王 洋， 武利慶， 楊 屹

（1.北京化工大學(xué)，北京 100029；2.中國計量科學(xué)研究院，北京 100013）

UPLC-Q-TOF快速測定常見氨基酸含量

王 洋1， 武利慶2， 楊 屹1

（1.北京化工大學(xué)，北京 100029；2.中國計量科學(xué)研究院，北京 100013）

結(jié)合外標法或同位素稀釋質(zhì)譜法，建立UPLC-Q-TOF快速定量氨基酸分析方法。在無離子對試劑及衍生化情況下，實現(xiàn)對樣品中氨基酸的快速測定。采用外標法測定時，14種常見氨基酸在其相應(yīng)線性范圍內(nèi)，r2為0.953～0.999，LOD為0.001～0.080mg/g，CV為1.4%～9.8%；采用Q-TOF外標法定量時，CV為1.5%～8.0%，誤差為-9.1%～40%；采用同位素稀釋質(zhì)譜法測定各氨基酸濃度時，CV為1.4%～3.8%，誤差為-3.4%～3.7%。本方法可在2min之內(nèi)完成14種氨基酸的分離和定量，大大縮短分析時間。同時由于采用高分辨的飛行時間質(zhì)譜，避免檢測時離子間的相互干擾，提高測定結(jié)果的準確性，可用于蛋白質(zhì)標準物質(zhì)均勻性、穩(wěn)定性檢驗及定量。

氨基酸；UPLC-Q-TOF；定量；外標法；同位素稀釋；質(zhì)譜

0 引 言

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單元，氨基酸分析是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法，準確測定樣品中氨基酸含量是蛋白質(zhì)準確定量的前提。

目前，氨基酸的分析檢測方法主要有反相高效液相色譜法（RP-HPLC）[1]、毛細管電泳-質(zhì)譜法（CE-MS）[2]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[3]以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）[4]。在采用RP-HPLC和CE作為分離手段時，往往需要將待測樣品衍生、轉(zhuǎn)化為具有紫外可見吸收或能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，以便于檢測。在采用GC時，也要在柱前將待測樣品衍生為易揮發(fā)性物質(zhì)才可以[5]。而衍生試劑不穩(wěn)定、衍生化操作繁瑣，衍生出的副產(chǎn)物會干擾分析，具有重現(xiàn)性差、準確度低等缺陷[6]。LC-MS分析時，在流動相中加入離子對試劑可以提高氨基酸在反相色譜柱中的保留，省去衍生化的繁瑣過程；但是，離子對試劑會抑制信號強度，通常LC-MS分析時間為十幾到幾十分鐘[7-10]。

為了克服上述方法的缺點，Qu等[11]首先嘗試在不使用離子對試劑的情況下采用三重四級桿（QQQ）質(zhì)譜進行氨基酸定量，此時各種氨基酸得不到充分的分離，譜峰重疊嚴重，由于質(zhì)譜分辨率較低，對定性和定量分析造成了干擾。本文借助飛行時間質(zhì)譜（time of flight，TOF）的高分辨能力，在不使用離子對試劑的情況下對14種常見氨基酸進行分離，克服了譜峰重疊干擾和離子歧視效應(yīng)，取得了較為滿意的效果。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

nanoUPLC-Synapt G2（Waters公司）；TSQ Vantage（Thermo Fisher公司）。超純水（取自Milli-Q，MILLIPORE），乙腈（色譜純），甲酸（分析純），全氟庚酸（純度98%），三氟乙酸（色譜純），非標記氨基酸（美國Sigma Aldrich公司），標記氨基酸（美國劍橋同位素公司）。

1.2 標準溶液的配制

外標法：準確配制質(zhì)量濃度為10mg/g的氨基酸標準溶液，逐級稀釋至從0.01，0.1，1，3，5mg/g小到大。另配氨基酸質(zhì)量濃度約為0.1mg/g的溶液作為待測樣品。

同位素稀釋質(zhì)譜法（ID-MS）：分別取1 mg/g脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和精氨酸配制成非標記混標及與其對應(yīng)的標記氨基酸混標。配制成高標、低標和待定值樣品。

1.3 四級桿-飛行時間（Q-TOF）質(zhì)譜實驗參數(shù)

1.4 三重四級桿（QQQ）質(zhì)譜實驗參數(shù)

色譜條件：色譜柱為Agilent SB-Aq，2.1 mm×100mm；流速0.2mL/min，梯度條件見表1，A相是含0.8mmol PFHA和0.05%TFA的水溶液，B相是乙腈（表1）。采用Thermo Fisher公司的TSQ Vantage質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式捕獲：苯丙氨酸（166→120），苯丙氨酸-13C9（175→128），脯氨酸（116→70），脯氨酸-13C5（121→74），纈氨酸（118→72），纈氨酸-13C5（123→76），亮氨酸（132→86），亮氨酸-D10（142→96）。

1.5 溶菌酶水解

1）準確配制質(zhì)量濃度為1mg/mL蛋白溶液。

2）根據(jù)蛋白的氨基酸中纈氨酸含量，配制非標記混標、標記混標溶液。

3）取等量蛋白溶液和標記混標溶液，置于2 mL安瓿瓶中，40℃離心干燥。

4）加500 μL 6 mol/L鹽酸，氮吹2 min，封口。110℃，烘24h。

5）取出后，氮氣吹干，加500μL 0.1 mol/L鹽酸，過濾，同時配制相應(yīng)的低標和高標溶液進行質(zhì)譜分析。

變異系數(shù)：

式中：xi——測定結(jié)果；

n——總共實驗次數(shù)；

i——實驗編號。

誤差：

式中：c測——測出的氨基酸質(zhì)量濃度；

c標準值——用氨基酸標準物質(zhì)配制的氨基酸

質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 nano-UPLC-Q-TOF質(zhì)譜法評價

當采用外標法進行定量時（見表2），14種氨基酸在0.01～10mg/g范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系，r2的范圍為 0.953～0.999，LOD 0.001～0.080 mg/g，CV 1.4%～9.8%。Q-TOF外標法定量的結(jié)果與傳統(tǒng)的QQQ外標法定量結(jié)果相比（見表3），Q-TOF外標法測定結(jié)果與標準值之間的的誤差范圍為-9.1%～40%，CV為1.5%～8.0%；傳統(tǒng)的QQQ分析方法對同種樣品分析結(jié)果的的誤差為-9.1%～20%，CV為0.13%～7.8%?？梢?，由于Q-TOF質(zhì)譜檢測原理的限制，基于Q-TOF的氨基酸定量結(jié)果的準確度及重復(fù)性不如傳統(tǒng)的三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜；但是，其準確度和重復(fù)性也能滿足一般的應(yīng)用需求，尤其是基于Q-TOF的氨基酸定量可以在不使用離子對的情況下將14種氨基酸在2 min內(nèi)出峰完畢進行定量，與文獻[7-10]相比，大大地縮短了分析時間。采用Q-TOF質(zhì)譜，與文獻[11]中不添加離子對試劑的QQQ質(zhì)譜法相比，Q-TOF高分辨、無離子歧視效應(yīng)的優(yōu)點，使得氨基酸檢測與定量更加準確。

表1 QQQ-ID-MS定量氨基酸的液相梯度條件

表2 外標法測定氨基酸得到的方法學(xué)參數(shù)

表3 兩種不同分析方法的外標法定值結(jié)果比較（n=5）

同位素稀釋質(zhì)譜法（ID-MS）是一種高準確度的蛋白絕對定量方法，所以本文還對基于Q-TOF的ID-MS方法進行了研究。將蛋白質(zhì)定量中常用的4種穩(wěn)定氨基酸（脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸）配制成混標溶液，采用括弧法對樣品溶液中目標氨基酸的濃度進行ID-MS分析?；赒-TOF的氨基酸IDMS定量結(jié)果與傳統(tǒng)的QQQ質(zhì)譜定量結(jié)果相比（見表4），前者與標準值之間的的誤差范圍為-3.4%～3.7%，CV為1.4%～3.8%；而后者對同種樣品IDMS定量結(jié)果的誤差為-1.4%～1.2%，CV為0.7%～2.5%?？梢姡斒褂猛凰貥擞浳镒鳛閮?nèi)標時，顯著提升了Q-TOF在定量方面的方法學(xué)性能，同時具備不使用離子對試劑、分析速度快的優(yōu)點，可用于蛋白質(zhì)標準物質(zhì)的均勻性、穩(wěn)定性檢驗及定值中。

表4 兩種不同分析方法的ID-MS定值結(jié)果比較（n=6）

2.2 nano-UPLC-Q-TOF IDMS方法的應(yīng)用

為了檢驗nano-UPLC-Q-TOF IDMS方法在蛋白質(zhì)標準物質(zhì)研制中的應(yīng)用，將其應(yīng)用于溶菌酶標準物質(zhì)的均勻性檢驗中。隨機選取7瓶標準物質(zhì)，水解后通過測定水解液中纈氨酸的含量評價標準物質(zhì)的瓶間均勻性，同時與QQQ質(zhì)譜的的評價結(jié)果相比較，見表5和表6。兩種方法得到的溶菌酶質(zhì)量濃度分別為0.891g/g和0.887g/g，經(jīng)t檢驗，p=0.73457，可見兩種方法的測定結(jié)果差異不顯著；采用兩種方法均勻性檢驗統(tǒng)計量F值均小于查表值，說明溶菌酶樣品是均勻的，兩種方法得到的結(jié)論一致。由于QTOF質(zhì)譜法的分析時間遠小于傳統(tǒng)的QQQ質(zhì)譜方法，因此，在標準物質(zhì)均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗等需要大量重復(fù)性實驗時，使用Q-TOF質(zhì)譜法可以顯著縮短分析時間。

表5 Q-TOF質(zhì)譜應(yīng)用于ID-MS測定溶菌酶均勻性檢驗結(jié)果

表6 QQQ質(zhì)譜應(yīng)用于ID-MS測定溶菌酶均勻性檢驗結(jié)果

3 結(jié)束語

本文建立了nano-UPLC-Q-TOF質(zhì)譜法快速檢測、定量樣品中氨基酸含量的方法，不需添加離子對試劑和氨基酸衍生化，操作更簡便。采用外標法測定時，14種常見氨基酸在0.01～10 mg/g范圍內(nèi)r2為0.953～0.999，LOD為0.001～0.080 mg/g，CV為1.4%～9.8%。采用Q-TOF外標法定量氨基酸濃度時，CV為1.5%～8.0%，與標準值相比誤差為-9.1%～40%；采用ID-MS測定各氨基酸濃度時，CV為1.4%～3.8%，與標準值相比的誤差為-3.4%～3.7%。本方法可在2min之內(nèi)完成14種氨基酸的分離和定量，大大縮短了分析時間。同時由于采用了高分辨的飛行時間質(zhì)譜，避免了檢測時離子間的相互干擾，提高了測定結(jié)果的準確性。本方法與傳統(tǒng)QQQ質(zhì)譜分析方法相比，在外標法測定氨基酸含量時雖然不如QQQ方法的準確度與重復(fù)性好，但是也能滿足一般要求；在IDMS測定氨基酸含量時，由于采用同位素內(nèi)標消除了樣品前處理、離子化效率、分離過程中的系統(tǒng)誤差，顯著提升了基于Q-TOF定量的準確度，準確度與重復(fù)性都能控制在4%以內(nèi)；在提升準確度和重復(fù)性的同時，能夠簡化流動相配制、縮短分析時間，可用于需要大量重復(fù)測定蛋白質(zhì)濃度的場合，在基本不損失準確度的情況下顯著節(jié)約分析時間和分析成本，可用于蛋白質(zhì)標準物質(zhì)均勻性、穩(wěn)定性檢驗及定值實驗等。

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Rapid method of quantitative detection of common amino acids with UPLC-Q-TOF

WANG Yang1，WU Li-qing2，YANG Yi1
（1.Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China；2.National Institute of Metrology，Beijing 100013，China）

In this work，a new method of UPLC-Q-TOF had been proposed for the rapid and accurate detection of common amino acids.Without derivatization and using ion-pair regent，amino acids were analyzed fast and accurately.This study could be applied with both external standard method and ID-MS.For external standard method，ther2of each amino acid was from 0.953 to 0.999，the LOD was from 0.001 mg/g to 0.080 mg/g and the CV was from 1.4%to 9.8%.For the quantitation of 14 amino acids with the external standard method，the CV was from 1.5%to 8.0% and the bias was from-9.1%to 40%compared with standard values.For ID-MS，the CV was from 1.4%to 3.8%and the bias was from-3.4%to 3.7%compared with standard values.14 common amino acids could be analyzed in 2 minutes，which reduced the analysis time greatly.With highresolution TOF mass spectrometry，this method avoids the interference of ion overlapping，which can improve the accuracy of measurement results，and will be well applied in homogeneity and stability testing of protein certified reference materials.

amino acids；UPLC-Q-TOF；quantitation；external standard；isotope dilution；mass spectrometry

O517；O629.73；O657.63；TM930.114

：A

：1674-5124（2014）05-0070-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.05.018

2013-12-25；

：2014-02-02

國家科技支撐計劃項目（2012BAK26B04）國家質(zhì)檢總局科技項目（2013QK048，201310008）

王 洋（1988-），女，天津市人，碩士研究生，專業(yè)方向為分析化學(xué)。