邵元臣，劉華淼，張然然，邢秀梅※

(1．江蘇科技大學(xué)，江蘇 鎮(zhèn)江 212000； 2．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112)

1857年，瑞士生理學(xué)家Rudolf Albert在動物肌肉細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了線粒體；1962年，Nass發(fā)現(xiàn)，線粒體能夠進(jìn)行自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)以及調(diào)控。線粒體DNA記錄了生物由單細(xì)胞到多細(xì)胞、由低等生物到高等生物進(jìn)化過程的歷史信息。線粒體DNA屬于小分子，全序列比較容易獲得。因此，可以通過對線粒體DNA序列的比較分析來研究物種的起源與進(jìn)化[1]。

1 鹿科動物線粒體DNA結(jié)構(gòu)特點

鹿科動物線粒體DNA屬環(huán)狀共價閉合雙鏈DNA，相對分子量較小，長度一般在14.8Kb～18.1Kb之間，大部分在16.3Kb左右，核酸序列相對保守，是單拷貝的母系遺傳大分子。線粒體DNA序列分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)，其中，編碼區(qū)包括37個編碼基因(13個蛋白質(zhì)編碼基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因)，非編碼區(qū)是D-loop區(qū)[2]。動物線粒體DNA是由1條重鏈(H)和1條輕鏈(L)2條鏈構(gòu)成，其中輕鏈上有8個tRNA編碼基因和ND6基因，其余大部分編碼基因均在H鏈上[3]。

2 鹿科動物線粒體DNA基因組成成分

鹿科動物線粒體包含13個蛋白質(zhì)編碼基因，分別是3個細(xì)胞色素氧化酶亞基基因(COⅠ、COⅡ、COⅢ)、7個氧化還原酶亞基基因(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6)、2個三磷酸腺苷酶亞基基因(ATP6、ATP8)和1個細(xì)胞色素CYTB基因。13個蛋白編碼基因均為線粒體內(nèi)膜呼吸鏈組成成分。通過不同動物間線粒體DNA全序列比對分析，COⅡ、COⅢ基因最保守，且同源性高，而ATP6、ATP8和ND基因之間變異相對較大。其中，ATP6/ATP8、ATP6/ COⅢ、ND4L/ND4、ND5/ND6基因之間緊密相連，有的彼此重疊，并且大多數(shù)動物mtDNA的蛋白質(zhì)編碼基因都由tRNA基因間隔。線粒體DNA具有自身特定的密碼子系統(tǒng)，與核基因組不同。線粒體DNA中密碼子UGA不用來作為終止信號，而是色氨酸密碼子；AGA、AGG是線粒體中的終止密碼子，而不是精氨酸密碼子。

2.1 線粒體tRNA基因

鹿科動物線粒體DNA中共包括22個tRNA基因，其中tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser、tRNA-Glu、tRNA-Pro均位于輕鏈(L)上，其余的tRNA由重鏈(H)編碼。線粒體中tRNA基因的二級結(jié)構(gòu)都以堿基互補(bǔ)配對折疊而形成的三葉草形式存在，包括5bp～7bp核酸形成的氨基酸臂、3bp～4bp核酸形成的雙氫尿嘧啶(DHU)臂、3bp～5bp核酸形成的TΨU臂和4bp～5bp核酸形成的反密碼子臂以及大小可變的一個額外環(huán)。

2.2 線粒體rRNA基因

線粒體DNA中包括2個rRNA基因，分別是12SrRNA和16SrRNA。12SrRNA是線粒體DNA中的小亞基單位，在重鏈(H)上，位于tRNA-Phe和tRNA-Val基因之間；16SrRNA是線粒體DNA中的大亞基單位，同樣位于重鏈(H)上，并以tRNA-Val間隔。12SrRNA與16SrRNA以單拷貝的形式存在，無間隔區(qū)，且核DNA中無拷貝。根據(jù)線粒體DNA中的rRNA的序列和結(jié)構(gòu)特點，12SrRNA與16SrRNA基因的進(jìn)化速率與線粒體DNA基因組的平均進(jìn)化速率相同，被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育研究。另外，12SrRNA和16SrRNA 2級結(jié)構(gòu)包括4個結(jié)構(gòu)域，其中1結(jié)構(gòu)域、2結(jié)構(gòu)域比3結(jié)構(gòu)域、4結(jié)構(gòu)域保守。核糖體RNA基因保守的2級結(jié)構(gòu)保證了與mRNA和tRNA一起完成蛋白質(zhì)的合成，保證生命活動的正常運行[4，5]。

2.3 線粒體DNA中包含兩個非編碼區(qū)

線粒體DNA中包含2個非編碼區(qū)即WANCY區(qū)和控制區(qū)(displacement-loop region)。WANCY是一段位于L鏈上的復(fù)制起始區(qū)，起始長度約為30bp～50bp，在tRNA-Asn和tRNA-Cys之間，并且該段可折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。WANCY區(qū)是一段極為保守的區(qū)域；控制區(qū)即D-loop區(qū)是位于D-環(huán)區(qū)的tRNA-Pro和tRNA-Phe基因之間，長度大約在1000bp左右，是線粒體DNA中長度和序列變化最大的區(qū)域，同時D-loop也包含保守區(qū)域。

3 鹿科動物線粒體DNA遺傳特點

3.1 線粒體DNA遵循嚴(yán)格的母系遺傳方式

相同母系祖先的子代都具有相同的線粒體DNA類型，實際研究中雖不能完全不受外來公畜雜交改良影響，但這種概率較低，在線粒體DNA遺傳過程中基因重組現(xiàn)象也較少，因此，采集少量樣本就能夠?qū)θ后w遺傳結(jié)構(gòu)和特征進(jìn)行全面分析[6]。

3.2 線粒體DNA與核DNA相比進(jìn)化速率快

線粒體DNA為環(huán)狀DNA分子，直接裸露無核蛋白保護(hù)，導(dǎo)致發(fā)生自然突變的幾率較高。負(fù)責(zé)線粒體DNA復(fù)制的γ酶無校對和修復(fù)能力，不能對堿基錯配及時糾正。線粒體DNA代與代之間擴(kuò)增時間相對較短，使得積累堿基突變的機(jī)會增多，特別是在D-loop區(qū)，由于是非編碼區(qū)，選擇壓力相對較小，容易積累突變，其堿基替換率比線粒體DNA其他區(qū)域要高約5倍～10倍。

3.3 線粒體DNA的異質(zhì)性

線粒體DNA的異質(zhì)性是指同一個體線粒體DNA分子的多態(tài)性。異質(zhì)性分為長度異質(zhì)和位點異質(zhì)2種。DNA長度異質(zhì)性主要有同聚物核苷酸數(shù)目差異、串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)差異和分子結(jié)構(gòu)中部分重復(fù)或缺失區(qū)域差異3種類型。近年來，有關(guān)哺乳動物D-loop區(qū)異質(zhì)性的研究發(fā)現(xiàn)，D-loop控制區(qū)存在數(shù)目和大小各異的串聯(lián)重復(fù)序列。

4 鹿科動物線粒體DNA與鹿科動物分子系統(tǒng)進(jìn)化研究概況

隨著線粒體DNA研究的不斷深入，根據(jù)線粒體DNA母系遺傳、進(jìn)化速度快和無組織特異性等特點[7]。鹿科動物系統(tǒng)進(jìn)化研究大都集中于D-loop區(qū)、CYTB基因、12SRNA和16SRNA基因。

4.1 D-LOOP區(qū)

2001年，Randi E等[8]通過對線粒體DNA控制區(qū)分析推斷了25種鹿亞科動物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，認(rèn)為與當(dāng)前部分種群分類不一致，其中，將梅花鹿分為日本梅花鹿、大陸梅花鹿以及臺灣梅花鹿，麋鹿與鹿屬動物相近，應(yīng)合并入鹿屬，扁角鹿與波斯黃占鹿屬于不同鹿種。并提出將梅花鹿亞種控制區(qū)中的重復(fù)結(jié)構(gòu)拷貝數(shù)作為亞種判斷標(biāo)記。

2006年，吳華等[9]為了探討我國圈養(yǎng)梅花鹿種群是否可以作為東北梅花鹿野外放歸資源，測定了9個圈養(yǎng)品種的45只梅花鹿線粒體DNA控制區(qū)的部分序列，分析了我國圈養(yǎng)梅花鹿遺傳結(jié)構(gòu)和種群遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，圈養(yǎng)梅花鹿種群遺傳多樣性豐富，種群之間無顯著遺傳分化。由此，東北地區(qū)圈養(yǎng)梅花鹿可作為野外放歸項目資源群。

2009年于浩等通過測定線粒體DNA控制區(qū)分析伊河馬鹿的起源與分子進(jìn)化研究發(fā)現(xiàn)，馬鹿種群間的超異分化程度不高，分化時間相對較近。從構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹來看，越南梅花鹿是最為古老的亞洲品種，而后是臺灣梅花鹿、東北梅花鹿。日本梅花鹿是由東北梅花鹿演變而來，日本梅花鹿與馬鹿親緣關(guān)系較近；中國甘肅馬鹿與阿拉善馬鹿是最古老的馬鹿品種，伊河馬鹿是亞洲類群向歐洲類群過渡的亞種，近而進(jìn)化到美洲馬鹿類群，從而實現(xiàn)馬鹿由中東向美洲演變的過程。

梅花鹿的分化適應(yīng)了南亞氣候，馬鹿在亞洲出現(xiàn)，并經(jīng)歷地理遷徙，最終形成美洲和亞洲類群，因此，伊河馬鹿可能是亞洲類群向歐洲、美洲過渡形成的。

2012年，涂劍鋒等[10]測定了13種鹿亞科動物線粒體DNA的D-loop區(qū)全序列，并結(jié)合GenBanK數(shù)據(jù)庫中12種鹿科動物同源序列分析來研究鹿科動物的分類和系統(tǒng)進(jìn)化。25種鹿科動物線粒體D-loop區(qū)全長為914bp～1072bp，個體差異在0.1%～12.2%之間，4個種屬差異在8.0%～12.2%之間。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析得到，馬鹿分化的2個不同種群、麋鹿屬的麋鹿、斑鹿屬的豚鹿和黃占鹿屬的黃占鹿與鹿屬分化處于屬間差異，并認(rèn)為應(yīng)將其并入鹿屬，其中，坡鹿是鹿屬中的最原始種。

2013年，李秋燕等[11]對新疆塔河馬鹿、阿爾泰馬鹿、伊河馬鹿、阿拉善馬鹿、甘肅馬鹿5個群體共108個個體的D-loop進(jìn)行序列擴(kuò)增，檢測出40個單倍型，并構(gòu)建了NJ和MP分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，塔河馬鹿與其他馬鹿遺傳距離較遠(yuǎn)，分屬于不同的類群；阿爾泰馬鹿、伊河馬鹿及甘肅馬鹿之間都存在基因交流情況，可能是由于群體間引種雜交所致。并得出新疆馬鹿遺傳多樣性豐富、新疆塔河馬鹿可能起源于歐洲、其他馬鹿起源于亞洲、部分群體間存在基因交流情況的結(jié)論。

4.2 CYTB基因

2008年，張麗[12]根據(jù)鹿科動物線粒體DNA cytb基因，探討白唇鹿、甘肅馬鹿、青海馬鹿、伊河馬鹿、東北馬鹿和塔河馬鹿的遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，塔河馬鹿與甘肅馬鹿、青海馬鹿親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；塔河馬鹿與東北馬鹿、伊河馬鹿親緣關(guān)系較近；伊河馬鹿與甘肅馬鹿、青海馬鹿親緣關(guān)系較近，與東北馬鹿親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；甘肅馬鹿和青海馬鹿為相同DNA類型；白唇鹿、塔河馬鹿與伊河馬鹿的遺傳多樣性豐富，而甘肅馬鹿、青海馬鹿、東北馬鹿遺傳多樣性相對較貧乏。

2008年，Jose Mauricio等[13]通過線粒體CYTB基因研究美國南部鹿科動物系統(tǒng)分類關(guān)系和進(jìn)化史發(fā)現(xiàn)，美國南部鹿科動物起源于上新世，并至少分為8個類群，但隨著地理環(huán)境的變化和遷徙，逐漸進(jìn)化并形成目前形態(tài)學(xué)上的分類。

2008年，王洪亮等[14]測定了塔河馬鹿、阿爾泰馬鹿、伊河馬鹿3個亞種共38個個體CYTB基因的1140bp的序列，分析了核酸序列差異，并通過構(gòu)建NJ和MP系統(tǒng)進(jìn)化樹分析得到塔河馬鹿和阿爾泰馬鹿、伊河馬鹿遺傳距離較遠(yuǎn)，塔河馬鹿與伊河馬鹿有部分單倍型與其他亞種聚為一類，并認(rèn)為塔河馬鹿與阿爾泰馬鹿、伊河馬鹿屬于不同類群；塔河馬鹿與伊河馬鹿受到外種入侵，懷疑是由于引種雜交所致。

2009年，L Partis等[15]分析了歐洲39個地區(qū)馬鹿線粒體DNA的D-loop控制區(qū)和CYTB基因，通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹和networks網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖來分析歐洲馬鹿系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和遺傳多樣性。結(jié)果表明，歐洲馬鹿分為3個類群，分別是歐洲西部類群、歐洲東部類群和地中海(撒丁島、西班牙和非洲)類群。并通過計算分化時間發(fā)現(xiàn)，3個類群是由更新世時期開始分離。西部類群和東部類群起源于伊比利亞和巴爾干半島，而第3個類群可能起源于撒丁島和非洲地區(qū)。

2011年，Anna Stankovic，Karolina Doan等[16]對來自于烏克蘭克里米亞半島的晚更新世馬鹿進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。從當(dāng)?shù)夭┪镳^中的烏克蘭克里米亞馬鹿骨頭獲得DNA，并擴(kuò)增線粒體DNA的CYTB基因，來分析與其他鹿科動物的進(jìn)化關(guān)系。通過與網(wǎng)上已經(jīng)登錄鹿科動物序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析得到，全世界的馬鹿主要分為3個類群，即西部馬鹿、東部馬鹿與中部馬鹿。烏克蘭克里米亞馬鹿屬于歐洲東北部的伊比利亞半島地區(qū)。

2012年，M.Barancekova.J.Krojerova-Prokesova等[17]測定了捷克梅花鹿線粒體DNA的CYTB基因和D-loop控制區(qū)，探討捷克梅花鹿系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明，捷克梅花鹿起源于日本半島和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，捷克梅花鹿的遺傳多樣性低于日本梅花鹿，高于俄羅斯梅花鹿亞種。

4.3 12SRNA

2005年，M.V.Kuznetsova等[18]通過分析家養(yǎng)鹿與其他幾種偶蹄動物的16SrRNA和12SrRNA序列，來研究其分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明，鹿科動物分為鹿屬和麂屬，狍屬、獐屬與駝鹿屬，馴鹿屬、騾鹿屬3個部分。

2006年，LI Bo等[19]測定梅花鹿和馬鹿線粒體DNA 12SrRNA基因387bp片段和CYTB基因402bp片段的序列來研究梅花鹿與馬鹿的系統(tǒng)發(fā)生和核酸距離。通過這2個基因的分析結(jié)果均表明，梅花鹿和馬鹿是相同的類群，均起源于梅花鹿。

4.4 16SRNA

2010年，劉忠權(quán)[20]測定獐線粒體DNA中的16SrRNA基因，從Genbank中獲得鹿科動物14種線粒體16SrRNA基因的全序列。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析鹿科動物系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生關(guān)系與獐亞科的關(guān)系。結(jié)果表明，鹿科分為鹿亞科、麂亞科、獐亞科和美洲鹿亞科；獐和美洲鹿亞科狍共同組成獐亞科；毛冠鹿的分類還不確定。

4.5 其他基因

2010年，Daiming Zha等[21]基于tRNA-Val基因與16SrRNA基因設(shè)計梅花鹿、東北馬鹿、塔河馬鹿、赤鹿、馴鹿和牛的特異性引物，通過建立多重PCR方法，最終得到了一種簡單、快捷、成本低廉的檢測方法，能夠從鹿科動物和普通家養(yǎng)動物中進(jìn)行各類鹿產(chǎn)品的分子檢測。

5 展望

在鹿科動物線粒體DNA應(yīng)用進(jìn)展方面，種群起源進(jìn)化和遺傳多樣性是研究熱點。但目前關(guān)于茸鹿資源mtDNA的研究只涉及D-loop區(qū)、16SrRNA基因，并且其研究也只限于有限的幾個資源，部分資源mtDNA的研究一直處于空白狀態(tài)。為了排除單個基因可能存在種內(nèi)多態(tài)性缺陷及有限序列在統(tǒng)計學(xué)上的偏差，應(yīng)該利用mtDNA的全序列針對我國特有鹿科動物資源，全面分析起源進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，從分子遺傳學(xué)角度探討鹿科動物群體遺傳結(jié)構(gòu)和種群特征的差異，系統(tǒng)分析中國鹿科動物與世界鹿類資源系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

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