汶海琪，羅勇，陳瑞芳，李滿，龐月珊，謝宸宸

腦缺血為臨床常見病和多發(fā)病，缺血再灌注損傷是其重要的病理損傷環(huán)節(jié)，研究其機制對該病的臨床治療具有重要意義。高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)作為一種重要的炎癥介質(zhì)，在腦缺血后表達量明顯升高并可持續(xù)數(shù)周[1-2]，釋放后主要和細胞表面的晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)、Toll樣受體2(Toll like receptors，TLR-2)、Toll樣受體4(TLR-4)結(jié)合，促進炎癥級聯(lián)反應(yīng)，引起下游炎癥介質(zhì)的釋放，進而引起組織細胞損傷[3]。星形膠質(zhì)細胞作為大腦中數(shù)量最多的細胞，具有支持、營養(yǎng)、信號傳遞等重要作用，越來越多的證據(jù)表明其在腦缺血再灌注損傷中扮演著重要角色[4-6]。本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默HMGB1的表達，在體外對大鼠原代星形膠質(zhì)細胞進行氧糖剝奪/復(fù)氧以模擬在體腦缺血再灌注損傷，觀察HMGB1表達的變化情況，探討RNA干擾抑制HMGB1表達是否對氧糖剝奪/復(fù)氧的星形膠質(zhì)細胞具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新生24h內(nèi)Sprague-Dawley大鼠40只，雌雄兼有，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(渝)2012-0001。

1.2 主要試劑 DMEM高糖、胎牛血清(美國Gibco)，無糖DMEM培養(yǎng)基(中國鈕因華信)，慢病毒載體HMGB1siRNA試劑盒(上海吉凱公司)，HMGB1抗體(美國Abcam)，GFAP抗體(美國CST公司)，β-actin抗體、兔抗羊IgG抗體、羊抗小鼠FITC、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗、MTT試劑盒、蛋白測定試劑盒、蛋白裂解試劑盒(碧云天)，HMGB1ELISA檢測試劑盒(武漢華美)，LDH檢測試劑盒(南京建成)，RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa)。

1.3 方法

1.3.1 原代星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)與鑒定 取出生24h以內(nèi)的新生SD乳鼠，在無菌條件下剪取出大腦皮質(zhì)，以2.5g/L胰蛋白酶37℃消化30min后加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打后200目篩網(wǎng)過濾，1000r/min離心5min，取離心后沉淀，加入培養(yǎng)液吹打形成次細胞懸液，利用差速黏附法將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱30min后，倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸出液體，800r/min離心5min，棄去上清液，再加入完全培養(yǎng)基形成細胞懸液，臺盼藍染色計數(shù)后按5.0×104個/cm2密度置于已包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，置CO2孵箱中37℃培養(yǎng)，3d換液1次，培養(yǎng)至第3代得到成熟的原代星形膠質(zhì)細胞[7]，用針對星形膠質(zhì)細胞的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)免疫細胞化學(xué)法對所培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞進行鑒定及純度計算。

1.3.2 RNA干擾原代星形膠質(zhì)細胞的HMGB1表達慢病毒包裝HMGB1-RNA干擾序列參考Hayakawaa等[8]的報道，由上海吉凱公司合成，序列為5'-GAT CCCGAAGCACCCGGATGCTTCTTTCAAGAGAAG AAGCATCCGGGTGCTTCTTTTTTGGAAA-3'。將星形膠質(zhì)細胞分為3組：①未轉(zhuǎn)染HMGB1siRNA的正常星形膠質(zhì)細胞對照組；②HMGB1siRNA組：轉(zhuǎn)染慢病毒載體的HMGB1siRNA，轉(zhuǎn)染操作步驟按說明書進行；③非特異性siRNA組：轉(zhuǎn)染非特異性慢病毒載體的siRNA，方法同HMGB1siRNA轉(zhuǎn)染步驟。Western blotting檢測以上各組細胞質(zhì)中HMGB1蛋白表達水平：用2×SDS加樣緩沖液裂解細胞，收集蛋白質(zhì)，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉后，加入兔抗大鼠HMGB1抗體、小鼠抗大鼠β-actin后4℃過夜，用TBST洗3次，再加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗，室溫孵育2h，TBST洗3次，DAB顯色，拍照，用Quantity One系統(tǒng)進行電泳條帶光密度值分析。

1.3.3 氧糖剝奪/復(fù)氧模型的建立及實驗分組 建立氧糖剝奪/復(fù)氧模型[9]：取第3代原代星形膠質(zhì)細胞，PBS沖洗3次，換為不含血清的無糖DMEM培養(yǎng)基，置于三氣孵箱(1%O2、5%CO2)中，在不同時長的氧糖剝奪后，再換回含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于20%O2、5%CO2的正常細胞培養(yǎng)條件下復(fù)氧培養(yǎng)至24h。將原代成熟純化的星形膠質(zhì)細胞分為對照組、模型組、HMGB1siRNA組、非特異性siRNA組。對照組：細胞未行氧糖剝奪/復(fù)氧及RNA干擾處理。模型組：細胞分別行2、4、6h的氧糖剝奪后復(fù)氧至24h。HMGB1siRNA組：氧糖剝奪前對星形膠質(zhì)細胞行HMGB1siRNA轉(zhuǎn)染，然后氧糖剝奪6h并復(fù)氧至24h。非特異性siRNA組：氧糖剝奪前對星形膠質(zhì)細胞進行非特異性siRNA轉(zhuǎn)染，然后氧糖剝奪6h后復(fù)氧至24h。

1.3.4 MTT檢測細胞存活率 各組星形膠質(zhì)細胞使用MTT試劑盒檢測細胞存活率，具體操作步驟按說明書進行，最后在酶標儀上檢測吸光度(A)值。

1.3.5 乳酸脫氫酶(LDH)漏出率檢測 各組星形膠質(zhì)細胞按LDH檢測試劑盒說明書進行LDH活性測定，用乳酸脫氫酶-L試劑測試待測樣品中的LDH漏出率。LDH漏出率=培養(yǎng)基LDH總活性/(細胞質(zhì)LDH總活性+培養(yǎng)基LDH總活性)×100%。

1.3.6 RT-PCR檢測HMGB1mRNA表達 按照Trizol試劑說明提取各組細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后行PCR。HMGB1引物：上游5'-AATCTTTTGTCCACACACCCT-3'，下游5'-TATCCGCTTTCCTTGTATCTG-3'；β-actin引物：上游5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，下游5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。產(chǎn)物長度分別為552、150bp。反應(yīng)體系25μl，PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、62℃退火45s、72℃延伸1min，循環(huán)35次；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳成像，采用Quantity One系統(tǒng)進行電泳條帶光密度值分析，以HMGB1/β-actin積分光密度比值代表HMGB1mRNA表達水平。

1.3.7 ELISA檢測細胞上清液中HMGB1蛋白的濃度按照ELISA試劑盒操作說明書步驟，每個樣本取細胞培養(yǎng)上清液100μl，檢測各組星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪/復(fù)氧后培養(yǎng)上清中HMGB1蛋白的濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Turkey多重比較法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠原代星形膠質(zhì)細胞的鑒定 取培養(yǎng)3代的大鼠原代星形膠質(zhì)細胞，采用GFAP熒光染色鑒定，結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細胞純度>95%(圖1)。

圖1 GFAP鑒定原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞(×200)Fig. 1GFAP immunofluorescence staining of primarily cultured astrocytes (×200)

2.2 Western blotting檢測RNA干擾效果 與對照組(6.51±0.46)相比，HMGB1siRNA組HMGB1蛋白表達量(2.17±0.51)明顯降低(P<0.01)，而非特異性siRNA組HMGB1蛋白表達量(6.00±0.79)g與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示HMGB1siRNA對星形膠質(zhì)細胞的HMGB1蛋白表達具有明顯抑制作用(圖2)。

圖2 Western blotting檢測HMGB1蛋白表達Fig. 2Expression of HMGB1protein detected by Westernblotting

2.3 星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪/復(fù)氧后HMGB1的表達變化

2.3.1 HMGB1mRNA的表達 RT-PCR法檢測顯示，對照組有少量HMGB1mRNA表達(0.07±0.01)。與對照組相比，模型組HMGB1mRNA在2h氧糖剝奪/復(fù)氧24h時表達明顯增加(0.16±0.01，P<0.01)，在4h氧糖剝奪/復(fù)氧24h時進一步增高(0.26±0.02，P<0.01)，6h氧糖剝奪/復(fù)氧24h時達最高值(0.41±0.02，P<0.01)。與6h氧糖剝奪組比較，HMGB1siRNA組的HMGB1mRNA表達明顯下降(0.20±0.01，P<0.01)，而非特異性siRNA組HMGB1mRNA表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(0.42±0.01，P>0.05，圖3)。

圖3 氧糖剝奪/復(fù)氧后星形膠質(zhì)細胞HMGB1mRNA的表達變化Fig.3Expression of HMGB1mRNA detected by RT-PCR

2.3.2 細胞上清液中HMGB1蛋白濃度 ELISA檢測結(jié)果顯示，正常組細胞上清液中有一定量HMGB1表達(472±53pg/ml)。與對照組相比，模型組細胞上清液中HMGB1蛋白濃度在2h氧糖剝奪/復(fù)氧24h時表達明顯增加(538±85pg/ml，P<0.01)，在4h氧糖剝奪/復(fù)氧24h時進一步增高(659±47pg/ml，P<0.01)，在6h氧糖剝奪/復(fù)氧24h時達最高值(784±63pg/ml，P<0.01)。與氧糖剝奪6h組相比較，HMGB1siRNA組HMGB1濃度明顯下降(588±65pg/ml，P<0.01)，而非特異性siRNA組HMGB1濃度無明顯差異(743±46pg/ml，P>0.05)。

2.4 星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪/復(fù)氧后細胞損傷情況

2.4.1 星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪/復(fù)氧后LDH漏出率的變化 與對照組(1.14±0.20)相比，不同時間點氧糖剝奪/復(fù)氧組LDH漏出率均明顯增加(P<0.01)，且隨著缺氧時間延長逐漸升高。與氧糖剝奪6h組(63.63±4.30)相比，HMGB1siRNA組的LDH漏出率明顯下降(43.80±3.43，P<0.01)，而非特異性siRNA組LDH漏出率無明顯差異(63.93±2.40，P>0.05，表1)。

表1 氧糖剝奪/復(fù)氧星形膠質(zhì)細胞的細胞存活率和LDH漏出率比較(x±s，n=6)Tab. 1Effects of HMGB1siRNA on the survival rate and LDH activity of OGD/R astrocytes (x±s, n=6)

2.4.2 星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪/復(fù)氧后細胞存活率的變化 MTT檢測顯示，與對照組(100.00±1.43)相比，不同時間點氧糖剝奪/復(fù)氧組細胞存活率均明顯降低(P<0.01)，且隨缺氧時間延長逐漸下降。與氧糖剝奪6h組(35.00±1.92)相比，HMGB1siRNA組細胞存活率明顯提高(75.00±2.13，P<0.01)，而非特異性s i R N A組細胞存活率無明顯變化(36.00±1.55，P>0.05)。

3 討 論

缺血再灌注損傷激活炎癥反應(yīng)在腦缺血的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[10-12]。目前腦缺血再灌注損傷的臨床治療效果仍不十分理想，對其分子機制的研究尚待繼續(xù)深入。HMGB1是一種核蛋白，其組成結(jié)構(gòu)可分成兩個同種異體的HMG 盒，即A 盒和B盒，其活性存在于B盒的前20個氨基酸序列中[13]。HMGB1主要有兩種來源：①壞死細胞被動釋放；②免疫細胞主動釋放。目前研究表明，HMGB1作為重要的炎癥介質(zhì)，在腦缺血再灌注損傷中具有十分重要的作用。HMGB1主要與細胞表面的TLR-2、TLR-4以及RAGE結(jié)合，引起NF-κB的激活與釋放，最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及細胞死亡[14-15]。星形膠質(zhì)細胞作為腦內(nèi)數(shù)量最多的細胞，具有支持、營養(yǎng)、信號傳導(dǎo)等重要作用。以往認為小膠質(zhì)細胞是腦缺血后主要的炎癥反應(yīng)細胞[16]，近年來發(fā)現(xiàn)激活的星形膠質(zhì)細胞可以釋放許多炎癥介質(zhì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在腦缺血的病程中扮演著非常重要的角色[4-5]。

本研究觀察到星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪/復(fù)氧24h后細胞上清中的HMGB1蛋白濃度明顯升高，隨著氧糖剝奪時間的延長，MTT檢測提示細胞存活率降低，LDH檢測提示細胞LDH漏出率增加，均提示星形膠質(zhì)細胞損傷逐漸加重，而HMGB1siRNA組的星形膠質(zhì)細胞損傷明顯減輕。細胞損傷情況與HMGB1表達量密切相關(guān)，RT-PCR和ELISA檢測HMGB1表達結(jié)果一致，均提示RNA干擾HMGB1表達后細胞損傷程度明顯減輕。Kim等[17]報道通過RNA干擾技術(shù)對SD大鼠進行HMGB1基因沉默，可以明顯減少SD大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)后腦梗死體積；Liu等[18]報道MCAO大鼠腦室內(nèi)注入HMGB1單克隆抗體后，血-腦脊液屏障通透性增高，MMP-9活性降低，梗死區(qū)體積減小，腦缺血后功能恢復(fù)情況改善；Kikuchi等[19]報道體外給予依達拉奉可以通過減少HMGB1的釋放而減輕氧糖剝奪所致的神經(jīng)細胞死亡；Kikuchi等[20]報道體外應(yīng)用米諾環(huán)素可抑制HMGB1釋放，進而減輕氧糖剝奪所致的PC12細胞凋亡。本研究應(yīng)用星形膠質(zhì)細胞的離體腦缺血再灌注損傷模型證實抑制HMGB1基因表達可顯著減輕缺血再灌注導(dǎo)致的細胞損傷，與上述實驗結(jié)果基本一致，進一步從離體實驗證實了HMGB1表達在腦缺血再灌注損傷中的作用。

HMGB1作為重要的炎癥產(chǎn)物，對下游的IL-1α/β、TNF-α表達具有一定調(diào)控激活作用[21]，IL-1α/β、TNF-α等的表達上調(diào)與細胞損傷密切相關(guān)，即HMGB1可能扮演對下游炎癥產(chǎn)物調(diào)節(jié)的開關(guān)作用。當然，炎癥在腦缺血再灌注損傷中的作用取決于缺血的嚴重程度以及時期(早期或晚期)，早期炎癥可能以損害機體為主，但是晚期炎癥可能對機體的修復(fù)有積極作用[22]。Hayakawaa等[8]報道腦缺血后期星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的HMGB1可趨化內(nèi)皮祖細胞向缺血區(qū)域組織聚集，進而促進神經(jīng)血管單元的重塑，從而對機體缺血后的功能恢復(fù)產(chǎn)生有益作用。因此，應(yīng)將研究重點放在如何選擇炎癥干預(yù)的時間窗以及進一步闡明機體炎癥反應(yīng)的具體機制上，從而最大程度的將炎癥的損害作用轉(zhuǎn)化為保護作用。本實驗對HMGB1在原代星形膠質(zhì)細胞缺血再灌注損傷模型中的作用進行了探討，而HMGB1以及星形膠質(zhì)細胞在體內(nèi)所扮演的角色將在后續(xù)的實驗中進一步研究和探討。

本研究結(jié)果表明，星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪/復(fù)氧后可導(dǎo)致細胞損傷，HMGB1表達量明顯升高且與細胞損傷程度密切相關(guān)；通過RNA干擾技術(shù)抑制星形膠質(zhì)細胞HMGB1的表達可顯著減輕氧糖剝奪/復(fù)氧導(dǎo)致的細胞損傷。星形膠質(zhì)細胞可以釋放HMGB1參與腦缺血再灌注損傷的過程，HMGB1的過度激活是導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷的重要分子機制。本研究為腦缺血再灌注的臨床治療提供了一個重要的治療靶點和一種新思路。

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