馬耀宏，孟慶軍，楊艷，楊俊慧，崔進(jìn)梅

（1.山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗室，山東濟(jì)南250014；2.山東技師學(xué)院，山東濟(jì)南250014）

大曲糖化力的快速測定方法

馬耀宏1，孟慶軍1，楊艷1，楊俊慧1，崔進(jìn)梅2

（1.山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗室，山東濟(jì)南250014；2.山東技師學(xué)院，山東濟(jì)南250014）

糖化力為大曲質(zhì)量控制的主要指標(biāo)，準(zhǔn)確快速的測定糖化力對大曲生產(chǎn)質(zhì)量的控制具有重要意義。該文用還原糖測定儀建立了大曲糖化力快速測定方法，并與常規(guī)手工滴定方法進(jìn)行比較。測定結(jié)果顯示，還原糖測定儀法變異系數(shù)較手工方法小，回收率也優(yōu)于手工方法。此法可作為酒曲中糖化力快速測定方法。

糖化力；大曲；還原糖；還原糖測定儀

“曲是酒之骨”[1-2]。在釀酒生產(chǎn)過程，大曲對于提高出酒率、降低糧耗、增加優(yōu)質(zhì)品率、保持香型穩(wěn)定等方面有著重要的作用[3-5]。糖化力是衡量大曲糖化作用強(qiáng)弱的一個重要指標(biāo)，指的是大曲中具有糖化作用的酶及微生物將淀粉轉(zhuǎn)化為糖分的能力[2，6-7]。大曲糖化力的高低受原料結(jié)構(gòu)、上霉情況及大火期溫度等諸多因素的影響[7-9]，是大曲最為重要的理化指標(biāo)之一。糖化力的準(zhǔn)確快速測定對指導(dǎo)生產(chǎn)起著重要作用。目前國內(nèi)糖化力的測定方法主要是采用手工滴定方法，也有采用流動分析儀和生化分析儀測定糖化力的報道[10-13]。本研究應(yīng)用還原糖測定儀對大曲糖化力測定進(jìn)行較系統(tǒng)的研究，并與手工滴定方法進(jìn)行比較，建立了一種基于還原糖測定儀的大曲糖化力快速分析方法[14]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 大曲

清香型大曲由山西某酒廠提供，分別記為1#、2#、3#和4#樣品。

大曲樣液制備：根據(jù)測得大曲試樣的水分，稱取相當(dāng)于絕干試樣量10g，精確至0.001g，放入250mL燒杯中，加20mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，再加水，用玻璃棒攪拌均勻，定容至200mL。將上述燒杯置于35℃恒溫水浴中保溫浸漬1h，過濾，收集濾液，備用。

1.1.2 其他試劑

斐林試劑甲液：稱取15.6g硫酸銅（CuSO4·5H2O）及0.05g次甲基藍(lán)溶于蒸餾水中，并定容至1 000mL。

斐林試劑乙液：稱取50g酒石酸鉀鈉及54g氫氧化鈉溶于蒸餾水中，再加入4g亞鐵氯化鉀，完全溶解后，用蒸餾水定容至1 000mL。

0.25 %標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：稱取105℃烘箱中干燥至質(zhì)量恒定的分析純葡萄糖2.5g（精確稱取至0.1mg），溶于蒸餾水中并稀釋定容至l 000mL。

pH4.6醋酸-醋酸鈉緩沖液：2mol/L醋酸：取118mL冰醋酸用水稀釋至1L；2mol/L醋酸鈉：稱取醋272g酸鈉（CH3COONa·3H2O）溶于水，稀釋至1L。將兩溶液等體積混合，即為pH4.6醋酸-醋酸鈉緩沖液。

20%氫氧化鈉溶液：稱取20g氫氧化鈉，溶于水，稀釋至100mL。

20g/L可溶性淀粉溶液：用分析天平準(zhǔn)確稱取干燥后的可溶性淀粉2g（精確到0.001g），于50mL燒杯中用少量水調(diào)勻后，倒入盛有70mL沸水的150mL燒杯中，并用20mL水洗凈50mL小燒杯，洗液合并其中，用微火煮沸至透明，冷卻后用水定容至100mL。

1.1.3 還原糖測定儀法試劑

斐林甲液：硫酸銅（CuSO4·5H2O）11.74g，1%次甲基蘭7mL，以蒸餾水定容至500mL。

斐林乙液：氫氧化鈉（NaOH）126.4g，酒石酸甲鈉（C4H4O6KNa·4H2O）117.0g，亞鐵氰化鉀（K4F4（CN）6·3H2O）9.4g，以蒸餾水定容至500mL。

0.1 %標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖（C6H12O6）溶液：準(zhǔn)確稱取1.00g烘干葡萄糖，溶解并加入5mL鹽酸，以蒸餾水定容至1 000mL。

0.7 %標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：準(zhǔn)確稱取7.00g烘干葡萄糖，溶解并加入5mL鹽酸，以蒸餾水定容至1 000mL。

1.2 儀器與設(shè)備

SGD-Ⅳ全自動還原糖測定儀：山東省科學(xué)院生物研究所；FFLAT18恒溫水?。河鳥ibby Scientific公司。1.3實(shí)驗方法

1.3.1 手工滴定法

①于一試管內(nèi)加入25.0mL質(zhì)量濃度20g/L可溶性淀粉溶液，再加5.0mL大曲樣液，搖勻，加入20%NaOH溶液1mL后，吸取5.0mL作為空白溶液，用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，記錄其消耗體積V1。

②于另一試管內(nèi)加入25.0mL質(zhì)量濃度20g/L可溶性淀粉溶液，再加5.0mL大曲樣液，搖勻，置于35℃恒溫水浴中，準(zhǔn)確計時，糖化1h，加入20%NaOH溶液1mL后，吸取糖化液5.0mL于盛有手工斐林溶液甲、乙液各5.0mL的錐形瓶中，加水10mL，用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，記錄其消耗體積V2。

③結(jié)果計算

試樣的糖化力以下公式計算：

式中：X為試樣的糖化力，mg/（g·h）；V1為滴定空白時，消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2為滴定試樣時，消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；2.5為每毫升葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中含有葡萄糖的質(zhì)量，mg；30為糖化混合液（可溶性淀粉溶液加大曲樣液）的總體積，mL；0.25為5mL大曲樣液相當(dāng)大曲的質(zhì)量，g；5為滴定時吸取的糖化液體積，mL。

1.3.2 還原糖儀器分析方法[11，14]

①SGD-Ⅳ全自動還原糖測定儀-根據(jù)大曲酶活力測定區(qū)間對山東省科學(xué)院生物研究所的軟件及采樣程序進(jìn)行調(diào)整。

②標(biāo)定

按“開/關(guān)”鍵，自動啟動程序。儀器自動進(jìn)行空白對照測定，完成對照測定后自動進(jìn)入定標(biāo)程序，試劑泵啟動后，用移液器將5.00mL 0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)品注入反應(yīng)池，完成后儀器自動定標(biāo)。

③測定

a）空白測定方法

于一試管內(nèi)加入25.0mL質(zhì)量濃度20g/L可溶性淀粉溶液，再加5.0mL大曲樣液，搖勻，加入20%NaOH溶液1mL后，吸取5.0mL作為空白溶液，用全自動還原糖測定儀測定，記錄還原糖測定值G空白（g/L）。

或者吸取5.0mL質(zhì)量濃度20g/L可溶性淀粉溶液用全自動還原糖測定儀測定，記錄還原糖測定值G淀粉空白（g/L）；同時吸取5.0mL大曲樣液用全自動還原糖測定儀測定，記錄還原糖測定值G酶液空白（g/L）。

b）糖化試樣測定方法

于另一試管內(nèi)加入25.0mL可溶性淀粉溶液，再加5.0mL大曲樣液，搖勻，置于35℃恒溫水浴中，準(zhǔn)確計時，糖化1h，加入20%NaOH溶液1mL后，吸取糖化液1.00mL，加蒸餾水4.00mL，用全自動還原糖測定儀測定，記錄測定值G測定（g/L）。

c）糖化力計算

大曲的糖化力按以下公式計算：

式中：X為試樣糖化力，mg/（g·h）；5為進(jìn)樣量稀釋倍數(shù)；120為糖化力轉(zhuǎn)換系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 精確度試驗

采用手工滴定法和還原糖測定儀儀器分析法同時測定4種酒曲的糖化力，每個樣品進(jìn)行6次平行測定。測定結(jié)果分別見表1～表4。

表1 1#大曲糖化力測定結(jié)果Table 1 Saccharifying power of Daqu No.1

表2 2#大曲糖化力測定結(jié)果Table 2 Saccharifying power of Daqu No.2

表3 3#大曲糖化力測定結(jié)果Table 3 Saccharifying power of Daqu No.3

表4 4#大曲糖化力測定結(jié)果Table 4 Saccharifying power of Daqu No.4

由表1～表4可知，手工滴定法測定值波動的較大，手工滴定法變異系數(shù)明顯高于還原糖儀器分析法。

手工滴定法標(biāo)準(zhǔn)偏差在以上4組測定中相對穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)值較大，可能與手工滴定法的測定受滴定速度、蒸發(fā)量、攪拌速度、加熱功率和終點(diǎn)判斷等諸多因素影響有關(guān)。還原糖測定儀采用補(bǔ)色技術(shù)原理進(jìn)行終點(diǎn)判斷消除人為誤差影響，同時儀器分析法恒定了滴定速度、蒸發(fā)量、攪拌速度、加熱功率等影響，測定結(jié)果準(zhǔn)確度與穩(wěn)定性明顯提高。

2.2 回收率試驗

向4#樣品糖化完成時添加標(biāo)準(zhǔn)無水葡萄糖0.103 0g樣品（相當(dāng)于增加糖化力412mg/（g·h），用2種方法對加樣后樣品和未加樣樣品進(jìn)行測定，計算加入葡萄糖的回收率，結(jié)果見表5。

表5 加標(biāo)回收率測定結(jié)果Table 5 Result of adding standard recovery measurement

由表5可知，手工滴定法回收率為87.9%～116.7%，平均回收率105.6%；還原糖儀器分析法回收率為100.9%～103.7%，平均回收率102.3%；手工滴定法回收率明顯波動大，還原糖儀器分析法回收率測定優(yōu)于手工滴定法。

3 結(jié)論

大曲是白酒生產(chǎn)的糖化發(fā)酵劑，其質(zhì)量決定白酒的產(chǎn)量與酒質(zhì)[15]。大曲糖化力是評價大曲質(zhì)量的重要生化指標(biāo)。目前，各大白酒企業(yè)大都仍然在使用手工滴定方法測定大曲樣品的糖化力，結(jié)果往往誤差較大，不同的企業(yè)測定結(jié)果往往無法比較，不能真實(shí)準(zhǔn)確反映大曲的淀粉酶活性和糖化菌群特點(diǎn)。

還原糖儀器法采用補(bǔ)色光度原理，可以不受樣品顏色、濁度干擾，準(zhǔn)確測定反應(yīng)的終點(diǎn)，儀器恒定了滴定反應(yīng)的溫度，滴定速度，攪拌速度，蒸發(fā)量等外部條件，因此測定準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性較高。另外，儀器法測定全周期2min左右，方便快捷，是一種較好的測定酒曲糖化力的方法。

我國傳統(tǒng)的發(fā)酵方式，尤其是固體發(fā)酵方式，過程檢測手段相對落后。不斷研究采用先進(jìn)的儀器分析方法，來逐步取代主觀誤差較大的傳統(tǒng)手工分析方法，提升傳統(tǒng)發(fā)酵過程檢測的技術(shù)水平，更好地對傳統(tǒng)的以感官經(jīng)驗為基礎(chǔ)的固體發(fā)酵工藝進(jìn)行模擬和數(shù)字化表征，以提高古老傳統(tǒng)工藝科學(xué)化、現(xiàn)代化水平。

[1]韓興林，王建耀，王廣峰，等.清香型大曲糖化力的簡單分析[J].釀酒科技，2009（9）：68-70.

[2]唐玉明，沈才洪，任道群，等.酒曲理化品質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性探討[J].釀酒科技，2006（7）：37-41.

[3]敖宗華，陜小虎，沈才洪，等.國內(nèi)主要大曲相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及研究進(jìn)展[J].釀酒科技，2010（2）：104-108.

[4]牛廣杰，劉軍，黃治國.高溫大曲理化因子動態(tài)演變的研究[J].中國釀造，2010，29（10）：53-55.

[5]鄭淑芳，冷明新.酒、醋用曲糖化力測定方法淺析究[J].山西食品工業(yè)，2002（4）：39-40.

[6]ZHENG X W,ZHENG Y,HAN B Z,et al.Complex microbiota of a Chinese“Fen”liquor fermentation starter(Fen-Daqu)revealed by culture-dependent and culture-independent methods[J].Food Microbiol,2012,31 (2):293-300.

[7]張秀紅，馬冰，李素琴，等.清香型大曲淀粉水解酶測定方法研究[J].釀酒科技，2012（10）：115-118.

[8]李超，穆琳，王建耀，等.汾型大曲的理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)分析[J].中國釀造，2009，28（1）：140-142.

[9]謝善慈.釀酒用米曲霉酶活特性研究[J].中國釀造，2009，28（2）：132-133.

[10]宗緒巖，羅惠波，黃治國，等.自動化學(xué)分析儀快速檢測大曲糖化力方法研究[J].中國釀造，2012，31（2）：162-164.

[11]馬耀宏，鄭嵐，楊俊慧，等.柱前衍生化HPLC分析真菌多糖單糖組成[J].食品科技，2012，37（1）：254-259.

[12]SHI J G,ZHU S R,ZHOU W L,et al.Biosensor for online glucose analysis and fed-batch control[C]//The Eleventh China-Japan-Korea on enzyme engineering,Chengdu,China:2010.

[13]SHI J G,ZHU S R,ZHOU W L,et al.Immobilized enzyme biosensor system for online monitoring glucose in fermentation process[C]//BIT’s 2nd symposium on enzymes&biocatalysis-2011,Dalian,China:2011.

[14]馬耀宏，史建國，楊俊慧，等.果汁飲料中還原糖快速測定技術(shù)的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（6）：104-106.

[15]顧國賢.釀酒酒工藝學(xué)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2000.

Rapid determination of saccharifying power of Daqu

MA Yaohong1,MENG Qingjun1,YANG Yan1,YANG Junhui1,CUI Jinmei2
(1.Shandong Province Key Laboratory of Biosensors,Biology Institute of Shandong Academy of Science,Jinan 250014,China; 2.Shandong Technician Institute,Jinan 250014,China)

Saccharifying power is a key index to measure the Daqu quality.It is very important to analyze saccharifying power of Daqu quickly and rapidly in controlling Daqu quality.A new rapid method for detecting the saccharifying power was established by reducing sugar analyzer.The results showed that the variable coefficient and recovery of saccharifying power were better than manual titration method.It can be used for rapid determination of saccharifying power.

saccharifying power;Daqu;reducing sugar;reducing sugar analyzer

O652.9

A

0254-5071（2014）03-0128-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.031

2014-01-17

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃‘863計劃’（2012AA021201）

馬耀宏（1970-），男，副研究員，碩士，研究方向生化分析、發(fā)酵過程優(yōu)化與控制。