楊波，張道亮， 胡有志 ，肖金鳳， 周承志

Ghrelin對大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣電流的影響

楊波，張道亮， 胡有志 ，肖金鳳， 周承志

目的： 研究一種具有生長激素釋放活性的腦腸肽（Ghrelin）對大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣電流的影響。

Ghrelin；L-型鈣電流；全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:832.)

Ghrelin是一種具生長激素釋放活性的腦腸肽。以往的研究多集中在Ghrelin調(diào)節(jié)生長激素分泌及能量代謝、促肥胖等作用。近年來，隨著其生物學(xué)作用領(lǐng)域的拓展，Ghrelin在心血管系統(tǒng)中的作用不斷的顯露出來，其能增強(qiáng)心肌收縮力，改善心肌的能量代謝，有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管新生[1，2]。另外，Ghrelin還能舒張血管、延緩心力衰竭的發(fā)展及抗心律失常的作用。這些研究結(jié)果表明Ghrelin具有強(qiáng)大的心血管保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)Ghrelin可抑制胃腸道平滑肌細(xì)胞膜鈣敏感性鉀電流，而L型鈣電流（L-type calcium channel，ICa-L）與心臟電生理有著至關(guān)重要作用，目前Ghrelin對心室肌細(xì)胞L型鈣通道的作用尚少見報(bào)道，本研究通過酶解獲得單個心室肌細(xì)胞，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，研究Ghrelin對大鼠心室肌細(xì)胞ICa-L的影響。

1 材料與方法

單個心室肌細(xì)胞的分離：取SD大鼠（雄性、體重200～250 g、由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物中心提供）腹腔注射肝素200 IU/kg，頸椎脫臼法處死。迅速開胸去取出心臟，修剪并游離出主動脈，插入主動脈套管置于離體灌流系統(tǒng)，分別給與無鈣臺式液、酶液灌流。當(dāng)心臟脹大蓬松并呈透明色時，剪下心室置于細(xì)胞保存液中，剪碎、吹打、靜止3分鐘后，取上清液即為含有單個心肌細(xì)胞的細(xì)胞懸液，用同樣的方法獲得第二杯、第三杯。均在室溫下保存約1 h后備用。

全細(xì)胞膜片鉗技術(shù) ：將細(xì)胞懸液滴入灌流槽中，靜止后，分別給與含有不同濃度Ghrelin的細(xì)胞外液進(jìn)行灌流。選取橫紋清楚、邊緣銳利、不收縮的單個心室肌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象。玻璃毛坯（中科院上海神經(jīng)研究所）經(jīng)微電極拉制儀拉制成尖端為1～1.5 μm 的電極，灌注電極內(nèi)液后入水阻抗為3～5 MΩ最佳。電極入水，補(bǔ)償液接電位后調(diào)節(jié)三維操縱器使電極尖端移至細(xì)胞表面，稍加負(fù)壓進(jìn)行封接。當(dāng)阻抗達(dá)到1 GΩ 以上，補(bǔ)償快電容后破膜形成全細(xì)胞記錄模式，進(jìn)行慢電容、串聯(lián)電阻補(bǔ)償后記錄ICa-L、穩(wěn)態(tài)激活曲線、穩(wěn)態(tài)失活曲線及失活后恢復(fù)曲線。

溶液與試劑 ：Tyrode液（mmol/L）：NaCl 135、KCl 5.4、CaCl21.8、MgCl21.0、NaH2PO40.33、HEPES 10、Glucose 10、NaOH調(diào)PH至7.35；無鈣Tyrode 液為Tyrode 液中不加CaCl2。細(xì)胞保存液為含0.8 mmol/L CaCl2無鈣Tyrode液。記錄ICa-L的電極內(nèi)液成分（mmol/L）： CsCl 120、CaCl21.0、MgCl25、Na2ATP 5.0；EGTA 11、HEPES 10、Glucose 11；用NaOH 調(diào)PH至7.35。記錄ICa-L的細(xì)胞外液成分為Tyrode 液。Ⅰ型膠原酶、EGTA、CsCL、Na2ATP、HEPES、Ghrelin、小牛血清均為Sigma公司試劑，其余為國產(chǎn)分析純。

ICa-L的記錄 ：保持電位-40 mV，給予+20 mV，鉗制時間350 ms的刺激引出+20 mv下ICa-L。反復(fù)記錄ICa-L，待ICa-L幅值穩(wěn)定后，記錄不同濃度下的Ghrelin對ICa-L、穩(wěn)態(tài)激活曲線、穩(wěn)態(tài)失活曲線、失活后恢復(fù)曲線的影響。在記錄的電流期間，注意避開ICa-L的增強(qiáng)與衰減（“runup”與“rundown”）現(xiàn)象。鉗制電位-40 mV可失活鈉電流及T型鈣電流（ICa-T），電極內(nèi)液中CsCl可阻斷鉀通道。

ICa-L電流刺激程序：鉗制電位-40 mV，給予-40 mV至+60 mV、350 ms、階躍為10 mV的指令電壓。ICa-L穩(wěn)態(tài)失活曲線刺激程序：保持電位-40 mV，給予-60 mV至+30 mV、1 ms，階躍10 mV的系列脈沖，在每一個條件脈沖后緊跟著一固定的去極化至20 mV，300 ms的脈沖，然后回到-40 mV。ICa-L失活后恢復(fù)曲線刺激程序：采用雙脈沖刺激，保持電位-40 mV，給予+20 mV、300 ms的刺激，然后回到-40 mV持續(xù)50 ms，再給予+20 mV、300 ms的刺激，前后兩個脈沖的間隔時間逐漸增加，每次增加50 ms，共12次脈沖。

2 結(jié)果

不同濃度的Ghrelin對ICa-L的影響：ICa-L在-30 mV左右激活，20 mV達(dá)峰值，10 nmol/L、100 nmol/ L及1 μmol/L Ghrelin對峰電位的抑制率分別為8.95 % ± 2.13%、31.18%±4.78%及 64.63% ±8.57%（n=6，P＜0.05）。圖1

圖1 Gherlin對L型鈣電流的影響

Ghrelin對ICa-LI-V曲線的影響：電流密度為電流值與細(xì)胞膜電容的比值（pA/pF）。以電流密度為縱坐標(biāo)，所對應(yīng)的的測試電壓為橫坐標(biāo)作出I-V曲線，圖2。結(jié)果顯示不同濃度的Ghrelin均使各測試電壓下的ICa-L減小，I-V曲線上移。

圖2 Gherlin對L型鈣電流I-V曲線的影響

Ghrelin對ICa-L穩(wěn)態(tài)激活曲線的影響：將電流值按Boltzmann方程進(jìn)行擬合：G/Gmax=I/ [1+exp(VT- VI/2/k)]（k為斜率因子，VI/2為通道的半激活電壓，G為電導(dǎo)）。G=ICa-L/(V-Vrev)，（Vrev為翻轉(zhuǎn)電位）。各組半數(shù)激活電壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對穩(wěn)態(tài)激活曲線影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，P＞0.05）。圖3

圖3 Gherlin對L型鈣電流穩(wěn)態(tài)激活曲線的影響

Ghrelin對ICa-L穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響：將電流值 經(jīng)Boltzmann方 程I/Imax=I/[1+exp(VT-VI/2/k)]進(jìn)行擬合。10 nmol/L、100 nmol/L及1 μmol/L Ghrelin使VI/2從（-1.34±1.9） mV分別降至（-8.04±1.32 ）mV，（9.76±1.17 ）mV及（-11.81±0.73）mV (n=6，P＜0.05)。圖4

圖4 Ghrelin對L型鈣電流穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響

Ghrelin對ICa-L失活后恢復(fù)曲線的影響：將電流值進(jìn)行單指數(shù)方程擬合：I(%)=A＋Bexp(-t/τ)，求出恢復(fù)曲線的時間常數(shù)(τ)值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。10 nmol/L、100 nmol/L及1 μmol/L Ghrelin使 失 活后恢復(fù)曲線下移，延長通道失活恢復(fù)時間，由給藥前τ值63.23±9.32，分別增至98.95±10.74、109.56±13.42和127.39±16.13，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，P＜0.05）。圖5

圖5 Ghrelin對L型鈣電流失活后恢復(fù)曲線的影響

3 討論

Ghrelin是一種28個氨基酸的多肽，為生長激素促分泌素受體天然配體，能夠促進(jìn)生長激素的釋放。Ghrelin受體不僅存在下丘腦，在血管、心臟中，在心血管系統(tǒng)中具有多種生物學(xué)效應(yīng)。①Ghrelin具心臟保護(hù)作用。有研究報(bào)道Ghrelin水平與右心室收縮末容積負(fù)相關(guān)，與右心室射血分?jǐn)?shù)正相關(guān)，提示其有正性肌力的作用[3]。其還可改善大鼠心肌結(jié)構(gòu)和功能，延緩心源性惡液質(zhì)的發(fā)展。另外，有研究報(bào)道Ghrelin能抑制心肌梗死后心室重構(gòu)，對心肌缺血在灌注損傷心臟具有保護(hù)作用，抑制心肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[4]。②Ghrelin能夠收縮冠狀動脈、擴(kuò)張大動脈、抑制血管鈣化。③Ghrelin降低小鼠動脈壓，研究者認(rèn)為其可能機(jī)制是抑制了交感神經(jīng)活性[5]。最近有研究報(bào)道，Grelin能改善大鼠心肌梗死后心臟的電生理學(xué)特性，上調(diào)心肌Cx43的表達(dá)，防止室性心律失常的發(fā)生[6]。然而Ghrelin對于單個心肌細(xì)胞電生理特性少見報(bào)道，本研究旨在探討Ghrelin對大鼠心室肌細(xì)胞膜上ICa-L的影響，為闡明Ghrelin心臟保護(hù)作用提供理論基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對，觀察Ghrelin對細(xì)胞膜上的L-鈣通道的動力學(xué)影響。

研究結(jié)果顯示Ghrelin可抑制ICa-L峰值，使I-V曲線上移，穩(wěn)態(tài)失活曲線左移，失活后恢復(fù)曲線右移，提示Ghrelin通過加快鈣通道的失活，及延長通道失活后恢復(fù)的時間，來抑制心室肌細(xì)胞Ca2+的內(nèi)流。ICa-L與心臟的多種生理功能密切相關(guān)，在心肌細(xì)胞動作電位中起著重要作用，是維持較長平臺期的主要內(nèi)向電流。此外它也是肌漿網(wǎng)釋放Ca2+的主要觸發(fā)機(jī)制，即以Ca2+釋放Ca2+，從而促進(jìn)興奮-收縮偶聯(lián)。在心肌缺血等異常狀態(tài)下，大量Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，觸發(fā)肌漿網(wǎng)鈣釋放，造成鈣超載，鈣超載一方面可啟動細(xì)胞壞死及凋亡程序?qū)е滦募〖?xì)胞的不可逆死亡[7,8]，另一方面還可導(dǎo)致惡性室性心律失常的發(fā)生并增加心血管病患者猝死發(fā)生率[9]。因此，有研究者認(rèn)為抑制L-Ca2+通道活性可在鈣運(yùn)作的起始階段達(dá)到抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載的發(fā)生，從而產(chǎn)生心臟保護(hù)作用[10]。在本研究中，Ghrelin對ICa-L的具有劑量依賴性地抑制作用，這一結(jié)果為Ghrelin對心血管系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)制提供了一種可能的原因，即Ghrelin通過抑制ICa-L從而降低心肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，最終達(dá)到抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載引起的心肌損傷作用。由于本研究未在疾病模型上驗(yàn)證Ghrelin對ICa-L的作用，因此今后仍需在疾病模型上進(jìn)一步驗(yàn)證Ghrelin對心肌細(xì)胞鈣運(yùn)作的影響。

以往有研究報(bào)道，Ghrelin 可以劑量依賴的方式降低低頻刺激下單個心肌細(xì)胞的張力和收縮、舒張速率，提示其對心肌細(xì)胞具有負(fù)性肌力作用[11]。而與此不一致的是，一項(xiàng)研究中健康人和心衰患者靜脈注射Ghrelin 后，在心率沒有明顯改變的情況下，擴(kuò)張動脈血管，顯著降低后負(fù)荷，有效地增加心搏出量、心臟指數(shù)、心輸出量，提示Ghrelin 對在體心臟功能的作用可能受到多種因素的影響。故Ghrelin對于整體心臟的作用，仍待進(jìn)一步研究。

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Effect of Ghrelin on L-type Calcium Channel Current of Ventricular Myocytes in Experimental Rats

YANG BO, ZHANG Dao-liang, HU You-zhi, XIAO Jin-feng, ZHOU Cheng-zhi.
Department of Cardiology, Aff i liated Hospital of Hubei University of Traditional Chinese Medicine, Wuhan (430061), Hubei, China

ZHOU Cheng-zhi, Email: acheng8341@163.com

Objective: To study the effect of ghrelin on L-type calcium channel current (ICa-L) of ventricular myocytes in experimental rats.Methods: The single ventricular myocyte in experimental rats were obtained by enzymolysis method, and the whole-cell patch-clamp technique was used to investigate the effect of ghrelin on ICa-L of ventricular myocytes at different doses of 10 nmol/L, 100 nmol/L and 1μmol/L respectively.Results: Ghrelin at 10 nmol/L, 100 nmol/L and 1μmol/L may inhibit ICa-L at (8.95 ± 2.13) %, (31.18 ± 4.78) % and (64.63 ± 8.57)% respectively, P＜0.05, and the current-voltage curve was shifted upwards. The channel half inactivation curve decreased from (-1.34 ± 1.9) mV to (-8.04 ± 1.32 ) mV, (9.76 ± 1.17) mV and (-11.81 ± 0.73) mV respectively, P＜0.05, and the recovery time after inactivation was prolonged as τ value from (63.23 ± 9.32) to (98.95 ± 10.74), (109.56 ± 13.42) and (127.39 ± 16.13) respectively, P＜0.05.Conclusion: Ghrelin may accelerate ICa-L inactivation and prolong the recovery time after inactivation. Ghrelin inhibits ICa-L in a dose-dependent manner.

Ghrelin; L-type calcium channel; Whole-cell patch-clamp;

2014-02-19)

（編輯：常文靜）

430060 湖北省武漢市，湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 湖北省中醫(yī)院 心內(nèi)科

楊波 主治醫(yī)師 碩士 研究方向中西醫(yī)結(jié)合治療心血管病 Email：yangbotougao@163.com 通訊作者：周承志Email：acheng8341@163.com

R54

A

1000-3614（2014）10-0832-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.10.018

方法： 采用酶解消化法獲得大鼠單個心室肌細(xì)胞，通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究不同濃度（10 nmol/L、100 nmol/L及1 μmol/L） Ghrelin對L型鈣電流的影響。

結(jié)果：10 nmol/L、100 nmol/L及1 μmol/L Ghrelin依次抑制大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣電流峰電位，抑制率分別為：8.95 % ± 2.13%、31.18%±4.78%及64.63% ±8.57%，（ P＜0.05）；I-V曲線上移，通道半數(shù)失活電壓從（-1.34±1.9） mV分別降至（-8.04±1.32 ）mV、（9.76±1.17 ）mV及（-11.81±0.73）mV（P＜0.05），并延長失活后恢復(fù)時間由給藥前τ值63.23±9.32，分別增至98.95±10.74、109.56±13.42和127.39±16.13，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

結(jié)論：Ghrelin通過加快L型鈣電流的失活及延長失活后恢復(fù)時間，具有濃度依賴性地抑制L型鈣電流。