張 健，劉國(guó)新，張 穎，劉 浩

(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；

2. 食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

尿素醇解反應(yīng)的影響因素及動(dòng)力學(xué)研究

張 健1，劉國(guó)新1，張 穎2，劉 浩1

(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；

2. 食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

針對(duì)尿素和乙醇反應(yīng)體系，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)研究反應(yīng)溫度、體系pH和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)氨基甲酸乙酯生成的影響，并根據(jù)反應(yīng)機(jī)理，建立了尿素和乙醇親核取代反應(yīng)生成氨基甲酸乙酯的表觀動(dòng)力學(xué)方程．結(jié)果表明，高溫、高乙醇體積分?jǐn)?shù)和較小的pH有利于氨基甲酸乙酯的生成．通過(guò)建立的模型可以很好地預(yù)測(cè)尿素–乙醇–水三元體系中氨基甲酸乙酯的生成量，但在真實(shí)酒樣中，該模型對(duì)氨基甲酸乙酯含量的預(yù)測(cè)值為實(shí)測(cè)值的66.4%～86.5%，從動(dòng)力學(xué)的角度證明干紅葡萄酒中尿素為氨基甲酸乙酯的主要前體，但并非唯一前體．

尿素；乙醇；氨基甲酸乙酯；動(dòng)力學(xué)

尿素又稱碳酰二胺、碳酰胺、脲，廣泛存在于發(fā)酵食品中．除了原料引入和人為添加外，釀酒酵母的氮代謝亦是發(fā)酵食品中尿素的主要來(lái)源[1]．已有大量研究[2-4]發(fā)現(xiàn)，尿素和乙醇在自然條件下可反應(yīng)生成氨基甲酸乙酯(EC)，而EC是國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定的2A類致癌物，受到聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織的重點(diǎn)監(jiān)控[5]. 雖然EC的前體物質(zhì)很多，但尿素被認(rèn)為是EC的主要前體[6]，從某種意義來(lái)說(shuō)，尿素的含量可以反映發(fā)酵食品中潛在的EC含量．

關(guān)于尿素和乙醇的反應(yīng)過(guò)程，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的不多. 1988年，Ough等[7]曾對(duì)比多種的氨甲酰化合物(包括尿素)與乙醇生成EC的反應(yīng)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)酸性條件和高溫環(huán)境有利于該類反應(yīng)的進(jìn)行．此后，又有學(xué)者[8]研究了不同貯藏時(shí)間和溫度對(duì)葡萄酒中EC生成的影響，其重點(diǎn)也是監(jiān)測(cè)尿素和乙醇的反應(yīng)．現(xiàn)已知尿素和乙醇生成EC的反應(yīng)過(guò)程受體系pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度和時(shí)間等因素的影響，但已有的報(bào)道缺乏對(duì)這些影響因素的深入研究以及對(duì)該反應(yīng)的

動(dòng)力學(xué)描述．為此，本文將深入研究不同因素對(duì)該反應(yīng)體系的影響，從動(dòng)力學(xué)的層面對(duì)反應(yīng)進(jìn)行合理地解釋，建立相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程，并嘗試將該動(dòng)力學(xué)方程應(yīng)用于實(shí)際葡萄酒樣品的EC含量預(yù)測(cè)中．

1 材料與方法

1.1 原料及試劑

干紅葡萄酒，市售；尿素、無(wú)水乙酸、酒石酸，分析純；乙酸鈉、濃鹽酸，化學(xué)純；氨基甲酸乙酯(純度大于99%)、9-羥基噸(純度大于99%)，Sigma公司；無(wú)水乙醇、乙腈，色譜純；娃哈哈純凈水．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 影響因素實(shí)驗(yàn)

本研究采用Box-Behnken設(shè)計(jì)[9]研究尿素和乙醇的親核取代反應(yīng)，系統(tǒng)研究溫度、pH和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)氨基甲酸乙酯生成的影響．實(shí)驗(yàn)因子水平的選取見(jiàn)表1．體系pH調(diào)節(jié)采用酒石酸，尿素質(zhì)量濃度固定為500,mg/L，反應(yīng)時(shí)間為6,d．

1.2.2 動(dòng)力學(xué)研究

在體積分?jǐn)?shù)為11.5%的乙醇水溶液中加入一定量尿素，至尿素質(zhì)量濃度為50,mg/L，采用1,mol/L的酒石酸溶液調(diào)節(jié)體系pH為3.5，此即為簡(jiǎn)單的紅酒模擬體系．將該體系樣品分別置于283、303、343,K的溫度條件下保存0、10、20、30、40、50、60,d，取樣測(cè)定尿素和氨基甲酸乙酯質(zhì)量濃度，擬合相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)．

隨機(jī)選取3種市售紅酒，分別測(cè)定初始尿素和EC的質(zhì)量濃度，然后將3種紅酒置于343,K的溫度條件下密封保存20、40、60,d，測(cè)定EC的質(zhì)量濃度，驗(yàn)證動(dòng)力學(xué)方程．

1.3 分析方法

采用HPLC-FLD法[10]測(cè)定尿素和EC質(zhì)量濃度．取600,μL樣品和400,μL 9–羥基噸溶液，加入100,μL 1.5,mol/L稀鹽酸后振蕩搖勻，在30,℃避光條件反應(yīng)30,min，反應(yīng)后的樣品經(jīng)0.22,μm的有機(jī)膜過(guò)濾后進(jìn)行色譜分析．

1.4 模型參數(shù)擬合方法

采用Origin Pro 8.1進(jìn)行曲線擬合，模型參數(shù)的求解由最小二乘法擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到．

2 結(jié)果與討論

2.1 不同條件對(duì)反應(yīng)過(guò)程的影響

不同的反應(yīng)條件，如pH、反應(yīng)溫度、體系基質(zhì)等都會(huì)對(duì)特定的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生影響．對(duì)于尿素和乙醇的親核取代反應(yīng)，亦有一些相關(guān)的報(bào)道探討各因素的作用；但已有的研究多為單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)于不同因素的交互作用探討的不多．因此，本研究采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，試圖用較少的實(shí)驗(yàn)得到較多的信息，尤其是單因素實(shí)驗(yàn)無(wú)法探究的各因素之間的交互作用信息．實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2．

對(duì)表2中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，擬合所得二次方程為Y＝10,798.86＋7,750,X1－1,109.11,X2＋213.06,X3＋5,376,X12＋335.05,X1,X2＋305.84,X1,X3＋551.26,X22＋257.73,X2,X3＋219.64,X32，回歸方程的方差分析見(jiàn)表3．由表3可知：該模型極顯著(P＜0.01)，而且經(jīng)分析計(jì)算該模型的確定系數(shù)2R＝0.997,9，表明模型擬合很好．溫度、pH對(duì)EC質(zhì)量濃度的線性效應(yīng)顯著；且溫度對(duì)EC質(zhì)量濃度的曲面效應(yīng)也顯著；乙醇體積分?jǐn)?shù)以及各因素的交互影響不顯著．溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)EC的生成影響都是正效應(yīng)，即溫度的升高或乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大有利于EC的生成；而pH的影響是負(fù)效應(yīng)，較小的pH有利于EC的生成，這與Stevens等[4]的報(bào)道一致．

2.2 動(dòng)力學(xué)方程的建立

尿素和乙醇的反應(yīng)可以用式(1)[11]來(lái)表示.

根據(jù)式(1)可知，1,mol的尿素與1,mol的乙醇反應(yīng)生成1,mol的氨基甲酸乙酯，假若反應(yīng)完全進(jìn)行且反應(yīng)過(guò)程中沒(méi)有物料損失，可以根據(jù)尿素的消耗速率來(lái)推算EC的生成速率．然而，實(shí)際情況并非如此，尿素在本反應(yīng)體系中還會(huì)發(fā)生水解反應(yīng)，而在酒類飲料中可能發(fā)生的反應(yīng)更為復(fù)雜．如果反應(yīng)體系中的尿素是EC的唯一前體，則體系中EC的含量可以用式(2)表示.

式中：1k為由尿素生成EC的反應(yīng)速率常數(shù)，d-1；ECρ為EC質(zhì)量濃度，μg/L；ureaρ為尿素質(zhì)量濃度，μg/L；t為反應(yīng)時(shí)間，d．

假設(shè)尿素分解的反應(yīng)級(jí)數(shù)為1級(jí)，則urealnρ應(yīng)與時(shí)間t成線性相關(guān)．分別以283、303、343,K的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，其線性復(fù)相關(guān)系數(shù)分別為0.947,4、0.931,7、0.947,5．由此可知，反應(yīng)級(jí)數(shù)為1的假設(shè)是成立的，故以下均以1級(jí)為準(zhǔn)確定尿素分解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程及活化能．典型的1級(jí)動(dòng)力學(xué)方程可用式(3)表示．

式中：2k為尿素分解反應(yīng)速率常數(shù)，d-1．

式(3)積分得

將式(4)代入式(2)得到EC生成的動(dòng)力學(xué)方程．

根據(jù)不同時(shí)間實(shí)測(cè)的尿素質(zhì)量濃度擬合方程(式(3))可以求出2k，將2k代入式(5)，再根據(jù)不同時(shí)間實(shí)測(cè)的EC質(zhì)量濃度可以擬合求得1k，結(jié)果見(jiàn)表4.

由表4可知：在所選的溫度條件下，該模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)(2R)均在0.93以上，證明本文所提出的動(dòng)力學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)值吻合良好，能夠用來(lái)預(yù)測(cè)EC隨時(shí)間的變化規(guī)律．為了預(yù)測(cè)任意溫度下EC隨時(shí)間的變化規(guī)律，引入了Arrhenius方程．

式中：k為反應(yīng)速率常數(shù)；0k為指前因子；aE為表觀活化能；R為通用氣體常數(shù)．

對(duì)Arrhenius方程兩邊取對(duì)數(shù)，可得

以lnk為縱坐標(biāo)，1/T為橫坐標(biāo)作圖，回歸后可得到lnk與1/T的關(guān)系式．對(duì)于k1，關(guān)系式為lnk1= 12.05?4 656.9/T ；對(duì)于k2，關(guān)系式為lnk2=7.55?4 382.9/T．由此可得，尿素生成EC反應(yīng)的表觀活化能Ea=38.7,kJ/mol，指前因子k0為2.683×105,mL/ (mol·d)；尿素分解反應(yīng)的表觀活化能Ea=36.4,kJ/ mol，指前因子k0為1.9×103,mL/(mol·d)．

根據(jù)Arrhenius方程，可以求出任意溫度條件下的k1和k2，因此只要知道尿素和EC的初始質(zhì)量濃度，就可以根據(jù)式(5)預(yù)測(cè)不同時(shí)間內(nèi)EC的質(zhì)量濃度．為了驗(yàn)證方程的預(yù)測(cè)能力，按照1.2.2中的方法

處理3種酒樣后，比較EC質(zhì)量濃度的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值，結(jié)果見(jiàn)表5．

結(jié)果表明：EC預(yù)測(cè)結(jié)果普遍偏低13.5%～33.6%，即預(yù)測(cè)值為實(shí)測(cè)值的66.4%～86.5%．本研究中動(dòng)力學(xué)方程是基于尿素和乙醇的醇解反應(yīng)，并且假設(shè)尿素為EC的唯一前體而建立的．事實(shí)上，除尿素外，有報(bào)道[11]認(rèn)為瓜氨酸和氨甲酰磷酸等物質(zhì)都是EC的潛在前體，只是此類物質(zhì)對(duì)EC形成的貢獻(xiàn)很?。緦?shí)驗(yàn)所用酒樣中很可能存在除尿素外的其他EC前體，也許這就是導(dǎo)致該方程應(yīng)用于實(shí)際酒樣中預(yù)測(cè)結(jié)果偏低的原因．另外，本研究是基于模擬體系(乙醇體積分?jǐn)?shù)為11.5%，pH 3.5)的動(dòng)力學(xué)建模，而實(shí)際紅酒樣品中的乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH并不固定，一般乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%～13%，而pH為3.2～3.6．因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH的不確定性也可能會(huì)對(duì)方程EC含量的預(yù)測(cè)形成干擾，包含這些干擾因素的更為復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)模型還有待進(jìn)一步研究．

3 結(jié) 論

尿素和乙醇的親核取代反應(yīng)，在高溫、低pH和高乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下更易進(jìn)行，會(huì)生成較多的EC，但各因素間的交互影響作用并不明顯．在283～343,K的溫度范圍內(nèi)，尿素和乙醇親核取代反應(yīng)的表觀活化能為38.7,kJ/mol，而尿素分解反應(yīng)的表觀活化能為36.4,kJ/mol．通過(guò)建立的模型可以很好地預(yù)測(cè)尿素–乙醇–水三元體系中EC的生成量；但在真實(shí)酒樣中，該模型對(duì)EC含量的預(yù)測(cè)值為實(shí)測(cè)值的66.4%～86.5%．本研究從動(dòng)力學(xué)的角度證明干紅葡萄酒中尿素為EC的主要前體，但并非唯一前體．

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責(zé)任編輯：周建軍

Influencing Factors and Kinetics of Urea Alcoholysis Reaction

ZHANG Jian1，LIU Guoxin1，ZHANG Ying2，LIU Hao1
(1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；
2. Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

The effect of temperature，pH，and ethanol on urea alcoholysis reaction was studied using Box-Behnken experimental design. An apparent kinetics model of the urea reaction with ethanol to form ethyl carbamate was developed based on the reaction mechanism. Results indicate that the high temperature，high ethanol content and low pH value are conducive to the formation of ethyl carbamate. The predicted value of the ethyl carbamate fits well with the measured values in ureaethanol-water system，but fits poorly in the real wine samples. In fact，the predicted values are only 66.4% to 86.5%of the measured values. It suggests that the urea is the main precursor of ethyl carbamate，but not the only one in red wine，from the view of kinetics.

urea；ethanol；ethyl carbamate；kinetics

O643.1

A

1672-6510(2014)05-0006-04

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.05.002

2013–12–20；

2014–03–25

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31101275，31201354)

張 ?。?978—），男，甘肅蘭州人，副研究員；通信作者：劉 浩，教授，liuhaokd@tom.com.