曹 磊，平 芬，馬 錚，李 萍

煙草危害是人類(lèi)健康最大的可以預(yù)防的危險(xiǎn)因素，2012年我國(guó)原衛(wèi)生部發(fā)布的《中國(guó)吸煙危害健康報(bào)告》[1]顯示，我國(guó)吸煙人群超過(guò)3億，約7.4億不吸煙人群遭受二手煙的危害，吸煙可以導(dǎo)致呼吸、心血管、消化、內(nèi)分泌等多系統(tǒng)疾病，每年約有100萬(wàn)人死于吸煙相關(guān)性疾病。吸煙致癌的機(jī)制被廣泛研究，但是其對(duì)免疫系統(tǒng)影響的研究卻較少。所以關(guān)于吸煙相關(guān)性疾病，不再僅強(qiáng)調(diào)其與癌癥、心血管疾病的關(guān)系，還應(yīng)注意其對(duì)機(jī)體造成的免疫損傷以及免疫損傷后的反復(fù)感染。

樹(shù)突細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是一種專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)，體內(nèi)含量少，提呈作用超強(qiáng)，DCs能激活初始T細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)體的有效免疫應(yīng)答，并決定免疫應(yīng)答的方向，同時(shí)DCs在維持免疫耐受方面也具有重要作用[2]。其能提呈抗原，表達(dá)共刺激分子，分泌細(xì)胞因子，激活T、B淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，是啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素[3]。本研究旨在觀察不同香煙煙霧暴露時(shí)間對(duì)大鼠DCs數(shù)量的影響，為吸煙相關(guān)性疾病的臨床治療及藥物研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 將清潔級(jí)雄性Wistar大鼠(購(gòu)買(mǎi)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)50只，體質(zhì)量(150±20)g，按照完全隨機(jī)化法分為空白對(duì)照組(A組，10只)和香煙煙霧暴露組(40只)，按照不同暴露時(shí)間將香煙煙霧暴露組又分為香煙煙霧暴露4周組(B組)、香煙煙霧暴露8周組(C組)、香煙煙霧暴露12周組(D組)和香煙煙霧暴露8周戒煙8周組(E組)，每組10只。

1.2 研究方法 將香煙煙霧暴露組大鼠放在自制有機(jī)玻璃熏煙箱內(nèi)(60 cm×60 cm×90 cm)，每天熏煙2次(間隔時(shí)間>6 h)，每次點(diǎn)燃5支香煙(鉆石牌香煙，焦油量11.0 mg，煙氣煙堿量1.0 mg，煙氣一氧化碳量11.0 mg)放入有機(jī)玻璃熏煙箱內(nèi)，燃燒15 min，休息5 min后再放入5支，每天點(diǎn)燃30支，持續(xù)2 h，香煙煙霧暴露間隔期間將大鼠置于正常無(wú)煙環(huán)境中飼養(yǎng)，任其自由采食、飲水。A組大鼠不熏煙，置于正常無(wú)煙環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.3 取材 香煙煙霧暴露組大鼠分別在香煙煙霧暴露4周、8周、12周及香煙煙霧暴露8周戒煙8周后腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，腹主動(dòng)脈放血處死，分離肺組織，取右肺中葉置于4%多聚甲醛固定液中保存24 h，常規(guī)石蠟包埋切片備用。A組大鼠16周后做相同處理。

1.4 DCs計(jì)數(shù) 以CD11c和S100蛋白作為大鼠支氣管肺組織DCs的標(biāo)志物，采用免疫組化法染色切片，以胞質(zhì)染成棕黃色或黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)取10個(gè)高倍野(400倍)，使用IPP6軟件計(jì)數(shù)染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值即為該張切片的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，也即DCs數(shù)量。

2 結(jié)果

CD11c、S100蛋白陽(yáng)性DCs均在支氣管管壁、炎癥區(qū)域、血管周?chē)植济黠@。5組CD11c、S100蛋白陽(yáng)性DCs數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B、C、D、E組CD11c、S100蛋白陽(yáng)性DCs數(shù)量均高于A組，C、D組均高于B組，D組高于C組，E組低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表 1，圖1～2)。

Table1 Comparison of the number of CD11c+and S100+DCs among five groups

組別例數(shù)CD11c陽(yáng)性DCsS100陽(yáng)性DCsA組108 6±0 98 4±0 8B組1010 1±0 8★10 3±1 1★C組1013 5±1 0★●12 9±1 6★●D組1014 6±1 1★●■14 2±1 7★●■E組1012 0±1 4★■11 6±1 4★■F值53 1427 41P值<0 001<0 001

注：與A組比較，★P<0.05；與B組比較，●P<0.05；與C組比較，■P<0.05；DCs=樹(shù)突細(xì)胞

圖1 5組大鼠肺內(nèi)CD11c陽(yáng)性DCs分布(免疫組化法，×400)

圖2 5組大鼠肺內(nèi)S100蛋白陽(yáng)性DCs分布(免疫組化法，×400)

3 討論

吸煙可以導(dǎo)致呼吸、心血管、消化、內(nèi)分泌等多系統(tǒng)疾病，肺部有巨大的表面積、豐富的血流，如與香煙煙霧直接接觸，會(huì)成為首當(dāng)其沖的受害器官[4]。香煙煙霧暴露使肺組織局部巨噬細(xì)胞凋亡[5]，中性粒細(xì)胞激活、聚集，炎性遞質(zhì)釋放[6]，肺毛細(xì)血管壁通透性升高，從而導(dǎo)致出血及間質(zhì)性肺水腫。肺部DCs在維持肺臟免疫平衡中起著非常重要的作用。肺部DCs存在于人和鼠整個(gè)肺組織，包括氣管、支氣管、肺泡和臟層胸膜，在整個(gè)氣管樹(shù)內(nèi)皮構(gòu)成一個(gè)完整的DCs網(wǎng)絡(luò)[7]。支氣管肺組織中的DCs是呼吸系統(tǒng)免疫環(huán)境中最重要的抗原提呈和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，發(fā)揮免疫前哨監(jiān)視和誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)的功能。有研究表明，急性肺損傷早期即存在肺部DCs數(shù)量和成熟程度的增加，并可能通過(guò)增強(qiáng)Th1型免疫應(yīng)答及促炎性細(xì)胞因子的分泌啟動(dòng)及加劇急性肺損傷早期肺部炎性反應(yīng)[8]，且急性肺損傷時(shí)小鼠外周血DCs數(shù)量早期減少，隨后逐漸增多，功能呈漸成熟狀態(tài)[9]。尼古丁是香煙煙霧中具有免疫調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)，其多種功能是通過(guò)除中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元以外的細(xì)胞上的尼古丁乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors,nAChR)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。全身很多細(xì)胞均存在nAChR，如上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞[10]。在與煙草相關(guān)疾病的研究中，Ginzkey等[11]的研究發(fā)現(xiàn)nAChR、DNA損傷中的氧化應(yīng)激反應(yīng)與煙草相關(guān)癌癥具有相關(guān)性，而在尼古丁與DCs的眾多研究中均發(fā)現(xiàn)其可以改變DCs的生物活性[12]。李毅等[13]在大鼠哮喘模型研究中發(fā)現(xiàn)，尼古丁抑制DCs髓樣分化因子88(MyD88)以及白介素(IL)-10、IL-12的表達(dá)，降低DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力，從而削弱了DCs的抗原識(shí)別和提呈功能。

本研究以CD11c和S100蛋白作為大鼠支氣管肺組織DCs的標(biāo)志物來(lái)研究不同香煙煙霧暴露時(shí)間對(duì)其肺臟DCs數(shù)量的影響。CD11c是分子量為150 kD的αX亞單位β2整合素家族成員，是確定DCs的特異性表面標(biāo)志物之一，在大鼠髓系和淋巴系DCs，包括DCs前體、未成熟及成熟的DCs中均有較高的表達(dá)[14-15]。S100蛋白是一種氨基酸序列高度保守的、EF手型(螺旋2環(huán)2螺旋)的鈣結(jié)合蛋白，通過(guò)對(duì)鈣離子(Ca2+)的調(diào)節(jié)及與靶蛋白的相互作用，在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)作用。S100蛋白以Ca2+依賴(lài)的方式調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外的生理活動(dòng)，部分S100蛋白被分泌到細(xì)胞外作用于白細(xì)胞，調(diào)控靶細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和炎性細(xì)胞的活性。文獻(xiàn)報(bào)道S100蛋白可以標(biāo)記所有成熟及未成熟的DCs[16]。本研究觀察到在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯的支氣管、肺組織區(qū)域DCs分布增多，炎癥區(qū)域血管周?chē)梢?jiàn)大量的DCs分布，這可能與DCs從血液中遷徙而來(lái)有關(guān)，與Lommatzsch等[17]的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，隨著香煙煙霧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，CD11c和S100蛋白標(biāo)記陽(yáng)性DCs數(shù)量增多，D組>C組>B組>A組，而E組CD11c和S100蛋白標(biāo)記陽(yáng)性DCs數(shù)量少于C組，但多于A組，進(jìn)一步說(shuō)明香煙煙霧暴露能夠誘導(dǎo)大鼠肺組織DCs數(shù)量增多，而且與暴露時(shí)間有關(guān)，戒煙后DCs數(shù)量減少。正常情況下肺部DCs數(shù)量十分稀少，不到肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的1%。肺部DCs以未成熟的狀態(tài)廣泛分布于呼吸道上皮組織和黏膜下層中，氣道DCs的這種分布有利于其及時(shí)獲取和處理吸入抗原信息、維持氣道上皮屏障功能完整。當(dāng)外源性抗原進(jìn)入機(jī)體后，DCs通過(guò)巨胞飲、吞噬、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用攝取外源性抗原，抗原經(jīng)過(guò)DCs處理后，形成抗原肽片段，可經(jīng)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子及CD1分子途徑得到有效的遞呈。氣道DCs在與吸煙相關(guān)性肺疾病中起著非常重要的作用。

本研究立足于香煙煙霧暴露對(duì)DCs數(shù)量的影響，并未就增多的DCs的來(lái)源做進(jìn)一步研究，亦未對(duì)增多的DCs功能的改變做進(jìn)一步了解，故將會(huì)在以后的研究中逐步深入。

總之，本研究結(jié)果表明香煙煙霧暴露可以導(dǎo)致大鼠肺組織DCs數(shù)量增加，且隨著香煙煙霧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，DCs數(shù)量增多越明顯，戒煙后其數(shù)量有所減少。

1 衛(wèi)生部發(fā)布《中國(guó)吸煙危害健康報(bào)告》[J].中國(guó)衛(wèi)生政策研究,2012,5(6):59.

2 Ohnmacht C,Pullner A,King SB,et al.Constitutive ablation of dendritic cells breaks self-tolerance of CD4 T cells and results in spontaneous fatal autoimmunity[J].J Exp Med,2009,206(3)：549-559.

3 Robays LJ,Maes T,Joos GF,et al.Between a cough and a wheeze：dentic cells at the nexus of tobacco smoke-induced allergic airway sensitization[J].Mucosal Immunol,2009,2(3):206-219.

4 趙燕妮,王廣發(fā).吸煙與慢性阻塞性肺疾病[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志：電子版,2012,04(1):15-19.

5 Henning A,Schneider M,Nafee N,et al.Influence of particle size and material properties on mucociliary clearance from the airways[J].J Aerosol Med Pulm Drug Deliv,2010,23(4):233-241.

6 Aoshiba K,Tamaoki J,Nagai A.Acute cigarette smoke exposure induces apoptosis of alveolar macrophages[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2001,281(6):L1392-1401.

7 Castro P,Legora-Machado A,Cardilo-Reis L.Inhibition of interleukin-1beta reduces mouse lung inflammation induced by exposure to cigarette smoke[J].Eur J Pharmacol,2004,498(1/2/3):279-286.

8 董亮,賀宏麗,劉軍,等.急性肺損傷早期肺常規(guī)樹(shù)突狀細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2012,21(6):607-611.

9 劉軍,張朋書(shū),董亮,等.急性肺損傷小鼠外周血樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量及功能狀態(tài)的變化[J].中華麻醉學(xué)雜志,2013,33(3):342-345.

10 Yanagita M,Kobayashi R,Kojima Y,et al.Nicotine modulates the immunological function of dendritic cells through peroxisome proliferator-activated receptor-γ upregulation[J].Cell Immunol,2012,274 (1/2):26-33.

11 Ginzkey C,Stueber T,Friehs G,et al.Analysis of nicotine-induced DNA damage in cells of the human respiratory tract[J].Toxicol Lett,2012,208(1):23-29.

12 Nouri-Shirazi M,Tinajero R,Guinet E.Nicotine alters the biological activities of developing mouse bone marrow-derived dendritic cells (DCs)[J].Immunol Lett,2007,109(2):155-164.

13 李毅,杜永成,許建英.尼古丁對(duì)哮喘大鼠樹(shù)突狀細(xì)胞髓樣分化因子88及白介素-10,白介素-12 表達(dá)的影響[J].免疫學(xué)雜志,2011,27(1):28-32.

14 Basak SK,Harui A,Stolina M,et al.Increased dendritic cell number and function following continuous in vivo infusion of granulocyte macrophage-colony-stimulating factor and interleukin-4[J].Blood,2002,99(8):2869-2879.

15 Sedlik C,Orbach D,Veron P,et al.A critical role for Syk protein tyrosine kinase in Fc receptor-mediated antigen presentation and induction of dendritic cell maturation[J].J Immunol,2003,170 (2):846-852.

16 Donato R.S100:a mutigenic family of calcium-modulated proteins of the EF-hand type with intracellular and extracellular functional roles [J].Int J Biochem Cell Biol,2001,33(7):637-668.

17 Lommatzsch M,Bratke K,Knappe T,et al.Acute effects of tobacco smoke on human airway dendritic cells in vivo[J].Eur Respir J,2010,35(5):1130-1136.