于西佼　杜毅　唐開(kāi)亮

【摘要】 目的：探討CD4+CD25+Treg在牙周炎發(fā)生時(shí)的免疫調(diào)節(jié)作用。方法：選擇35只成年SPF級(jí)Wistar大鼠，絲線結(jié)扎加高糖飲食建立大鼠牙周炎發(fā)生的動(dòng)物模型，獲得類似牙周炎自然病程的連續(xù)組織標(biāo)本，病理切片確定病損，分別獲取第4、8、12、16周的大鼠外周血，術(shù)前未結(jié)扎組對(duì)照。以流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同時(shí)段外周血中CD4+CD25+Treg的比例變化。結(jié)果：建立了Wistar大鼠牙周炎發(fā)生的動(dòng)物模型，病理切片確定了牙周病損的存在。結(jié)果顯示伴隨牙周炎發(fā)生的牙槽骨的吸收逐漸增多。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示結(jié)扎后第4、8、12、16周外周血中CD4+CD25+Treg占CD4+T細(xì)胞的比例為7.70%、9.12%、9.74%、10.31%，與術(shù)前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：外周血中CD4+CD25+Treg自牙周炎發(fā)生早期逐漸升高，牙周炎發(fā)生發(fā)展規(guī)律一致，從而證實(shí)CD4+CD25+Treg細(xì)胞參與介導(dǎo)了牙周炎發(fā)生的免疫調(diào)控。

【關(guān)鍵詞】 牙周炎發(fā)生； CD4+CD25+T細(xì)胞； 免疫調(diào)節(jié)

CD4+CD25+Treg的免疫調(diào)節(jié)作用已經(jīng)成為免疫學(xué)研究的前沿課題，并取得了令人矚目的進(jìn)展[1]。研究表明：CD4+CD25+Treg作為一個(gè)具有獨(dú)立功能的T細(xì)胞亞型，在維持免疫系統(tǒng)平衡過(guò)程中有著不可代替的作用[2]。在機(jī)體自我耐受、抗腫瘤、抗感染等重要免疫功能方面起著中心作用[3-4]。目前CD4+CD25+Treg在牙周炎發(fā)生時(shí)的免疫調(diào)節(jié)作用的研究仍較少。本研究動(dòng)態(tài)觀察處于牙周炎發(fā)生不同時(shí)期的外周血中CD4+CD25+Treg的比例變化，探討CD4+CD25+Treg在牙周炎發(fā)生時(shí)的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 35只成年SPF級(jí)Wistar大鼠，體重300～350 g，雌雄各半，購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。CD4-FITC抗體、CD25-PE抗體、PE-IgG1及FITC-IgG1同型對(duì)照抗體均購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司，流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 大鼠牙周炎模型的建立 氯胺酮腹腔注射（100 mg/kg）麻醉下，采用直徑為0.2 mm的正畸鋼絲分別從雙側(cè)下頜舌側(cè)穿過(guò)磨牙間隙，環(huán)繞第一磨牙牙頸部結(jié)扎。術(shù)后采用高糖飼料（蔗糖56 g、脫脂奶粉28 g、面粉6 g、酵母粉4 g、肝粉1 g、少量食鹽和新鮮蔬菜）和200 g/L高糖水進(jìn)行喂養(yǎng)，術(shù)后4、8、12、16周，隨機(jī)抽取以上各7只，氯胺酮腹腔注射麻醉下肉眼觀察牙周組織變化，并做臨床檢查，探診出血及牙周袋探診，制作下頜磨牙牙體牙周標(biāo)本。術(shù)前未結(jié)扎組7只為對(duì)照。

1.3 觀察指標(biāo) （1）齦溝出血指數(shù)（sulus bleeding index， SBI）：大鼠處死前，用探針輕探選用牙的牙周袋或齦溝10 s，不出血為0，出血為1。（2）探診深度（probing depth， PD）：大鼠處死后，用牙周探針探選用牙的牙周袋，每牙選近中頰、頰側(cè)、遠(yuǎn)中頰3個(gè)點(diǎn)測(cè)量，取均值。（3）牙槽骨吸收值（alveolar bone loss， ABL）：大鼠處死取牙齦組織標(biāo)本后，在4倍體視顯微鏡下測(cè)量從釉牙骨質(zhì)界到牙槽骨嵴頂?shù)拈L(zhǎng)度，每牙選近中舌、舌側(cè)、遠(yuǎn)中舌3個(gè)點(diǎn)測(cè)量，取均值。（4）組織學(xué)觀察：用新鮮配制的多聚甲醛溶液行心臟體外循環(huán)內(nèi)灌注，多聚甲醛液固定，混合酸脫鈣梯度乙醇脫水，石蠟包埋，常規(guī)染色光鏡下觀察。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 每只大鼠心臟采血（約0.5 mL），儲(chǔ)存于EDTA抗凝管中，放置于4℃冰箱待測(cè)。加外周血50 μL至檢測(cè)管和對(duì)照管中；分別加入Anti-RatCD4-FITC 1 μL、Anti-RatCD25 Percp-eFluor710 0.5 μL和MouseIgG1kIsotype controlPercp-eFluor710 0.5 μL，混勻，室溫下暗處放置15 min；加0.5 mL新鮮準(zhǔn)備的固定/破膜液，混勻，4 ℃冰箱放置45 min；加2 mL新鮮配制的1×破膜液，1800 r/min離心5 min，去上清，混勻；重復(fù)1次；加Anti-Mouse/RatFoxp3-PE和RatIgG2akIsotypecontrol-PE 5 μL，混勻，4 ℃冰箱放置30 min；加1 mL 1×破膜液1800 r/min離心5 min，洗滌1次；加0.5 mL1%多聚甲醛重懸，上流式細(xì)胞儀分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件包對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠牙周炎模型的建立 建立了Wistar大鼠牙周炎發(fā)生的動(dòng)物模型；體視顯微鏡下觀察骨的吸收情況，測(cè)量從釉牙骨質(zhì)界到牙槽骨嵴頂?shù)拈L(zhǎng)度，每牙選近中舌、舌側(cè)、遠(yuǎn)中舌3個(gè)點(diǎn)測(cè)量，取均值，牙周炎發(fā)生的牙槽骨的吸收逐漸增多。見(jiàn)圖1。

圖1 牙槽骨吸收量

2.2 牙周炎發(fā)生不同時(shí)期CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)變化 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示結(jié)扎后第4、8、12、16周，外周血中CD4+CD25+Treg占CD4+T細(xì)胞的比例為7.70%，9.12%，9.74%，10.31%，與術(shù)前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 不同時(shí)期CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)改變

3 討論

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中最為重要的一群[5]。天然的CD4+CD25+T細(xì)胞主要來(lái)源于胸腺，這部分稱為固有性CD4+CD25+T細(xì)胞，其產(chǎn)生于胸腺，然后遷移到外周發(fā)揮作用，CD4+CD25+Treg胸腺細(xì)胞與外周的CD4+CD25+Treg一樣，表現(xiàn)對(duì)經(jīng)由TCR的抗原刺激呈低反應(yīng)性，并且顯示抑制其他T細(xì)胞增殖的能力。這些在胸腺發(fā)育成熟后進(jìn)人外周淋巴組織CD4+CD25+Treg，主要在預(yù)防病理性自身免疫反應(yīng)方面起作用[6]。在外周，有抗原刺激（如TGF-β）或免疫抑制因子（如IL-10）誘導(dǎo)的條件下，成熟T細(xì)胞也可分化CD4+CD25+Treg，這部分稱適應(yīng)性CD4+CD25+Treg主要在微生物感染和移植免疫中起作用。endprint

CD4+CD25+Treg在許多感染性疾病，尤其是在慢性持續(xù)感染中均存在免疫抑制作用[7-8]。這種免疫抑制作用有利于病原體存活，但同時(shí)也避免了機(jī)體過(guò)度免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的病理?yè)p害。RA是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg與RA密切相關(guān)。與正常小鼠相比，通過(guò)注射抗CD25的單抗去CD4+CD25+Treg的小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎更重，抗Ⅱ型膠原抗體的濃度更高。主動(dòng)轉(zhuǎn)移CD4+CD25+Treg細(xì)胞后，可以明顯減緩疾病進(jìn)展，明顯降低關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，而且主動(dòng)轉(zhuǎn)移后不久即可在炎癥性滑膜處發(fā)CD4+CD25+Treg，從而說(shuō)明調(diào)節(jié)作用在關(guān)節(jié)局部發(fā)生[9]。本研究結(jié)果表明，伴隨大鼠牙周炎病損的確立外周血中CD4+CD25+Treg比例逐漸升高，機(jī)體通過(guò)調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg控制炎癥免疫的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)

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[9]李曉娟， 胡義平， 劉雋永.CD4_CD25_Foxp3_調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療[J]. 現(xiàn)代免疫學(xué)， 2009， 29（6）：514-519.

（收稿日期：2013-07-29） （本文編輯：黃新珍）endprint

CD4+CD25+Treg在許多感染性疾病，尤其是在慢性持續(xù)感染中均存在免疫抑制作用[7-8]。這種免疫抑制作用有利于病原體存活，但同時(shí)也避免了機(jī)體過(guò)度免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的病理?yè)p害。RA是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg與RA密切相關(guān)。與正常小鼠相比，通過(guò)注射抗CD25的單抗去CD4+CD25+Treg的小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎更重，抗Ⅱ型膠原抗體的濃度更高。主動(dòng)轉(zhuǎn)移CD4+CD25+Treg細(xì)胞后，可以明顯減緩疾病進(jìn)展，明顯降低關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，而且主動(dòng)轉(zhuǎn)移后不久即可在炎癥性滑膜處發(fā)CD4+CD25+Treg，從而說(shuō)明調(diào)節(jié)作用在關(guān)節(jié)局部發(fā)生[9]。本研究結(jié)果表明，伴隨大鼠牙周炎病損的確立外周血中CD4+CD25+Treg比例逐漸升高，機(jī)體通過(guò)調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg控制炎癥免疫的發(fā)生。

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（收稿日期：2013-07-29） （本文編輯：黃新珍）endprint

CD4+CD25+Treg在許多感染性疾病，尤其是在慢性持續(xù)感染中均存在免疫抑制作用[7-8]。這種免疫抑制作用有利于病原體存活，但同時(shí)也避免了機(jī)體過(guò)度免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的病理?yè)p害。RA是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg與RA密切相關(guān)。與正常小鼠相比，通過(guò)注射抗CD25的單抗去CD4+CD25+Treg的小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎更重，抗Ⅱ型膠原抗體的濃度更高。主動(dòng)轉(zhuǎn)移CD4+CD25+Treg細(xì)胞后，可以明顯減緩疾病進(jìn)展，明顯降低關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，而且主動(dòng)轉(zhuǎn)移后不久即可在炎癥性滑膜處發(fā)CD4+CD25+Treg，從而說(shuō)明調(diào)節(jié)作用在關(guān)節(jié)局部發(fā)生[9]。本研究結(jié)果表明，伴隨大鼠牙周炎病損的確立外周血中CD4+CD25+Treg比例逐漸升高，機(jī)體通過(guò)調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg控制炎癥免疫的發(fā)生。

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