李 麗，李 羚，劉祿鈞，楊曉芳

（保山學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院云南保山 678000）

臭靈丹中總黃酮微波輔助提取工藝研究

李 麗，李 羚，劉祿鈞，楊曉芳

（保山學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院云南保山 678000）

以云南臭靈丹為材料，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合，對(duì)影響臭靈丹總黃酮類物質(zhì)提取率的因素進(jìn)行了研究，并得出最佳的提取工藝條件：料液比1∶60 g／mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、微波功率為350W、微波時(shí)間為60s，總黃酮平均得率為9.64%。

臭靈丹；黃酮；微波輔助；

臭靈丹為菊科六棱菊屬草本植物，是一味具有抗菌消炎、清熱解毒等功效的常用中草藥［1］。該植物鮮葉搗碎還可以作外敷藥，用于治療燙傷、芥瘡、毒蛇咬傷、跌打損傷、去毒拔膿及治療腮腺炎等疾病。而其提取物則具有較好的祛痰作用，對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性支氣管炎也有一定的療效，并對(duì)急性淋巴細(xì)胞型白血病、急性粒細(xì)胞型白血病及急性單核細(xì)胞型白血病患者的血細(xì)胞脫氫酶均具有較強(qiáng)的抑制作用。前人實(shí)驗(yàn)證實(shí)，臭靈丹中含有多種有效化學(xué)成分，其中黃酮類化合物是含量比較多的一類［2］。對(duì)于臭靈丹，前人研究其化學(xué)成分所做的工作較多，而對(duì)其提取工藝的研究卻甚少。本文通過微波輔助提取臭靈丹中黃酮，考察影響提取的主要因素，以得到微波輔助提取的最佳工藝條件，以期為開發(fā)利用臭靈丹資源提供有效途徑和理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥材、試劑及儀器

臭靈丹，采集于保山學(xué)院后山，預(yù)處理陰干后粉碎過80目（0.180 mm）篩，密封保存；蘆丁對(duì)照品（學(xué)校提供）；亞硝酸鈉，化學(xué)純（成都化學(xué)試劑廠）；無水乙醇、95%乙醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、石油醚（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）、氫氧化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、氯化鋁（天津市博迪化工有限公司）均為分析純；所用水為蒸餾水。

722光柵分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠制造）；2XZ－1型旋片式真空泵（南京真空泵廠）；微波爐（MW20－M605廣東歐派集團(tuán)有限公司）；電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；旋風(fēng)式粉碎磨（杭州麥哲儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 臭靈丹總黃酮樣品液的制備

準(zhǔn)確稱取臭靈丹原料0.2 g，按1∶10比例加石油醚脫脂脫色2次，每次2 h。用2XZ－1型旋轉(zhuǎn)式真空泵抽濾，自然條件下?lián)]干殘留的石油醚。然后加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇20 mL，放入微波爐中，在微波功率350W下，進(jìn)行間歇式微波加熱，每提取10 s暫停1次，冷卻后再加熱，共加熱提取60s。提取完后抽濾并用少量50%乙醇洗滌濾渣，取濾液，然后用50%的乙醇定容至50 mL容量瓶中，得臭靈丹總黃酮的樣品液，避光保存。

1.2.2 總黃酮含量的測(cè)定

1.2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱取充分干燥至恒重的蘆丁0.0572 g，置于100 mL容量瓶中，用50%乙醇溶解并定容到刻度，得到質(zhì)量濃度為0.0572 g／L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL于25 mL容量瓶中，加50%乙醇至12 mL，加入0.7 mL 5% NaNO2溶液，搖勻；放置5 min后，加入0.7 mL10%AlCl3溶液搖勻，放置6 min后，再加入5 mL 4%NaOH溶液，搖勻；用50%乙醇稀釋至刻度，10 min后，于400～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在505 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。因此，本試驗(yàn)采用505 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL分別置于25 mL量瓶中。加入0.7 mL 5%NaNO2溶液，搖勻，放置5 min；加入0.7 mL 10%AlCl3溶液，搖勻，放置6 min；再加入5 mL 4%NaOH溶液，搖勻，用50%的乙醇稀釋至刻度，放置10 min。以相應(yīng)試劑為空白，用722型光柵分光光度計(jì)在505 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度；以吸光度A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A＝8.9506C＋0.02036，相關(guān)系數(shù)R＝0.999 4。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 The standard curve of rutin

1.2.2.4 總黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取1.00 mL樣品溶液至于25 mL容量瓶中，按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定吸光度，對(duì)照回歸方程得到總黃酮濃度，然后計(jì)算出臭靈丹總黃酮含量。

黃酮得率＝（提取液中黃酮含量／樣品質(zhì)量）×100%

1.3 試驗(yàn)條件優(yōu)化

1.3.1 單因素試驗(yàn)

選擇對(duì)臭靈丹總黃酮提取率有影響的4個(gè)因素，即乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、微波功率（C）和提取時(shí)間（D）進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。①乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、微波功率（350 W）、提取時(shí)間60 s，選擇料液比（g／mL）分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70進(jìn)行試驗(yàn)為；②料液比1∶60 g／mL、微波功率350 W、提取時(shí)間60 s，分別選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%）進(jìn)行試驗(yàn)；③乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶60 g／mL、提取時(shí)間60 s，選擇5種不同的微波功率（70、210、350、490 W）進(jìn)行試驗(yàn)；④乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶60 g／mL、微波功率350W，選擇5種提取時(shí)間（40、60、80、100s）進(jìn)行試驗(yàn)。在上述條件下按1.2進(jìn)行臭靈丹總黃酮的提取，并計(jì)算總黃酮提取率。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步綜合考察各因素的相互影響及得到最佳的提取工藝條件，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇上述4個(gè)單因素的較優(yōu)水平，按L9（34）設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及討論

2.1.1 料液比對(duì)總黃酮得率的影響

料液比對(duì)總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Figure 2 The effect of solid／liquid ratio on extraction rate of total flavones

隨著料液比的增大，總黃酮的提取率也隨著增高，當(dāng)料液比增至1∶60 g／mL時(shí)達(dá)最高峰；當(dāng)料液超過1∶60 g／mL時(shí)，得率迅速下降。原因可能是：開始時(shí)，乙醇的體積較少，樣品可能沒有得到充分溶解，或者乙醇的量太少不能將提取出來的黃酮溶于其中以致萃取出來，所以當(dāng)料液比增大時(shí)，黃酮提取率逐漸增大；在料液比達(dá)到一定比例時(shí)，由于體系增大，在相同條件作用下體系的溫度不夠高，細(xì)胞破裂沒有完全，從而導(dǎo)致黃酮可能無法充分提取出來，所以總黃酮的提取率反而會(huì)降下來。因此，提取的料液比定為1∶60 g／mL時(shí)最佳。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響Figure 3 The effect of ethanol volume fraction on extraction rate of total flavones

總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而緩慢增大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，提取率最高，之后迅速降低。原因可能如下：在一定的乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，由于黃酮的溶解度也隨著增大，所以提取率也隨之升高；但是，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到一定程度后，物料中水的比例較大幅度減少，而微波加熱主要是極性分子尤其是水分子吸收微波能，產(chǎn)生大量熱量使物料升溫，因此乙醇體積分?jǐn)?shù)越大物料升溫反而減慢，提取率也降低［3］。此外，高體積分?jǐn)?shù)的乙醇可能會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固，黃酮不易溶出［4］。而且，高體積分?jǐn)?shù)的乙醇很容易揮發(fā)，提取出來的黃酮可能隨之?dāng)y帶而出粘附與器壁之上，從而影響了提取液中的黃酮溶解量。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)定為70%時(shí)最佳。

2.1.3 微波功率對(duì)總黃酮得率的影響

微波功率對(duì)總黃酮提取率的影響見圖4。隨著微波功率的不斷增大，黃酮的提取率迅速升高之后又緩慢下降，雖有所波動(dòng)，但功率為350W時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大值。出現(xiàn)該現(xiàn)狀的原因可能如下：一開始，微波功率增大時(shí)，在固定的作用時(shí)間內(nèi)，體系升高的溫度越大，細(xì)胞破碎的程度也越高，黃酮的提取率也隨之提高；當(dāng)微波功率達(dá)到350W后，黃酮基本以溶出，提取率值最大。原因可能是：當(dāng)功率繼續(xù)增大時(shí)，溫度升高過快使得乙醇迅速揮發(fā)，黃酮得不到充分溶解析出；另外溫度過高還可能使溶出的黃酮被分解掉［5］。因此，微波提取的功率定位350W時(shí)最佳。

圖4 微波功率對(duì)總黃酮得率的影響Figure 4 The effect of microwave power on extraction rate of total flavones

2.1.4 微波時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

微波時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響見圖5。

圖5 微波加熱時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Figure 5 The effect of microwave irradiation time on extraction rate of total flavones

隨著微波時(shí)間的增多，黃酮提取率迅速上升，當(dāng)微波時(shí)間達(dá)到60 s時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大值，之后提取率緩慢下降。原因可能如下：在一定范圍內(nèi)，隨著微波時(shí)間的增加，體系溫度逐漸升高，黃酮溶解度增大，黃酮提取率增大；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，溫度持續(xù)上升。一方面，溫度太高導(dǎo)致其他雜質(zhì)溶出增多，浸提液黏度增大，對(duì)黃酮類化合物產(chǎn)生了吸附作用。另一方面，體系溫度過高時(shí)也可能使一部分黃酮分解或氧化，以致影響黃酮的提取率。因此，提取的微波時(shí)間定為60 s時(shí)最佳。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2看出，對(duì)臭靈丹總黃酮提取率的影響大小依次為：料液比（A）＞微波功率（C）＞提取時(shí)間（D）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）。微波輔助提取的優(yōu)化工藝條件是A2B3C2D1，即料液比為；1∶60、微波功率為350W、微波時(shí)間為60 s、乙醇體積為60%。按此工藝條件下進(jìn)行了3次驗(yàn)證試驗(yàn)，總黃酮提取率分別為9.56%，9.75%和9.62%，平均9.64%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

3 結(jié)論

1）臭靈丹總黃酮的微波提取工藝，受固液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、提取時(shí)間和間隔時(shí)間的影響，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出了最佳提取工藝條件：料液比為1∶60 g／mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、微波功率為350W、微波提取時(shí)間為60s。在最佳條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，黃酮提取率為9.56%。

2）微波輔助法與超聲波輔助法相比，具有方便、省時(shí)、節(jié)能、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，是一種高效優(yōu)質(zhì)的植物總黃酮提取技術(shù)。

［1］ 云南藥材編委會(huì).云南中藥資源名錄［M］.北京：科學(xué)出版社，1993，576.

［2］ 趙愛華.臭靈丹化學(xué)成分研究［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，1994 （5）：517－520.

［3］ 付為琳，楊立剛，孫桂菊.微波萃取在菊花黃酮提取工藝中的應(yīng)用研究［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29 （1）1－3.

［4］ 陳偉，劉青梅.微波技術(shù)在杜仲黃酮提取工藝中的應(yīng)用研究［J］.食品化學(xué)，2006，27（10）：285－286.

［5］ 劉俊，黃少偉，張?jiān)椒牵?微波輔助提取土茯苓總黃酮［J］.中藥材，2007，30（12）：1591－1595.

Study on Extraction of Total Flavonoids from Laggera Pterodonta by Microwave－assist Route

LI Li，LI Ling，LIU Lu－Jun，YANG Xiao－fang

（Department of Resource and Environment，Bao Shan College，Bao Shan 678000，China）

Yunnan laggera pterodonta was taken as material，by using single factor and orthogonal experiments，the factors affecting the extraction rate of total flavonoids from laggera pterodonta were studied，and the optimum extraction conditions were as follows：solid－liquid ratio 1∶60 g／mL，ethanol volume fraction 60%，microwave power 350W，microwave time 60s，average total flavonoids yield 9.64%.

Microwave－assist；total flavonoids；Laggera pterodonta

Q946

A

1004-275X（2014）06-0019-04

12.3969／j.issn.1004-275X.2014.06.005

收稿：2014-09-15

保山學(xué)院科研教研基金重點(diǎn)項(xiàng)目（13BZ012）。

李麗（1982-），女，云南昌寧人，碩士，講師，研究方向?yàn)榇呋瘜W(xué)。