惠文巧，班 謙，湯繼順，侯宏艷，陳 勝

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，合肥 230031；2.安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，干細(xì)胞及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心）

山羊肺泡巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)及脂多糖誘導(dǎo)形態(tài)學(xué)觀察

惠文巧1，班 謙2，湯繼順1，侯宏艷1，陳 勝1

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，合肥 230031；2.安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，干細(xì)胞及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心）

肺泡巨噬細(xì)胞是宿主天然免疫和特異性免疫的重要執(zhí)行者。目前關(guān)于山羊肺泡巨噬細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。文章從健康無(wú)病變的羔羊肺臟灌洗液中分離肺泡巨噬細(xì)胞，并加50 μg/mL的脂多糖進(jìn)行誘導(dǎo)刺激。結(jié)果顯示：肺泡巨噬細(xì)胞分離純度較高，不發(fā)生增殖，體外可維持30 d左右，經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)聚集和增大現(xiàn)象。表明山羊肺泡巨噬細(xì)胞體外維持時(shí)間較長(zhǎng)，脂多糖誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)其具備免疫學(xué)功能，為進(jìn)一步利用山羊肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行免疫學(xué)機(jī)制研究和疾病治療提供了依據(jù)。

山羊；肺泡巨噬細(xì)胞；分離培養(yǎng)；脂多糖

肺泡巨噬細(xì)胞作為單核-巨噬細(xì)胞成員之一，是由血液中單核細(xì)胞遷移到肺泡間隔后演變而來(lái)［1］。它是肺部最早接觸病原微生物的免疫防御細(xì)胞之一，具有多種生物學(xué)功能，是宿主天然免疫和特異性免疫的重要執(zhí)行者。在非特異性免疫中，肺泡巨噬細(xì)胞能夠吞噬、清除自呼吸道侵入機(jī)體的外源微生物，同時(shí)還可介導(dǎo)炎性反應(yīng)；在特異性免疫方面，主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能［1-3］。作為肺臟抗病原感染的首道防線，肺泡巨噬細(xì)胞是研究機(jī)體自然感染和獲得性免疫的良好模型。

目前，有關(guān)肺泡巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的報(bào)道多見(jiàn)于小型哺乳動(dòng)物，如小鼠［4-6］、大鼠［7］等，在大型家畜如綿

羊［8］、豬［9-11］、牛［12］、水牛［13］也有報(bào)道，而關(guān)于山羊肺泡巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)分離山羊肺泡巨噬細(xì)胞，同時(shí)用脂多糖誘導(dǎo)觀察其形態(tài)變化，為后期建立山羊肺炎支原體感染肺泡巨噬細(xì)胞模型及其免疫學(xué)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)羊?yàn)?月齡健康羔羊，購(gòu)自合肥市肥東縣富旺鎮(zhèn)某養(yǎng)殖戶。

1.1.2 試劑 特級(jí)胎牛血清（FBS）、DMEM、0.25%胰酶、青鏈霉素、PBS均為GIBCO公司產(chǎn)品。培養(yǎng)液配制為10%完全培養(yǎng)液：DMEM/F12培養(yǎng)液44 mL+胎牛血清5 mL+雙抗（1萬(wàn)單位）1 mL；凍存液：70%DMEM/F12培養(yǎng)液+20%胎牛血清+10%二甲基亞砜。

1.1.3 儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱（ThermoScientific，美國(guó)），生物安全柜（AB2-4S1，ESCO，新加坡），熒光顯微鏡（BX53，OLMPUS，日本）。

1.2 方法

1.2.1 山羊肺泡巨噬細(xì)胞分離 處死實(shí)驗(yàn)羔羊，置于無(wú)菌解剖臺(tái)上，剖開(kāi)胸腔，經(jīng)肉眼觀察肺臟健康無(wú)病變后，結(jié)扎氣管，取出帶氣管的完整肺臟，用含有青鏈霉素的PBS清洗肺臟表面，清除血塊等污物；同時(shí)用50 mL注射器通過(guò)氣管注入PBS至肺部，輕輕拍打并按摩肺臟表面5 min，同上重復(fù)灌洗2次，輕輕拍打肺臟后靜置2 min，收集100 mL灌洗液，用單層無(wú)菌100目不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾，收集灌洗液后15 000 r/min離心5 min，留沉淀。再用含有雙抗的PBS清洗，10 000 r/min離心5 min，留沉淀，即得肺泡巨噬細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù) 取1 mL細(xì)胞懸液與1 mLpH值7.4的PBS溶液混勻，1 min后在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算山羊肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量。

1.2.3 原代細(xì)胞培養(yǎng) 加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（加培養(yǎng)液前將培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)熱10～15 min），將獲得的肺泡巨噬細(xì)胞稀釋至整細(xì)胞濃度至4×105個(gè)/mL，按2 mL/孔接種于6孔培養(yǎng)板，同時(shí)將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL，置于50 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。8 h后，從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板，棄舊培養(yǎng)液，以去掉少數(shù)未貼壁的細(xì)胞，加入PBS清洗2次，更換10%完全培養(yǎng)液，2 mL/孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液，以后每72小時(shí)換液一次。

1.2.4 脂多糖刺激肺泡巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)加入LPS終濃度為50 μg/mL，37℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，棄舊培養(yǎng)液后加入PBS洗去未貼壁細(xì)胞，用倒置顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)變化及生長(zhǎng)狀況，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 山羊肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)特性

由圖1可見(jiàn)，分離到的山羊肺泡巨噬細(xì)胞純度較高，均呈圓形、橢圓形狀，有的伸出偽足（圖1-A），未見(jiàn)到梭狀等其他上皮細(xì)胞形態(tài)，高倍鏡下其形態(tài)學(xué)尤為明顯，看到典型的突起狀（圖1-B）。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，未出現(xiàn)細(xì)胞增殖現(xiàn)象，且細(xì)胞在體外培養(yǎng)30 d內(nèi)均未出現(xiàn)大規(guī)模死亡現(xiàn)象。

圖1 山羊肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)特性

2.2 脂多糖LPS誘導(dǎo)山羊肺泡巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

脂多糖LPS誘導(dǎo)山羊肺泡巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察見(jiàn)圖2。同正常組相比（圖2-B），LPS誘導(dǎo)6 h后，山羊肺泡巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)模式發(fā)生了明顯改變，出現(xiàn)聚集和增大現(xiàn)象（圖2-A），部分細(xì)胞增大尤為明顯，且細(xì)胞數(shù)量有所減少。

圖2 LPS誘導(dǎo)6 h后山羊肺泡巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

3 討論

3.1 肺泡巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)

研究表明，人類和動(dòng)物氣管肺泡灌洗液中，肺泡巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)最多，可占全部細(xì)胞總數(shù)的80%［14］。因此，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲取肺泡巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵在于肺泡灌洗液的收集。

關(guān)于肺泡巨噬細(xì)胞的分離，諸多文獻(xiàn)均采用從氣管沖入灌洗液PBS至肺臟，進(jìn)而收集灌洗液這一方法［8-10］，但具體操作方法和步驟也不盡相同，主要體現(xiàn)在灌洗液的溫度、劑量、清涼程度等，最終導(dǎo)致收集到的含有肺泡巨噬細(xì)胞灌洗液的純度和含量出現(xiàn)差異。本實(shí)驗(yàn)提取肺泡巨噬細(xì)胞的方法關(guān)鍵在于以下幾點(diǎn)：①本實(shí)驗(yàn)采用的是常溫下的PBS灌洗，更接近于動(dòng)物體溫，從而有利于細(xì)胞分離和獲得；②本實(shí)驗(yàn)獲取的肺泡灌洗液清亮，不含血絲及其他膠原粘性組織，這在一定程度上保證了巨噬細(xì)胞的純度。獲得的肺泡巨噬細(xì)胞經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，具有體內(nèi)巨噬細(xì)胞的典型特征，且純度較高，不發(fā)生增殖，體外生長(zhǎng)可維持30d左右。這可能與以上具體操作方法有關(guān)。

3.2 脂多糖誘導(dǎo)形態(tài)學(xué)觀察

脂多糖是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的主要成分，是細(xì)菌最主要的致病毒素，通過(guò)與肺泡巨噬細(xì)胞表面的TLR4結(jié)合啟動(dòng)炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，釋放各類炎癥因子，從而導(dǎo)致細(xì)胞受損［15］。本實(shí)驗(yàn)獲得的肺泡巨噬細(xì)胞經(jīng)脂多糖刺激后，出現(xiàn)大量的巨噬細(xì)胞聚集和增大現(xiàn)象，表明巨噬細(xì)胞能夠發(fā)揮其功能，具有一定的活性。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)后，巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)模式發(fā)生明顯改變，細(xì)胞生長(zhǎng)速度下降，細(xì)胞數(shù)量減少，這與卿城［15］的報(bào)道一致。這可能是因?yàn)樵谥嗵堑拇碳は?，?xì)胞表面釋放各類炎性因子，從而導(dǎo)致細(xì)胞受損，其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步分析。

綜上，本研究獲得的肺泡巨噬細(xì)胞純度高、活性好，可為后續(xù)建立山羊肺炎支原體感染肺泡巨噬細(xì)胞模型及其免疫學(xué)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

［1］FelsAO，Cohn ZA.Thealveolar macrophage［J］.J Appl Physiol，1986，60：353-369.

［2］LambrechtBN.Alveolar macrophage in the driver’s seat［J］.Immunity， 2006，24：366-368.

［3］Balhara J，Gounni A S.The alveolar macrophages in asthma：a doubleedged sword［J］.Mucosal Immunology，2012，5（6）：605-609.

［4］鄒丹，全宏勛，胡群?jiǎn)T.小鼠肺泡巨噬細(xì)胞的提取、純化及活性檢測(cè)［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2003，19（9）：1087-1088.

［5］ZhangX，Goncalves R，Mosser DM.The isolation and characterization of murine macrophages［EB/OL］.http：www.ncbi.nlm.nik.gov/pubmed/ 19016445.CurrentProtocolsinImmunology，2008：14.1.1-14.1.14.

［6］Sato-Nishiwaki M，Aida Y，Abe S，et al.Reduced number and morphofunctional change of alveolar macrophages in MafB gene-targeted mice［J］.Plos One，2013，8（9）：e73963.

［7］Zhao Z J，Zhang J，Wei J，et al.Lower expression of inducible nitric oxide synthase and higher expression of arginase in rat alveolar macrophages are linked to their susceptibility to toxoplasma gondii infection［J］.Plos One，2013，8（5）：e63650.

［8］盛金良，陳創(chuàng)夫，鄭永峰，等.綿羊肺泡巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察［J］.石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，25（1）：51-54.

［9］楊克禮，田永祥，梁望旺，等.豬肺泡巨噬細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)［J］.國(guó)外畜牧學(xué)—豬與禽，2011，31（4）：52-53.

［10］王貴平，劉福林，劉建，等.從屠宰豬肺中分離培養(yǎng)豬肺泡巨噬細(xì)胞［J］.養(yǎng)豬，2013，2：123-124.

［11］CaoJ，Grauwet K，Vermeulen B，et al.Suppression ofNKcell-mediated cytotoxicity against PRRSV-infected porcine alveolar macrophages in vitro［J］.Veterinarymicrobiology，2013，164（3）：261-269.

［12］徐廣賢，趙德明，周向梅，等.牛結(jié)核分枝桿菌Mce4E蛋白對(duì)牛肺泡巨噬細(xì)胞iNOs、TNF-α、IL-6和IL-12表達(dá)的影響［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，12（1）：1-6.

［13］韓忠燕，黃海愉，沈前程，等.水牛肺泡巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，41（7）：719-722.

［14］Pribul P K，Harker J，Wang B，et al.Alveolar macrophages are a major determinant of earlyresponses toviral lunginfection but do not influence subsequent disease development［J］.J Virol，2008，82（9）：4441-4448.

［15］卿城.miR-21在脂多糖誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及其與TNF-α的相關(guān)性分析［D］.南昌：南昌大學(xué)，2013.

S858.27

A

2095-3887（2014）05-0046-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.014

2014-07-07

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)杰出青年基金項(xiàng)目（14B0403）

惠文巧(1986-)，女，博士。

陳勝（1974-），男，副研究員，碩士，主要從事肉羊遺傳育種與繁殖技術(shù)研究。