解曉露，陳 成，魏 東，李恪梅，付麗麗，黃長江，王國治，

（1.溫州醫(yī)科大學環(huán)境與公共衛(wèi)生學院,浙江溫州 325035；2.中國食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室,北京 100050）

布氏菌活疫苗皮內(nèi)與皮下接種的免疫效果評價

解曉露1，陳 成1，魏 東2，李恪梅2，付麗麗1，黃長江2，王國治1，2

（1.溫州醫(yī)科大學環(huán)境與公共衛(wèi)生學院,浙江溫州 325035；2.中國食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室,北京 100050）

將布氏減毒活疫苗通過皮內(nèi)注射和皮下注射方式免疫小鼠,比較2種方式的免疫效果。用布氏菌活疫苗,通過皮內(nèi)和皮下注射免疫小鼠,免疫4周后分離血清及脾臟淋巴細胞。E L I SA法檢測免疫動物血清中總Ig G抗體；E L I SP 0 T法檢測分泌I F N-γ、I L-4的脾臟淋巴細胞數(shù)目,同時用E L I SA方法檢測體外再刺激后小鼠脾細胞分泌I F N-γ、I L-4的水平；用流式細胞儀對T淋巴細胞亞群進行分類；用羊布魯氏菌弱毒株M 5攻擊免疫動物,通過脾臟細菌計數(shù)評價布氏活疫苗的免疫保護作用。E L I SA、E L I SP 0 T和T淋巴細胞亞群分類結(jié)果顯示,2種免疫途徑均能誘導較強的體液免疫和細胞免疫應答,但兩者間無顯著差異；B A L B/c小鼠攻毒試驗顯示皮內(nèi)注射組脾臟中布氏菌數(shù)量的對數(shù)值為0,皮下注射組為2.27±0.21,陰性對照組為5.13±0.16。由此可知,2種免疫方法均能誘導較強的體液免疫和細胞免疫應答,但皮內(nèi)注射組的免疫保護作用顯著優(yōu)于皮下注射組,提示通過皮內(nèi)注射布氏疫苗可能是安全、高效的免疫途徑。

布氏疫苗；免疫途徑；體液免疫；細胞免疫；保護力

布魯菌屬（B r uc e l l a）,又稱布魯斯菌屬,因最早由美國醫(yī)師D a v i d B r uc e首次分離而得名。布魯菌屬細菌是人畜共患傳染病的病原菌,有6個生物種,19個生物型,但經(jīng)DNA-DNA雜交研究證明本屬只有1個生物種,其他均為生物變種［1］。布魯氏菌具有侵襲力強、傳染途徑多、引起多器官損傷的特點。家畜感染后若得不到良好的治療可引發(fā)母畜流產(chǎn)和不育,人感染則主要引起波浪熱和轉(zhuǎn)化為慢性感染［2-3］。流行病學調(diào)查顯示,我國畜間布病流行情況大致經(jīng)歷了3個階段：20世紀50-70年代為高發(fā)期,部分省區(qū)疫情相當嚴重,尤其是在牧區(qū),嚴重地區(qū)的人畜感染率達到60%～70%；80-90年代為基本控制期,由于增加了投入,布病疫情得到基本控制,布病陽性率大幅下降；2000年后為反彈期,布病疫情出現(xiàn)上升趨勢,家畜布病總的陽性率高達75%［4］,每年造成近千萬元損失。

疫苗接種是防治布病最有效、最經(jīng)濟的手段。目前,我國采用的人用布氏菌活疫苗［5］為牛種弱毒株104M菌株,接種方式為皮上劃痕。該方法操作復雜、不能定量接種,接種陽轉(zhuǎn)率低且保護效果有限,被接種者因劃痕產(chǎn)生疼痛不易被接受,從而影響疫苗的廣泛使用。鑒于布病疫情控制的需要,本研究采用皮下和皮內(nèi)2種注射方式免疫小鼠,從體液免疫、細胞免疫和保護力試驗3個方面的結(jié)果全面評價不同免疫途徑的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 材料

SP F級B A L B/C小鼠30只,6～8周,白色雌性,中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）試驗動物中心提供（試驗動物生產(chǎn)許可證號SC X K（京）2009-0017）,飼養(yǎng)于中國食品藥品檢定研究院清潔級動物室。

皮內(nèi)和皮下注射用布氏活疫苗和羊布氏菌M 5弱毒株均由中檢院結(jié)核病疫苗室保存。

B r-P P D蛋白由中檢院結(jié)核病疫苗室提供,制備方法見參考文獻［6］。

儀器試劑有生物安全柜（telstar bio-Ⅱ-A）、酶標儀（Labsys tmsDragon-MK 3）、恒溫培養(yǎng)箱（天

津市泰斯特儀器-D H 6000A B型）、高速離心機（德國eppendorf-5415D）、Immuno Spot Analy zer（CTLImm unSpot）、C 02培養(yǎng)箱（Napco Scientific company）和ELISP0T斑點讀數(shù)儀（Cellμ L a r T e c hno l og yL t d.）。

布氏菌培養(yǎng)基（腦心瓊脂購自美國B D公司）,牛血清白蛋白（B SA）和C o nA（美國Sig m a公司）,E L I SP 0 T試劑盒（Mo us e I F N-γ及I L-4 E L I Spo t K i t）購自美國B D公司,達優(yōu)-淋巴細胞分離液、無血清培養(yǎng)基、I F N-γ及I L-4 E L I SA預包被試劑盒均購自深圳達科為公司,堿性磷酸酶標記羊抗小鼠Ig G（美國B e t hy l公司）,pN P P底物顯色液（Sur Mo di c s）。

1.2 方法

1.2.1 分組及免疫

將30只6～8周齡SP F級B A L B/C小鼠隨機分成3組,每組10只。第1組為皮內(nèi)注射組（5 x 107個·只-1）,第2組為皮下注射組（5 x 107個·只-1）,第3組為陰性對照組（生理鹽水）。免疫4周后,摘眼球取血,4℃放置4 h后分離血清（3 000 r·m i n-1,20 min）,-20℃保存。

1.2.2 抗體水平檢測

用間接E L I SA法檢測小鼠血清中Ig G的效價。以B r-P P D蛋白4μg·m L-1的濃度包被96孔酶標板,4℃過夜；T B S-T300μL洗板5次,用1%的B SA封閉（200μL·孔-1）,37℃靜置2 h；每孔加入100μL的20倍開始倍比稀釋的待檢血清,37℃靜置2 h；按1∶2 500稀釋的堿性磷酸酶標記抗小鼠Ig G,洗板后每孔加入100μL,37℃靜置1 h；洗板,每孔加入100 μL的pN P P底物顯色液,室溫避光60 min后,在波長為405 nm處檢測吸光值。

1.2.3 細胞免疫檢測

分泌I F N-γ、I L-4的脾臟淋巴細胞數(shù)目檢測。免疫4周后,分離小鼠脾臟淋巴細胞。取96孔細胞培養(yǎng)板,每孔添加混有2.0 x 106個·m L-1濃度細胞100 μL,分別加入100μL布氏P P D抗原和布氏B p26抗原（終濃度均為10μg·m L-1）2種抗原刺激。每種抗原刺激物做復孔,另用細胞培養(yǎng)液作陰性對照,1孔加C o nA作陽性對照（終濃度為5μg·m L-1）。共同孵育22 h后,按E L I SP 0 T操作,依次加入檢測抗體等試劑,洗板,顯色,計數(shù)斑點數(shù)。

體外再刺激免疫小鼠脾細胞因子產(chǎn)生水平檢測。取48孔細胞培養(yǎng)板,每孔中加2.0 x 106個· m L-1濃度細胞400μL,每孔分別加入50μL布氏P P D抗原和布氏B p26抗原（終濃度為10μg· m L-1）2種抗原刺激。分別以C o nA（終濃度為5 μg·m L-1）和培養(yǎng)基為陽性和陰性對照。37℃, 5%C 02培養(yǎng)箱中孵育22 h,孵育完畢后,對培養(yǎng)物進行離心,取各孔細胞培養(yǎng)液上清,用小鼠I F N-γ、I L-4 E L I SA試劑盒檢測體外不同刺激物刺激小鼠脾細胞分泌I F N-γ、I L-4的情況。

1.2.4 T淋巴細胞亞群分類

將1.2.3中分離的脾臟細胞調(diào)整細胞數(shù)為1.0 x 107個·m L-1,每孔分別加入10μL的刺激物和200μL的細胞,刺激物為布氏P P D抗原和布氏B p26抗原（終濃度為10μg·m L-1）2種抗原,分別用P MA/離子霉素和培養(yǎng)基為陽性和陰性對照,共同孵育3 h后,每孔加入10μL的阻斷劑。12 h后進行胞外C D 3和C D 4及胞內(nèi)I F N-γ、I L-4的染色,流式細胞儀測定,C e l l que s t軟件分析。

1.2.5 布魯氏菌活疫苗免疫保護力檢測

對每組剩余的5只動物皮下攻擊羊種布氏菌M 5弱毒株,攻擊劑量為5 x 108個·只-1,攻擊部位為后肢皮下。4周后斷頸處死動物,無菌取脾臟,通過每個脾臟細菌計數(shù)比較布魯氏菌活苗2種免疫方式的保護效果。

試驗數(shù)據(jù)以ˉX±S表示,各組免疫動物的抗體和細胞因子效價取以10為底的對數(shù)后進行t檢驗；用G r a phP a d P r i s m 6繪圖及SP SS統(tǒng)計軟件分析。結(jié)果以P＜0.05表示差異顯著,具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清中總IgG水平

圖1顯示,陰性小鼠組檢測不到特異性抗體,皮內(nèi)注射組和皮下注射組均能產(chǎn)生高滴度抗體, Ig G效價分別為642.23和640.00,分析表明,兩者間差異不顯著（t=0.006,n=10）。

圖1 血清Ig G抗體效價

2.2 酶聯(lián)免疫斑點（E L I S OP T）

2.2.1 P P D和B p26抗原刺激后分泌I F N-γ的脾臟淋巴細胞數(shù)目

將已形成斑點的96孔板終止反應,自然風干過夜后上計數(shù)儀計數(shù)并拍照,對每孔內(nèi)的斑點進行質(zhì)控。最終斑點計數(shù)顯示（圖2）,皮內(nèi)注射組和皮下注射組在P P D和B p26抗原刺激下分泌的I F N-γ的脾臟淋巴細胞數(shù)均明顯高于陰性對照組,差異顯著；但在P P D抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著（t=3.069,n=10）,在B p26抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比,差異顯著（t= -2.914,n=10）。

圖2 不同刺激物對淋巴細胞分泌I F N-γ斑點數(shù)的影響

2.2.2 P P D和B p26抗原刺激后分泌I L-4的脾臟淋巴細胞數(shù)目

將已形成斑點的96孔板終止反應,自然風干過夜后上計數(shù)儀計數(shù)并拍照,對每孔內(nèi)的斑點進行質(zhì)控。最終斑點計數(shù)顯示（圖3）,皮內(nèi)注射組和皮下注射組在P P D和B p26抗原刺激下分泌的I L-4的脾臟淋巴細胞數(shù)均明顯高于陰性對照組,差異顯著；但在P P D抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著（t=1.986,n=10）,在B p26抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著（t= 1.752,n=10）。

2.3 體外再刺激免疫小鼠脾細胞因子

利用E L I SA方法檢測以P P D抗原和B p26抗原體外刺激小鼠脾細胞分泌I F N-γ、I L-4水平。圖4顯示,在P P D和B p26抗原刺激下,分泌I F N-γ的含量明顯高于陰性組,差異顯著；但在P P D抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著（t=1.714,n=10）,在B p26抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著（t=-1.878,n=10）。I L-4含量很低,超出了標準曲線的檢測限,結(jié)果無統(tǒng)計學意義。

圖3 不同刺激物對淋巴細胞分泌I L-4斑點數(shù)的影響

圖4 不同刺激物體對小鼠脾細胞分泌I F N-γ含量的影響

2.4 T細胞亞群分類

2.4.1 P P D和B p26抗原刺激后C D 4+I F N-γ淋巴細胞比例

圖5顯示,由流式細胞分析儀分析后得到,皮內(nèi)注射組和皮下注射組在P P D和B p26抗原刺激下小鼠的C D 4+I F N-γ細胞比例均高于陰性組,差異顯著；但在P P D抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著（t=0.429,n=10）,在B p26抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著（t=-0.555,n=10）。

2.4.2 P P D和B p26抗原刺激后C D 4+I L-4淋巴細胞比例

圖6顯示,由流式細胞分析儀分析后得到,皮內(nèi)注射組和皮下注射組在P P D和B p26抗原刺激下,小鼠的C D 4+I L-4細胞比例均高于陰性組,差異顯著；但在P P D抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著（t=-0.429,n=10）,在B p26抗原刺激下,皮內(nèi)組與皮下組相比差異不顯著（t=0.2.372,n=10）。

2.5 布魯氏菌活苗免疫保護性

為比較2種免疫方式的免疫保護力,用羊布氏

菌M 5弱毒株皮下攻擊,以脾臟布氏菌載量為指標,評價免疫保護力。表1顯示,皮內(nèi)注射組脾組織含菌數(shù)對數(shù)值的平均數(shù)為0,皮下注射組為2.27 ±0.21,陰性對照組為5.13±0.16。

圖5 不同刺激物刺激小鼠C D 4+I F N-γ淋巴細胞比例

圖6 不同刺激物刺激小鼠C D 4+I L-4淋巴細胞比例

表1 2種方法免疫豚鼠在羊M 5攻擊感染后脾臟細胞中的細菌載量

3 小結(jié)和討論

目前,接種疫苗是世界公認的能夠降低布病發(fā)生和傳播的最有效和最經(jīng)濟的方法。我國采用的是牛種弱毒株104M菌株制成的減毒活疫苗,一般只需接種1次,劑量較小,副反應輕微或無,且免疫效果優(yōu)于滅活疫苗,免疫較持久,能同時產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫,是應用最廣泛的疫苗形式之一。但該疫苗的接種方式為皮上劃痕,不僅接種復雜,不能定量,還經(jīng)常伴有局部或異常反應,使被接種者皮膚有損傷且劃痕時疼痛,同時會遺留疤痕,因此改善布氏疫苗的免疫途徑成為研究的熱點,國內(nèi)外均有學者正在對布氏疫苗的免疫方法進行深入的研究和探索［7-8］。

本試驗用E L I SA法檢測免疫動物血清中總Ig G抗體的含量,結(jié)果顯示,皮內(nèi)組和皮下組Ig G抗體效價分別為642.23和640.00,說明抗體效價并不高,這與試驗預期是相符合的,因為布氏菌是一種胞內(nèi)寄生菌,對其清除起關(guān)鍵作用的是細胞免疫,而體液免疫僅起輔助作用。同時,用E L I SP 0 T法檢測分泌I F N-γ、I L-4的脾臟淋巴細胞數(shù)目時發(fā)現(xiàn),分泌I F N-γ的脾臟淋巴細胞數(shù)高于分泌I L-4的脾臟淋巴細胞數(shù)；用E L I SA方法檢測體外再刺激后小鼠脾細胞分泌細胞因子的情況時發(fā)現(xiàn),I F N-γ的分泌水平遠遠高于I L-4；這說明T h1細胞是參與細胞免疫的主要免疫細胞,這與減毒活疫苗的作用機理相符［9-10］。

疫苗的效力測定試驗是評價疫苗免疫保護性最可靠指標。傳統(tǒng)對布氏疫苗的研究主要是使用豚鼠,效力試驗用強毒株攻擊,本研究參照中國藥典效力測定的方法［11］,以小鼠為動物模型,羊布氏菌M 5弱毒株攻擊,大大提高了試驗的經(jīng)濟性和安全性。結(jié)果顯示,皮內(nèi)注射組脾臟中布氏菌數(shù)量的對數(shù)值為0,皮下注射組為2.27±0.21,該數(shù)據(jù)說明皮內(nèi)注射可大大增強機體對抗布氏菌的保護力,提示通過皮內(nèi)注射布氏疫苗可能是安全、高效的免疫途徑,為研究布氏菌活疫苗接種途徑奠定基礎(chǔ)。

雖然皮下和皮內(nèi)2種免疫途徑均能誘導顯著高于對照組的體液免疫和細胞免疫應答,但兩者在誘導體液和細胞免疫應答的強度上并無顯著差異,而在保護力試驗中,皮內(nèi)注射組卻顯著優(yōu)于皮下注射組,這說明保護力的高低和免疫應答的強度之間并無明顯正相關(guān)聯(lián)系,本課題組會就該課題繼續(xù)進行深入研究。

［1］ 賈文祥.醫(yī)學微生物學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社, 2010：177.

［2］ 郭玉金,田桂芹,普燕芳,等.臨床藥師參與1例布魯氏菌病診療過程分析［J］.中國病原生物學雜志,2011,6（11）：845-847.

［3］ 許彥萍,蘆文明,衛(wèi)學東.淺談布魯氏菌病的流行及防控［J］.中國畜牧獸醫(yī)文摘,2013（12）：81.

［4］ 任光文,柳根潭.布魯氏菌病的防控［J］.中國畜牧獸醫(yī)文摘,2013（11）：80-81.

［5］ 劉景福,李恪梅,佘菲菲,等.四唑鎓鹽法快速檢測布氏菌疫苗活菌含量的建立［J］.中國地方病防治雜志, 2011,26（2）：103-106.［6］ 李恪梅,王國治,黃健,等.布氏菌素純蛋白衍生物的研制［J］.中國地方病防治雜志,1995,10（5）：268.

［7］ 陳成,魏東,李恪梅,等.注射用布氏菌活疫苗免疫學評價［C］//中國藥學會.2013年中國藥學大會暨第十三屆中國藥師周論文集.北京：中國藥學會,2013：7.

［8］WangZ, Wu Q.Research progressin liveattenuated brucellavaccine development ［ J］. Current PharmaceuticalBiotechnology, 2013.

［9］ 姚俊峰.禽沙門氏菌病、疫苗和免疫保護機制：現(xiàn)狀和前景［J］.國外畜牧學：豬與禽,2013（1）：34-38.

［10］ 謝勇飛.布魯氏菌減毒活疫苗株a dh缺失標記及其鑒別診斷研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學,2011.

［11］ 國家藥典委員會.中國人民共和國藥典［M］.3部.北京：化學工業(yè)出版社,2005：77-79.

（責任編輯：張瑞麟）

S 829.1文獻標志碼：A文章編號：0528-9017（2014）05-0767-04

2014-03-17

重大新藥創(chuàng)制科技重大專項（2014Z X 09304311-002）

解曉露（1989-）,女,安徽合肥人,碩士生,研究方向為免疫學。E-mail：x i a o l ux i e 126@126.com。

王國治。E-mail：t bt e s t l a b@v i p.t o m.com。

黃長江。E-mail：c j hua ng 5711@163.com。

文獻著錄格式：解曉露,陳成,魏東,等.布氏菌活疫苗皮內(nèi)與皮下接種的免疫效果評價［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學,2014（5）：767-770,779.