）；Perkin-Elmer Lambda 800紫外-可見分光光度計（美國）；PHS-3C型酸度計（上海大普儀器有限公司）。

NCAF由實驗室自制，配成3.0×10-4mol·L-1的儲備液（水∶CH2Cl2∶CH3OH=98∶1∶1），4℃條件下避光保存；NAFA（實驗室自制，配成1.5×10-4mol· L-1儲備液，4℃條件下避光保存）；DNAF（實驗室自制，配成3.0×10-4mol·L-1儲備液，4℃條件下避光保存）；牛血清白蛋白（BSA）（Sanland-chem Internation Inc.配成含0.1mol·L-1NaCl的1.0×10-4mol·L-1儲備液，保存于4℃避光條件下）；Tris-HCl緩沖溶液（pH值為7.0）；所用試劑均為生化純與分析純，實驗用水均為二次去離子水。

2 實驗方法

在一系列5mL刻度試管中加入pH值為7.0的Tris-HCl緩沖溶液2.0mL，0.5mLBSA（1.0×10-4mol· L-1）溶液，不同體積的NCAF（3.0×10-4mol·L-1）溶液，用水稀釋至刻度，搖勻，分別在不同溫度下，測定BSA的熒光光譜，激發(fā)波長280nm，發(fā)射波長290～500nm，狹縫寬度均為5nm。同理NAFA和DNAF分別用上述同樣方法測定BSA的熒光光譜。

3 結果與討論

3.1 NCAF、NAFA、DNAF三者光譜性質與自聚集情況比較

圖1為NCAF、NAFA、DNAF 3種熒光染料探針的熒光發(fā)射光譜比較。

圖1 NCAF、NAFA、DNAF的熒光發(fā)射光譜Fig.1 The fluorescence emission spectra of NCAF and NAFA and DNAF.

由圖1可以看出，隨著9位上α-丙氨酸或N-（2-二甲氨基）乙基側鏈基團的引入，吖啶-4-甲酰胺衍生物的熒光量子產率得以提高，表現(xiàn)為相同濃度下的熒光強度的大幅提升，推測這是環(huán)外氨基上的電子激發(fā)轉移到環(huán)上，由于它們的孤對電子的電子云幾乎與芳環(huán)上的π軌道成平行，因而實際上它們共享了共軛π電子結構，擴大了其共軛體系，因此，熒光效率也提高許多。而修飾N-（2-二甲氨基）乙基的效果要遠好于β-丙氨酸，這是N-（2-二甲氨基）乙基較強的供電子作用所致；另一方面，由于α-丙氨酸連接有-COOH，這類取代基主要以吸電子作用為主，可能導致芳環(huán)共享共軛π鍵或擴大的共軛π鍵的電子云密度降低，因此熒光強度受到一定削弱[2]。

表1 NCAF、NAFA、DNAF發(fā)生自聚集猝滅的濃度Tab.1 Concentration of fluorescence self-quenching for NCAF and NAFA and DNAF

圖1的熒光光譜及表1熒光體聚集自猝滅情況比較顯示，從NCAF，NAFA到DNAF，發(fā)生二聚體自聚集熒光猝滅的染料濃度逐漸增大，這是由于染料表面電荷排斥力和側鏈基團空間位阻加大，使發(fā)生自聚集的可能性下降的緣故。同時，NCAF的二聚體熒光峰波長小于單體熒光峰波長，而NAFA與DNAF的二聚體熒光峰波長大于單體熒光峰波長，推測也是由于側鏈基團空間位阻加大，傾向于形成頭對頭的J-聚集形態(tài)，而非面對面的H-聚集形態(tài)。

3.2 NCAF、NAFA、DNAF三者結合常數(shù)與結合位點數(shù)比較

圖2為牛血清白蛋白溶液體系中，隨著NCAF濃度的增加，BSA的熒光猝滅譜圖。343nm左右為BSA的熒光猝滅情況，455nm處為在BSA作用下的不同濃度的NCAF的熒光增強情況。

λex=280nm,狹縫寬度5 nm,pH=7.0,T=288K.

由圖2得到的343nm處的實驗數(shù)據(jù)進一步應用式log[（F0-F）/F]=logKA+nlog[Q][3]（1）處理，得到圖3，在NCAF由低到高的整個濃度范圍都呈現(xiàn)良好的線性，其相關系數(shù)R2=0.9983，與式（1）吻合良好，表明這一過程屬于靜態(tài)猝滅過程。由所得的直線求算出NCAF與BSA結合時的結合常數(shù)Ka=9.81× 104，結合位點數(shù)n=1.15?？梢奛CAF與BSA可發(fā)生相互作用，且結合作用較強。

圖3 log[（F0-F）/F]對log[Q]作圖Fig.3 The plot of log[（F0-F）/F]versus log[Q]

用同樣方法求出NAFA和DNAF與BSA的結合常數(shù)與結合位點數(shù)，結果得表2。

表2 NCAF，NAFA，DNAF結合常數(shù)與結合位點數(shù)比較Tab.2 Comparisons of equilibrium constants and numbers of binding sites for NCAF and NAFA and DNAF

從表2可知，從NCAF，NAFA到DNAF，結合常數(shù)和結合位點數(shù)逐漸下降，說明與BSA的主要發(fā)色基團第212位的色氨酸殘基的結合能力逐漸減弱。由于該色氨酸殘基位于BSA疏水空腔中，據(jù)此推測由于從NCAF，NAFA到DNAF親水性逐步提高以及空間位阻逐步加大，進入BSA疏水空間的幾率下降。

3.3 NCAF、NAFA、DNAF與BSA主要結合力比較

當溫度變化不大時，反應焓變可以看作是一個常數(shù)，根據(jù)ln（KA2/KA1）=（1/T1-1/T2）ΔH/R；ΔG= -RTlnKA=ΔH-TΔS；可求出24℃時焓變ΔH（kJ· mol-1）、熵變ΔS（J·mol-1·K-1）、反應自由能變ΔG（kJ·mol-1）。由于ΔH和ΔS，根據(jù)熱力學參數(shù)與作用力的關系，可知探針與BSA結合的作用力類型。

表3是NCAF，NAFA和DNAF主要熱力學參數(shù)與結合力比較。

表3 NCAF、NAFA、DNAF主要熱力學參數(shù)與結合力比較Tab.3 Comparisons of equilibrium constants and numbers of binding sites for NCAF and NAFA and DNAF

表3結果與三者的結合常數(shù)和結合位點數(shù)比較結果相一致，證實隨著吖啶-4-甲酰胺衍生物的側鏈基團分子量的加大，與BSA的結合作用減弱。

3.4 NCAF、NAFA、DNAF三者與BSA能量轉移效率和結合距離比較

研究表明，生物大分子與藥物、染料等的結合通常遵循Frster非輻射能量轉移機制。根據(jù)Frster非輻射能量轉移理論，可以求得染料與生物大分子中產生熒光基團之間的結合距離。

圖4為BSA與NCAF物質的量之比為1∶1時，體系的吸收譜和相同濃度的BSA的熒光發(fā)射譜的光譜圖。

圖4 NCAF與BSA的熒光發(fā)射光譜與紫外吸收光譜的譜圖重疊Fig.4 Overlap of the fluorescence emission spectra（1）and absorption spectra（2）NCAF∶BSA=1∶1,[BSA]=1.0×10-5mol·L-1, [NCAF]=1.0×10-5mol·L-1

由圖4可見，BSA的吸收光譜與發(fā)射光譜有相當重疊面積，因此，初步判定為遵循Frster非輻射能量轉移機制。根據(jù)Frster非輻射能量轉移理論進行數(shù)據(jù)處理，積分求得圖4重疊圖中光譜重疊部分（285～500nm）的面積積分J=2.07×10-13cm3·L· mol-1。BSA分子中在134和2l2位處有2個色氨酸殘基，BSA的熒光（λex=280nm,λem=335nm）主要來自于第212位的色氨酸殘基。根據(jù)文獻，在上述條件下，偶極空間取向因子K2可取受供能體各向隨機分布的平均值2/3，供能體熒光量子產率Φ通常取蛋白質中色氨酸的量子產率0.118，介質折射指數(shù)N一般取水和有機物折射指數(shù)的平均值1.336[4]。將以上各量及各步計算結果依次代入式R6=8.8×10-250K2N-4φJ、log（[F0-F）/F]=logKA+nlog[Q]、E=1-F/F0和E=+r6）求得臨界距離R0=4.06 nm，能量轉移效率E=0.34，BSA中第212位色氨酸殘基與NCAF分子間的距離r=4.54nm。

按照上述方法求得NAFA和DNAF能量轉移效率和結合距離，結果見表4。

表4 NCAF、NAFA、DNAF能量轉移效率和結合距離比較Tab.4 Comparisons of the transfer efficiency of energy and distance between acceptor and obtained for NCAF and NAFA and DNAF

由表4結果表明，3種吖啶-4-酰胺衍生物與BSA的相互作用均符合非輻射能量轉移的Frster共振機理，但從NCAF，NAFA到DNAF，染料與BSA間的能量轉移效率逐漸降低。

4 結論

利用紫外光譜、熒光等技術研究了合成的新型探針與蛋白質之間的相互作用。NCAF、NAFA、DNAF 3種熒光染料探針的熒光量子效率逐漸提高。測定了吖啶類探針與BSA的熱力學參數(shù)、結合位點數(shù)、表觀結合常數(shù)和供體-受體作用距離，確定了探針與蛋白質分子之間的作用機制均為靜態(tài)猝滅機制，而疏水相互作用、靜電吸引力、氫鍵和范德華力分別對3種吖啶類熒光探針與BSA的結合起到重要作用。分別對3種吖啶類探針與蛋白質相互作用進行比較，為進一步開展探針的測定應用提供理論支持。

［1］張麗娟.吖啶-4-甲酰胺衍生物的合成與表征［J］.廣州化工, 2011,39（15）:117-118.

［2］陳國珍，黃賢智，許金鉤，等.熒光分析法［M］.北京:科學出版社，1990.43-44.

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表2 實際樣品的測定結果Tab.2 Determined results of the sample

通過換算該樣品中異氰酸根平均含量為13.8%，樣品利用GB13941-1992二正丁胺法滴定結果異氰酸根含量為14.7%，兩種方法的結果相差較小。結果表明，本方法相對偏差小于3%，準確性較好，相對標準偏差小于5%，方法的穩(wěn)定性較好，可滿足實際樣品檢測的需要。

3 結論

研究表明，通過對試樣進行乙醇衍生，利用高效液相色譜儀對相應的衍生物分離并檢測，能夠得到目標產物MDI及中間產物的濃度，為MDC催化熱分解制備MDI反應過程的轉化率及選擇性提供依據(jù)，該方法具有操作簡便、靈敏、快速且環(huán)境友好等特點，能滿足實驗的要求。

參考文獻

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Research on the interaction between acridine fluorescence probes and protein

ZHANG Li-juan，ZHANG Xin
（Department of Pharmacy，F(xiàn)ujian Vocational and Technical Institute of Biological Engineering,Fuzhou 350002,China）

The paper aims to research on the mechanisms of binding and interaction between 3 new types of acridine fluorescence probes,namely,NCAF,NAFA&DNAF and bovine serum albumin（BSA）.It compared the 3 types of acridine fluorescence probes one another in terms of self-aggregation,constant of binding with BSA（KA）, number of binding sites（n）,thermodynamic parameters△H,△G and△S,energy conversion efficiency（E）and binding distance R0,and analyzed all the experiment data.It researched on both of quenching system against the quenching of protein intrinsic fluorescence and type of primary action force for the said 3 types of acridine fluorescence probes，and thus provides certain experimental and theoretical support for further researching on new biological probes and their application to identifying and analyzing large biological molecules.

acridine fluorescence probes；protein；interaction

O657

A

1002-1124（2014）08-0075-04

2014-07-14

張麗娟（1977-），女，福建福州市人，講師，畢業(yè)于河北科技大學，本科，現(xiàn)為福州大學制藥工程在讀碩士研究生，并從事化學教學和研究工作。