劉 穎，魏希穎

陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，西安 710119

內(nèi)生菌對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化是內(nèi)生菌利用其胞內(nèi)或胞外的一些酶或特定化學(xué)物質(zhì)將植物體產(chǎn)生的一種物質(zhì)轉(zhuǎn)化為另一種物質(zhì)的過(guò)程［1］。此轉(zhuǎn)化可用于獲得新的活性成分和提高植物次生代謝產(chǎn)物的含量［2］。由于野生藥用植物資源短缺，有些產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物不利于人體吸收或毒副作用大等，因此提高藥用植物次生代謝產(chǎn)物的含量，開(kāi)發(fā)新的藥用活性成分至關(guān)重要。目前用于提高植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物含量的方法有多種，例如篩選高產(chǎn)細(xì)胞系、使用生物或非生物誘導(dǎo)子、植物組織培養(yǎng)等［3］?？紤]到植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、受環(huán)影響大，而內(nèi)生菌用于促進(jìn)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的積累以及產(chǎn)生新的活性成分具有繁殖快、生物量大、可塑性強(qiáng)，且轉(zhuǎn)化反應(yīng)專一有效、條件溫和，操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)物收效率高等特點(diǎn)，成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本文主要從內(nèi)生菌對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化以獲得新的活性成分和提高植物次生代謝產(chǎn)物的含量?jī)煞矫孢M(jìn)行綜述。

1 獲得新的活性成分

內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化體系可以利用內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物和植物中的某些物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生新的化合物或利用植物體內(nèi)的有效成分為前體物質(zhì)，經(jīng)內(nèi)生菌代謝產(chǎn)生新的活性成分［4］。通過(guò)內(nèi)生菌對(duì)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，可以產(chǎn)生一些新的化合物，這為新藥研發(fā)提供了新思路。

彭清忠等［5］從姜黃根莖中篩選到一株能轉(zhuǎn)化姜黃素的內(nèi)生真菌。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為去甲基姜黃素和二去甲基姜黃素。去甲基姜黃素的抗氧化、抗炎癥的活性比姜黃素高。Denise Z.L.Bastos 等［6］利用內(nèi)生菌炭疽菌對(duì)白樺脂酸氧化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了樺木酮酸，而這種氧化反應(yīng)與白樺脂酸和樺木酮酸在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的代謝途徑相似，這為研究藥物代謝途徑提供了新思路。付少彬等［7］從藥用植物蛇足石杉的莖和葉中篩選出了能轉(zhuǎn)化烏蘇酸的4 株內(nèi)生菌，豐富了烏蘇酸的構(gòu)型。任娜［8］采用超高效液相色譜和GCMS 技術(shù)，研究了紅豆杉內(nèi)生真菌對(duì)艾葉油的生物轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生了新的萜類物質(zhì)。Keyller Bastos Borges等［9］發(fā)現(xiàn)了Phomopsis sp.，Glomerella cingulata，Diaporthe phaseolorum，Aspergillus fumigatus(VR12)四種內(nèi)生真菌對(duì)硫醚嗪進(jìn)行立體選擇性轉(zhuǎn)化的效果顯著。

2 內(nèi)生菌提高植物次生代謝產(chǎn)物的含量

內(nèi)生菌不僅可以自身合成代謝產(chǎn)物，而且可以誘導(dǎo)宿主植物次生代謝產(chǎn)物的合成，提高植物次生代謝產(chǎn)物的含量。內(nèi)生菌可以利用植物體內(nèi)活性成分的結(jié)構(gòu)類似物為前體，將其轉(zhuǎn)化為已有的活性成分［2］。

2.1 影響植物次生代謝產(chǎn)物含量的因素

2.1.1 內(nèi)生菌組分對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的影響

內(nèi)生菌常被分為菌液濃縮物或提取物、菌絲提取物、菌絲細(xì)胞壁降解成分、肽類、蛋白質(zhì)和糖類等不同組分［10］。內(nèi)生菌的不同組分含有的誘導(dǎo)成分及含量不同，對(duì)宿主的誘導(dǎo)作用亦會(huì)有差別。張瑞芬等［11］用內(nèi)生菌尖孢鐮刀菌Dzf17 的滅活菌絲誘導(dǎo)盾葉薯蕷無(wú)菌苗和培養(yǎng)細(xì)胞，皂苷元產(chǎn)量比對(duì)照組提高了2.865 倍和2.013 倍。用菌液濃縮物誘導(dǎo)盾葉薯蕷無(wú)菌苗和培養(yǎng)細(xì)胞后皂苷元產(chǎn)量比對(duì)照組提高了1.522 倍和1.757 倍。Peiqin Li 等［12］從內(nèi)生菌絲多糖中提取的寡糖DP4，DP7 和DP10 對(duì)盾葉薯蕷細(xì)胞中薯蕷皂苷元含量影響各不相同。Vinod Kumar 等［13］比較了印度梨形孢的兩種狀態(tài)的菌液提取物對(duì)亞麻植物的PT、6-MPT 含量影響。發(fā)現(xiàn)將3%的兩種菌液提取物分別添加到植物毛狀根懸浮細(xì)胞中培養(yǎng)48 h 后，添加過(guò)濾滅菌的菌液提取物使足葉草毒素、6-甲氧基足葉草毒素含量達(dá)到233.8、131.9 mg/L，分別比原來(lái)提高了3.8 倍和4.4 倍。而添加高壓滅菌的菌液提取物，足葉草毒素、6-甲氧基足葉草毒素的含量達(dá)到149.3、77.5 mg/L。Kiran D.Pawar 等［14］將兩種內(nèi)生真菌黑孢霉和莖點(diǎn)霉菌的菌液提取物和菌絲粉末與來(lái)自植物葉和莖的愈傷組織共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)對(duì)4 種代謝物含量影響不同。王劍文等［15］用不同的方法提取內(nèi)生真菌細(xì)胞壁物質(zhì)，結(jié)果4 種制備方法所得到的誘導(dǎo)子誘導(dǎo)黃花蒿發(fā)根中青蒿素積累的作用不同，其中利用脫脂脫蛋白酸解法提取的誘導(dǎo)子可以最大程度地促進(jìn)青蒿素的合成。

2.1.2 內(nèi)生菌的添加量對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的影響

內(nèi)生菌誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)效果因其添加量不同而表現(xiàn)出一定的差異。真菌誘導(dǎo)子的濃度與產(chǎn)物積累有反應(yīng)飽和型和最適濃度型，在藥用植物細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)中主要是最適濃度型［16］。次生代謝產(chǎn)物的積累隨著內(nèi)生菌誘導(dǎo)子濃度的增加而增加或?qū)φT導(dǎo)子有最適濃度要求。

Archana Prasad 等［17］研究了不同濃度(0.5%、1.0%、1.5%)的尖孢鐮刀菌的菌絲提取物與30 天的植物腋芽組織培養(yǎng)體系共培養(yǎng)后，0.5%的誘導(dǎo)子使積雪草苷的積累量(0.94 mg/g)比對(duì)照組(0.44 mg/g)增加了2 倍多，1，0%和1.5%的誘導(dǎo)子使體系中積雪草苷的含量?jī)H達(dá)到0.33mg/g 和0.18 mg/g。王劍文等［15］研究了不同濃度內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子加入培養(yǎng)20 d 的黃花蒿發(fā)根中，當(dāng)誘導(dǎo)子濃度為0.4 mg/mL 時(shí)，青蒿素含量達(dá)到最高(9.26 mg/L)。Tao JH 等［18］研究了不同濃度的內(nèi)生真菌Rhizoctonia SP1.誘導(dǎo)子與茅蒼術(shù)懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)9 d 后，對(duì)蒼木素含量影響。當(dāng)加入40 mg/L 的誘導(dǎo)子時(shí)，蒼木素的含量達(dá)到最大(28.06 μg/L)，比對(duì)照組提高了48.3%。Gangping Hao 等［19］發(fā)現(xiàn)不同濃度的內(nèi)生真菌Sphaeropsis sp B301 誘導(dǎo)子(25、50、75、100 μg glc eguiv/mL)和8 d 的銀杏細(xì)胞懸浮液共培養(yǎng)4天，當(dāng)添加了75 μg glc eguiv/mL 的誘導(dǎo)子時(shí)黃酮類的含量最高，比對(duì)照組提高了1.8 倍。

2.1.3 內(nèi)生菌與植物共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物積累的影響

內(nèi)生菌與植物共培養(yǎng)時(shí)間不同，植物次生代謝產(chǎn)物的積累表現(xiàn)出一定的差異。

Yu Wang 等［20］研究了內(nèi)生真菌AL12 菌絲誘導(dǎo)子對(duì)藥用植物蒼術(shù)中蒼術(shù)酮含量的影響。誘導(dǎo)子與蒼術(shù)共培養(yǎng)50 d，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蒼術(shù)酮的積累量逐漸增多，第50 d 達(dá)到26.28 μg/g，比對(duì)照組增加了4 倍多。Marco Mucciarelli 等［21］把內(nèi)生真菌PGP-HSF 與薄荷葉和根共培養(yǎng)，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的不同，揮發(fā)性物質(zhì)含量有明顯變化。在內(nèi)生菌-薄荷根共培養(yǎng)28 d 時(shí)，乙酸甲酯的含量比14、21、35 d的高。石岳香等［22］研究了隨著內(nèi)生真菌與植物懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，懸浮細(xì)胞內(nèi)生物堿的含量不斷的變化，在前十天比較低，但培養(yǎng)到第四十天，生物堿含量達(dá)到最大。Li YC 等［23］研究發(fā)現(xiàn)Taxus chinensis var.Mairei 細(xì)胞培養(yǎng)液和內(nèi)生菌Fusarium mairei 共培養(yǎng)10 d 時(shí)紫杉醇的含量比共培養(yǎng)5 d 和15 d 的高。

2.1.4 內(nèi)生菌對(duì)植物不同組織、器官中次生代謝產(chǎn)物的影響

內(nèi)生菌對(duì)植物不同組織、器官中次生代謝產(chǎn)物含量影響不同。內(nèi)生菌作用于植物的不同組織、器官，會(huì)引起合成相應(yīng)次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵基因表達(dá)強(qiáng)度和速度不同。

Jisha Satheesan 等［24］將內(nèi)生真菌印度梨形孢和藥用植物積雪草共培養(yǎng)，檢測(cè)積雪草苷含量在葉片和整個(gè)植株中都有所增加，比對(duì)照組增加了2 倍，而在根中沒(méi)有明顯增加。通過(guò)Real-time PCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)合成積雪草苷的關(guān)鍵基因SQS 在植物體內(nèi)高水平表達(dá)，而B(niǎo)AS 基因在根部低水平表達(dá)。Kiran D·Pawar 等［14］把培養(yǎng)相同時(shí)間植物葉和莖的愈傷組織分別與40 mg 的內(nèi)生菌莖點(diǎn)霉菌的菌絲粉末共培養(yǎng)，次生代謝產(chǎn)物紅厚殼素A 的含量在葉的愈傷組織中比對(duì)照組提高了751 倍，而在莖的愈傷組織中比對(duì)照組提高僅364 倍。

2.1.5 內(nèi)生菌對(duì)植物不同生長(zhǎng)階段的次生代謝產(chǎn)物的影響

植物生長(zhǎng)到一定階段后，內(nèi)生菌才可能引起相應(yīng)代謝物的積累。只有處于生長(zhǎng)期的植物細(xì)胞才能接受誘導(dǎo)子信號(hào)，此時(shí)誘導(dǎo)子表現(xiàn)出最強(qiáng)的誘導(dǎo)活性［16］。

Anita K·Brock 等［25］將內(nèi)生菌(Enterobacter radicincitans DSM 16656)與培養(yǎng)了7 周和10 周的擬南芥葉片組織共培養(yǎng)一定時(shí)間。脂肪族芥子油苷在7 周的葉片組織中的含量比對(duì)照組中的含量低，而在第10 周的葉片組織中，脂肪族芥子油苷的含量又比對(duì)照組高。

2.2 內(nèi)生菌對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物含量產(chǎn)生影響的機(jī)理

內(nèi)生菌會(huì)對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物含量產(chǎn)生影響可能有以下原因:一是內(nèi)生菌在宿主細(xì)胞中影響宿主光合作用有關(guān)物質(zhì)的積累，這些物質(zhì)會(huì)增加植物營(yíng)養(yǎng)的攝入，有助于植物次生代謝產(chǎn)物的合成。二是內(nèi)生菌通過(guò)自身的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)植物細(xì)胞合成次生代謝產(chǎn)物相關(guān)的基因，改變這些基因的表達(dá)速度和強(qiáng)度，誘導(dǎo)植物體內(nèi)相應(yīng)的次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累［26，27］。Gao FK 等［28］研究了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物積累的影響。當(dāng)一種內(nèi)生菌誘導(dǎo)子加入植物懸浮細(xì)胞中，內(nèi)生菌誘導(dǎo)子能促進(jìn)一些信號(hào)分子(NO、水楊酸、活性氧)的合成，植物的一些次生代謝產(chǎn)物的含量隨著增加。由此推斷這些信號(hào)分子會(huì)促進(jìn)這些次生代謝物的積累。三是內(nèi)生菌與宿主之間存在化合物或遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。Marco Mucciarelli 等［21］比較了從內(nèi)生菌(PGP-HSF)-薄荷根共培養(yǎng)(1)、沒(méi)有感染PGP-HSF 的薄荷(2)、從PGPHSF-薄荷根共培養(yǎng)中分離的PGP-HSF(3)三種體系中胡薄荷酮的含量，發(fā)現(xiàn)胡薄荷酮同時(shí)為(1)與(3)中的主要成分，而在(2)中不含胡薄荷酮。可推斷胡薄荷酮可能是通過(guò)根部轉(zhuǎn)移到PGP-HSF 中。四是內(nèi)生菌可以合成宿主所不能合成或合成量低的化合物，以此改變宿主代謝產(chǎn)物合成的途徑，進(jìn)而影響代謝產(chǎn)物的含量［29］。

內(nèi)生菌通過(guò)對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為人類提供了豐富的藥用資源。這些次生代謝產(chǎn)物的合成同時(shí)有助于激活植物的防御代謝途徑，對(duì)植物起保護(hù)作用。內(nèi)生菌對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物影響的各種因素相互聯(lián)系、相互影響，某一因素發(fā)生變化，都可能引起次生產(chǎn)物含量的增加或減少。

3 存在問(wèn)題

近年來(lái)，關(guān)于內(nèi)生菌對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化成為研究的熱點(diǎn)，但此方面研究的廣度、深度均不夠。(1)關(guān)于內(nèi)生菌對(duì)植物的轉(zhuǎn)化是內(nèi)生菌利用植物體內(nèi)的前體物質(zhì)，經(jīng)過(guò)代謝產(chǎn)生新型化合物或提高已有活性成分含量，還是內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物與植物中的一些物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成新的化合物或提高已有活性成分含量的機(jī)理研究尚淺;(2)目前研究報(bào)道很少涉及內(nèi)生菌與植物相互作用時(shí)，與次生代謝產(chǎn)物合成和轉(zhuǎn)化的相關(guān)基因表達(dá)的研究;(3)大多數(shù)研究?jī)H針對(duì)一種內(nèi)生菌作用于一種植物，很少涉及多種內(nèi)生菌同時(shí)作用于一種植物，對(duì)多種菌的協(xié)同作用重視不夠。

4 展望

目前，內(nèi)生菌對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化的研究還處于初級(jí)階段。今后可以在以下方面進(jìn)行深入的研究:(1)轉(zhuǎn)化機(jī)理的研究:從細(xì)胞水平上，研究信號(hào)分子對(duì)內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響;通過(guò)分析合成目標(biāo)代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵基因，從分子水平分析關(guān)鍵基因的表達(dá)強(qiáng)度，利用基因重組對(duì)次生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(2)多種內(nèi)生菌協(xié)同作用的研究，達(dá)到藥用植物次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量最大化。(3)內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化過(guò)程的優(yōu)化和放大目前內(nèi)生菌對(duì)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化還處于實(shí)驗(yàn)室階段，反應(yīng)過(guò)程的優(yōu)化和放大，使生產(chǎn)具有可行性和高效性，為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

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