曾 錚，張亦陳，劉逸塵，郝 彤，孫金生，2

（1.天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387；2.天津市水生動物疫病預(yù)防控制中心，天津300221）

蝦蟹是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物.近年來，隨著市場需求的增加，蝦蟹養(yǎng)殖規(guī)模持續(xù)擴(kuò)大，產(chǎn)業(yè)化水平也逐年提高.長期以來，蝦蟹養(yǎng)殖過程中由細(xì)菌、病毒等引起的病害十分嚴(yán)重，制約了蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展[1].目前，對蝦蟹的免疫器官和免疫系統(tǒng)組分仍缺乏全面系統(tǒng)的了解，這也是蝦蟹病害不能被有效預(yù)防和治療的重要原因之一.

表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）是從一個隨機(jī)的cDNA克隆進(jìn)行5’端和3’端單一測序獲得的短cDNA部分序列，代表完整基因的一小部分，在數(shù)據(jù)庫中其長度一般為20～7000bp，平均長度為400bp[2].1991年Adams等[3]首次應(yīng)用EST技術(shù)研究人腦基因的表達(dá)狀況，迄今為止，EST技術(shù)在了解生物的基因組成和環(huán)境脅迫特異性表達(dá)方面發(fā)揮了重要作用.近年來，蝦蟹的EST序列測定工作取得很大進(jìn)展，如凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、斑節(jié)對蝦（Penaeus mondon）、中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、藍(lán)蟹（Callinectes sapidus）等蝦蟹的EST序列已被注冊到NCBI的dbEST數(shù)據(jù)庫中.這些已公布的蝦蟹EST序列為我們進(jìn)一步了解蝦蟹基因在不同組織或細(xì)胞中的特異性表達(dá)和尋找免疫、繁殖、生長等基因提供了大量信息.

數(shù)據(jù)挖掘與系統(tǒng)分析是獲得大量序列結(jié)果之后面臨的主要問題.通過對海量數(shù)據(jù)的全面系統(tǒng)分析，找出目標(biāo)序列，對開展深入研究至關(guān)重要.NCBI數(shù)據(jù)庫通過綜合不同實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果，得到了大量中國明對蝦和中華絨螯蟹的基因注釋信息.本研究在此基礎(chǔ)上，使用Blast2GO軟件從已公布的中國明對蝦和中華絨螯蟹EST序列中，篩選出尚未經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的推測的免疫相關(guān)基因，并研究中華絨螯蟹免疫基因在不同細(xì)胞或組織中的分布情況.

1 材料和方法

1.1 EST序列的獲得

中國明對蝦和中華絨螯蟹的EST序列下載自GenBank的子庫dbEST.其中，中國明對蝦EST序列有10512條，中華絨螯蟹EST序列有17067條.

1.2 分析平臺和相關(guān)軟件

Blast2GO是一個基于java的集序列功能注釋和注釋數(shù)據(jù)分析為一體的工具，具有易操作、界面友好、高通量等特點(diǎn)[4].Perl程序Chimeric_Check.pl和PolyA_Check.pl來自文獻(xiàn)［2］，分別用來去除嵌合序列和檢查polyA、polyT的序列條數(shù).CAP3是序列拼接程序[5]，由 http：//seq.cs.iastate.edu/cap3.html下載得到.

1.3 對EST進(jìn)行序列分析

下載得到的EST序列文件中包含在不同時間由不同實(shí)驗(yàn)室提交的同一物種的不同器官、組織或細(xì)胞的所有EST.本研究認(rèn)為序列號連續(xù)并注釋相同的EST為一批序列，使用程序提取出來供后續(xù)分析.在文庫構(gòu)建過程中可能會產(chǎn)生嵌合序列，中間有很長的polyA或載體序列[2]，使用Chimeric_Check.pl將嵌合序列去除.此外，若EST序列兩端存在poly A或者poly T，說明該序列表示的cDNA可能被完全測通，能夠代表完整的mRNA信息[2].使用PolyA_Check.pl查找poly A和poly T的序列，并去除序列中的poly A和poly T.使用CAP3對序列進(jìn)行聚類拼接，參數(shù)選擇默認(rèn)設(shè)置，得到的結(jié)果被視為Unigene.最后使用Blast2GO軟件注釋Unigene，Blasting步驟選用blastx默認(rèn)設(shè)置.

1.4 篩選免疫基因

本研究通過篩選免疫相關(guān)GO注釋和檢索免疫關(guān)鍵詞2種方法尋找免疫基因.Blast2GO軟件在Annotation步驟中按照所設(shè)參數(shù)選取GO注釋，并在Analysis步驟中返回GO注釋餅圖，選擇GO注釋可被追溯至第 2層 GO術(shù)語 GO：0002376（immune system process）的所有基因?yàn)槊庖呋?另外，使用免疫基因的名稱和注釋信息作為檢索關(guān)鍵詞，分析Blasting過程中blastx的注釋結(jié)果文件，提取出相關(guān)基因.關(guān)鍵詞來源于免疫相關(guān)文獻(xiàn)資料，包括蝦、蟹、鱟等EST分析和綜述性文章中出現(xiàn)的免疫基因注釋信息[6-10].關(guān)鍵詞有140個，涉及模式識別蛋白、蛋白酶和蛋白酶抑制劑、酚氧化酶原激活系統(tǒng)、細(xì)胞毒性活性氧等14大類.例如，一個關(guān)鍵詞“phenoloxidase”可以完成“phenoloxidase（PO）”、“prophenoloxidase（proPO）”、“prophenoloxidase activating factor（PPAE）”和“prophenoloxidase activating enzyme（PPAE）”全檢索到.為了提高檢索的準(zhǔn)確性，研究中對整個過程進(jìn)行人工核查.

2 結(jié)果與分析

2.1 EST數(shù)據(jù)分析和注釋結(jié)果

分析下載得到的EST數(shù)據(jù)顯示，中國明對蝦僅有頭胸部（cephalothorax）的EST信息，中華絨螯蟹的EST序列包括血細(xì)胞、肝胰腺（hepatopancreas）、性腺（sex gland）、精巢（testis）.其中，中華絨螯蟹血細(xì)胞的EST序列有2套，為不同時間不同實(shí)驗(yàn)室提交的序列，在注釋上表現(xiàn)也不同，本研究分別使用血細(xì)胞Ⅰ（hemocyte）和血細(xì)胞Ⅱ（haemocyte）加以標(biāo)識，采用同一種方法分別處理.EST序列經(jīng)CAP3軟件聚類拼接后獲得相應(yīng)的Unigene，結(jié)果如表1所示.

表1 EST序列分析數(shù)目統(tǒng)計(jì)Tab.1 Statistics number of EST sequences analysis 條

由表1可知，除性腺的EST外，其余細(xì)胞或組織的EST中都發(fā)現(xiàn)了嵌合序列.其中，中國明對蝦頭胸部EST的嵌和序列數(shù)量最多，中華絨螯蟹精巢EST中嵌和序列所占比例則最高.除性腺外，其余細(xì)胞或組織的EST中都有包含polyA和polyT的EST.中國明對蝦頭胸部含有polyA的EST數(shù)目最多，所占比例也最高.經(jīng)CAP3軟件將EST聚類拼接后形成的序列為Unigene，中國明對蝦頭胸部EST拼接后獲得的Unigene最多，中華絨螯蟹中，血細(xì)胞ⅡEST拼接獲得的Unigene最多，性腺中最少.

Blast2GO注釋結(jié)果如表2所示.經(jīng)blastx比對，中國明對蝦頭胸部被注釋的Unigene數(shù)量最多，占Unigene總量的33.52%；中華絨螯蟹肝胰腺Unigene注釋的比例最高，達(dá)到53.06%；中華絨螯蟹性腺中被注釋的Unigene數(shù)量最少.

表2 Blast2Go注釋過程中各步驟注釋到的序列條數(shù)Tab.2 Number of Unigene statistic in each annotation step by Blast2Go 條

2.2 免疫基因篩選結(jié)果

通過Blast2GO統(tǒng)計(jì)第2層的生物過程GO分布，得到與第2層GO術(shù)語GO：0002376（immune system process）有關(guān)的基因，包括中國明對蝦頭胸部、中華絨螯蟹血細(xì)胞Ⅰ、肝胰腺、性腺、精巢的Unigene，結(jié)果如表3所示.

表3 免疫相關(guān)GO注釋到的基因Tab.3 Genes annotated by immune-related GO term

由于通過GO分析確定的免疫基因數(shù)量過少，因此需要進(jìn)一步通過免疫關(guān)鍵詞檢索blastx比對結(jié)果來尋找免疫基因.本研究參考甲殼動物免疫系統(tǒng)的文獻(xiàn)和EST分析文獻(xiàn)[6-9]，確定了與免疫相關(guān)的關(guān)鍵詞72條，在blastx的比對結(jié)果中進(jìn)行搜索，共獲得680條免疫基因.這些基因涉及模式識別蛋白、酚氧化酶原激活系統(tǒng)、蛋白酶和蛋白酶抑制劑等無脊椎動物免疫系統(tǒng)的重要組分.綜合以上2種方法篩選的免疫基因，去除其中的重復(fù)結(jié)果，最終共獲得免疫基因Unigene 680條，其中中華絨螯蟹血細(xì)胞Ⅰ發(fā)現(xiàn)的免疫基因最多.不同組織和細(xì)胞中的免疫基因在各免疫系統(tǒng)組分中的分布如表4所示，其中無法確定免疫系統(tǒng)組分的歸入“其他”類.

表4 不同細(xì)胞和組織免疫相關(guān)基因的功能分布Tab.4 Function distribution of immune-related genes from different cells and tissues 條

3 討論與結(jié)論

本研究首先通過GO注釋的提示篩選免疫基因，但數(shù)量較少.繼而通過檢索免疫關(guān)鍵詞的方法篩選，獲得了大量免疫相關(guān)基因.從另一角度來看，雖然GO注釋方法獲得的免疫基因數(shù)量不多，但得到的一些信息是關(guān)鍵詞檢索無法取代的.例如，gb|FL571594.1|是中華絨螯蟹血細(xì)胞Ⅰ的Unigene，GO注釋表明該基因參與Toll信號通路過程，而檢索免疫關(guān)鍵詞的方法并未發(fā)現(xiàn)該基因；利用這2種方法都能預(yù)測中華絨螯蟹gb|GE340553.1|是免疫基因，關(guān)鍵詞檢索僅能提示該基因是凝結(jié)蛋白，而GO注釋“hemolymph coagulation”（GO：0042381）則提供了更多的關(guān)于該基因的功能信息.除gb|GE340553.1|外，使用2種方法都能檢索到的免疫基因還包括中國明對蝦的Contig527、gb|BM297142.1|以及中華絨螯蟹血細(xì)胞Ⅰ的gb|FL571592.1|，分別為β-葡聚糖識別蛋白和toll-like受體.由此可見，GO提示信息和關(guān)鍵詞檢索方法具有互補(bǔ)性，二者相結(jié)合尋找免疫基因?qū)τ谕晟泼庖呋蛐畔⒑土私饷庖呦到y(tǒng)組分很有必要.

在綜合GO提示信息和關(guān)鍵詞檢索得到的免疫基因中，一部分與已報(bào)道的中國明對蝦和中華絨螯蟹的免疫基因一致，這些免疫基因的功能注釋來自NCBI數(shù)據(jù)庫.例如，在中華絨螯蟹血細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)多種抗菌肽，包括crustin i、crustin iii、抗脂多糖因子、抗脂多糖因子2、抗脂多糖因子3和osmotin.另外，本文還通過預(yù)測獲得了一批在蝦、蟹中尚未報(bào)道的潛在免疫基因.其中，中國明對蝦頭胸部中有60個，約占總預(yù)測基因數(shù)量的40%，中華絨螯蟹中共有250個，在各組織和細(xì)胞中的分布如表5所示.中華絨螯蟹血細(xì)胞Ⅱ中，GeneBank號為FG984061.1的EST與胡椒屬（Piper colubrinum）的osmotin有79%的相似性.osmotin是一類植物抗病相關(guān)的蛋白，主要用來對抗真菌[11]，因此，中華絨螯蟹體內(nèi)的FG984061.1也可能有抗御真菌的作用.這些預(yù)測的基因與其他物種的免疫基因高度相似，因此也很可能參與了蝦、蟹體內(nèi)的免疫過程.

表5 免疫基因注釋結(jié)果在不同物種中的分布Tab.5 Distribution of immune-related genes in different organisms 個

本研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹血細(xì)胞的免疫基因數(shù)量比其他組織多，其中含有參與酚氧化酶原激活系統(tǒng)的多種因子，抗菌肽類的免疫基因種類也更豐富.中華絨螯蟹血細(xì)胞和中國明對蝦頭胸部的EST中都發(fā)現(xiàn)了多種蛋白酶和蛋白酶抑制劑，如表6所示.

表6 蛋白酶和蛋白酶抑制劑在不同組織和細(xì)胞中分布的情況Tab.6 Distribution of protease and protease inhibitor from different tissues and cells

研究表明，血細(xì)胞作為先天免疫系統(tǒng)的重要參與者包含多種蛋白酶和蛋白酶抑制劑[12]，蛋白酶及其抑制劑可以通過水解級聯(lián)反應(yīng)激活啟動Toll受體、類補(bǔ)體反應(yīng)、酚氧化酶原激活系統(tǒng)和凝集系統(tǒng)等免疫途徑，在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用.本研究發(fā)現(xiàn)蝦、蟹具有很多先天免疫系統(tǒng)的重要組分，這進(jìn)一步證實(shí)了甲殼動物可依靠先天免疫系統(tǒng)抗御病原侵染，其中，血細(xì)胞是多種免疫應(yīng)答的發(fā)起者，在抗病過程中發(fā)揮了重要作用.

肝胰腺是甲殼動物重要的內(nèi)分泌器官和消化器官，近年來已有一些研究提示肝胰腺可能參與免疫過程[13].Du等[14]研究螺原體MR-1008對肝胰腺中AKP、ACP、SOD、CAT等免疫基因的影響時，發(fā)現(xiàn)MR-1008能夠啟動或抑制這些基因的免疫應(yīng)答，并且認(rèn)為肝胰腺在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用.Jin等[15]在中華絨螯蟹中克隆出了2種C型凝集素，并且發(fā)現(xiàn)能夠在肝胰腺中表達(dá).此外，有報(bào)道指出蝦類肝胰腺中存在多種類型的凝集素，其表達(dá)量在細(xì)菌感染前后差異顯著[16-18].本研究在中國明對蝦的頭胸部、中華絨螯蟹的血細(xì)胞和肝胰腺中都發(fā)現(xiàn)了凝集素，其中中華絨螯蟹肝胰腺EST的凝集素種類最多，包括凝集素a、凝集素b、C型凝集素1、C型凝集素2、C型凝集素3等.這有助于全面認(rèn)識甲殼動物肝胰腺的功能以及正確評價其在免疫過程中的重要作用.

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