祁萬強,薛曉東,阮濤,劉金科

(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院甘肅蘭州730000;2.甘肅省人民醫(yī)院整形科甘肅蘭州730000)

VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠對糖尿病大鼠局部深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面MVD及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響

祁萬強1,薛曉東2,阮濤1,劉金科1

(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院甘肅蘭州730000;2.甘肅省人民醫(yī)院整形科甘肅蘭州730000)

目的:制備外用VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠并觀察其對糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合的作用.方法:以新型凝膠卡波姆980為基質(zhì),分別加入VEGF165、胰島素,分別配制成胰島素凝膠、VEGF165凝膠、VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠和空白對照凝膠.觀察各組凝膠性狀,檢測其pH值.75只SPF級雄性Wistar大鼠,體重190~290g,隨機(jī)分為正常對照組、糖尿病對照組、胰島素凝膠組、VEGF165凝膠組、VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組,每組15只.各組大鼠禁食12h后,除正常對照組外,其余各組一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(55 mg/kg)制備1型糖尿病模型,正常對照組大鼠注射相同劑量檸檬酸鈉緩沖液.1型糖尿病大鼠造模成功后,采用恒溫水浴箱80℃,制備深Ⅱ度燙傷模型.正常對照組、糖尿病對照組創(chuàng)面外敷空白凝膠基質(zhì),其余各組外敷對應(yīng)凝膠制劑,每天換藥1次.深Ⅱ度燙傷造模成功后觀察各組大鼠存活情況,于3、7、11、15、21天時點觀察糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合情況并計算創(chuàng)面愈合率,在各時點隨機(jī)處死每組3只大鼠取燙傷皮膚全層留取標(biāo)本,行組織學(xué)切片及免疫組化染色觀察各時點炎性細(xì)胞,微血管形成及膠原蛋白.結(jié)果:制備的各組凝膠透明,保濕性極佳,黏附性良好,便于涂抹及清洗,無組織毒性.各組大鼠無感染及死亡發(fā)生.3天后燙傷各組創(chuàng)面無明顯縮小,7、11、15、21天時,VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組創(chuàng)面愈合率最高,糖尿病組最低.VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組愈合率與其余各組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05).病理切片觀察示各時點VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組肉芽組織形成及上皮化均優(yōu)于其余各組.免疫組化染色示各組微血管數(shù)量、Ⅰ型膠原蛋白陽性率均于3天開始表達(dá),且隨時間陽性細(xì)胞增多明顯;各時間點VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組微血管密度及Ⅰ型膠原蛋白最高,糖尿病組最低,與其余各組比較以及VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組、糖尿病組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05).結(jié)論:糖尿病大鼠皮膚深Ⅱ度燙傷外用VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠對創(chuàng)面愈合有明顯的促進(jìn)作用

VEGF;胰島素;卡波姆凝膠;糖尿病大鼠;創(chuàng)面愈合

隨著社會的發(fā)展,人們的物質(zhì)生活越來越豐富,糖尿病發(fā)病率也隨之提升,臨床上糖尿病合并皮膚燒傷患者創(chuàng)面難愈合已經(jīng)成為當(dāng)前急需解決的醫(yī)學(xué)難題.有研究證實,糖尿病合并創(chuàng)面難愈合主要是皮下組織中糖增高和真皮層晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts, AGEs)的堆積所致的皮膚微環(huán)境改變[1-2],這種變化使創(chuàng)傷后各種促愈合的細(xì)胞因子減少,其中血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowth factor,VEGF)對于微血管的生成起決定性調(diào)控作用,而微血管的生成對于創(chuàng)面愈合至關(guān)重要.大量動物實驗也證明,細(xì)胞因子和胰島素的聯(lián)合應(yīng)用可加快促進(jìn)糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合[3-5]時間.但對于糖尿病合并燒燙傷外用VEGF的研究報道較少,本實驗通過外用VEGF165-胰島素觀察糖尿病大鼠燙傷創(chuàng)面愈合過程中微血管密度( microvessel density,MVD)及Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)情況,為臨床治愈創(chuàng)面提供進(jìn)一步研究數(shù)據(jù).

1 實驗材料和方法

1.1 實驗儀器及試劑:光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯中國公司),電動離心機(jī)(華威中儀科技公司,北京),微量移液器(求精生化試劑儀器公司,上海),恒溫水浴箱(上海比朗儀器公司),磁力攪拌器(匯爾儀器公司,杭州),PH計(美尼特自動化儀表公司,杭州),快速血糖檢測儀(glucotrend公司).CD34免疫組織化學(xué)染色試劑盒及膠原蛋白Ⅰ型多克隆抗體(北京博奧森生物公司,中國),鏈脲佐菌素(STZ, streptozotoein,sigma公司,美國),血管內(nèi)皮生長因子165(VEGF165,vascular endothelial growth factor,peprotech公司,美國),低精蛋白鋅胰島素(萬邦生化醫(yī)藥公司,江蘇),卡波姆980(天力源科技公司,青島)等.

1.2 研究對象:75只雄性成年wistar大鼠(甘肅省中醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供),體重:190~290g.實驗動物質(zhì)量合格證編號:SCXK(甘)2011-001.單籠5只飼養(yǎng),飼養(yǎng)7天后開始造模.

1.3 實驗分組:75只雄性成年wistar大鼠隨即分成6組,A組(正常對照組),其余60只糖尿病大鼠隨機(jī)分為B組(糖尿病對照組)、C組(胰島素凝膠治療組)、D組(VEGF165凝膠治療組)、E組(VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠治療組),每組15只大鼠.

1.4 藥物配制

1.4.1 檸檬酸緩沖液的配制:A液的配制:準(zhǔn)確稱取檸檬酸2.1g緩慢加入蒸餾水100ml充分溶解;B液的配制:準(zhǔn)確稱取檸檬酸鈉2.94g緩慢加入蒸餾水100ml充分溶解.配制成的A、B液分別密封冰箱冷藏保存,用時將A、B液按1:1.32混合,用pH計測量調(diào)整混合液pH值為4.2~4.5,即為STZ所需檸檬酸緩沖液.

1.4.2 VEGF165-胰島素凝膠制備:取干燥小燒杯緩慢加入30ml蒸餾水,用電子天平準(zhǔn)確稱取0.6g卡波姆980,緩慢倒入蒸餾水中,勿攪拌搖勻.密封后放置12h后可見卡波姆呈絮狀充分溶于蒸餾水中,未凝結(jié)成塊.用微量移液器緩慢加入1 000μl蒸餾水于VEGF165 2μg試劑瓶中,待充分溶解后,用微量移液器取出500μl混合液和胰島素注射液1 600U,共同加入卡波姆絮狀液中,磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆?緩慢滴入三乙醇胺溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4~7.5.當(dāng)三乙醇胺加入后混合溶液馬上變?yōu)檎吵砟z狀,含大量氣泡,攪拌無法消除.取配制好的VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠,電動離心機(jī)離心30min去除大氣泡后,冰箱低溫保存?zhèn)溆?制備胰島素凝膠、VEGF165凝膠及空白凝膠方法同上.

1.5 實驗方法

1.5.1 建立糖尿病大鼠模型:實驗用成年健康大鼠禁食前1天用血糖檢測儀檢測大鼠血糖值在正常范圍(3.0~5.0mmol/L).給予充足飲水禁食12h以上后稱取大鼠體重,按每組大鼠體重計算所需STZ (55mg/kg)用量,采用一次腹腔快速給藥法[6],正常組15只大鼠腹腔注射相同劑量檸檬酸緩沖液,以消除檸檬酸緩沖液對實驗結(jié)果的影響,注射后48h后用注射針頭刺破大鼠尾靜脈,取血液測量血糖,未禁食狀態(tài)下血糖≥16.7mmol/L為造模成功,血糖未達(dá)上述標(biāo)準(zhǔn)的大鼠,3天后補充腹腔注射STZ10~15mg/kg.7天后血糖穩(wěn)定,大鼠毛發(fā),飲食、飲水量,行為活動發(fā)生明顯改變后1型糖尿病大鼠模型造模成功.對血糖濃度太高無法檢測得到具體數(shù)據(jù)的糖尿病大鼠,皮下注射一定量的胰島素,以防血糖過高致大鼠死亡.

1.5.2 糖尿病大鼠燙傷模型制備:造模24h前,用配制好的的脫毛膏(皂粉、硫化鈉、淀粉以1:3:6)在每只大鼠背部形成一個足夠大的裸露區(qū).根據(jù)參照文獻(xiàn)[7],恒溫水浴箱加熱致溫度80℃?zhèn)溆?按照各個大鼠體重,腹腔注射2%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)麻醉后,把其腹部向上固定于中央為4cmX4cm圓形空洞,厚度為2cm的木板上,松緊適宜,大鼠背部裸露區(qū)放置在空洞之中,將載有大鼠的木板浸泡在恒溫水浴箱中,恒溫水正好淹沒大鼠裸露皮膚.放置時間A組6S,B、C、D、E組各放置5s,燙傷后立即腹腔注射乳酸林格液10ml后,用生理鹽水紗布包裹燙傷部位,大鼠逐漸蘇醒后單籠單只喂養(yǎng),各組大鼠給予足量食物及飲水,墊料每天更換以保持鼠籠干燥,記錄大鼠飲水量、體重及進(jìn)食量.燙傷后1天肉眼觀察各組大鼠背部創(chuàng)面微潮,部分大鼠創(chuàng)面出現(xiàn)大小一致的小水泡,發(fā)紅腫脹,取大鼠燙傷皮膚組織行HE染色后鏡下觀察證實為深Ⅱ度燙傷.

1.5.3 藥物治療:糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷模型制備成功后,行干預(yù)治療措施,A、B組創(chuàng)面分別外敷空白凝膠,C組外敷胰島素凝膠、D組外敷VEGF165凝膠及E組外敷VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠,每天換藥1次直至實驗結(jié)束,換藥前用醫(yī)用棉球輕輕擦洗大鼠創(chuàng)面凝膠,最好用生理鹽水清洗創(chuàng)面.除A、B組大鼠外,其余大鼠每天檢測血糖,腹部皮下注射中長效胰島素4~6U/kg,使血糖控制在正常范圍[8].

1.5.4 標(biāo)本采集:燙傷大鼠分別在第3天、7天、11天、15天及21天時點隨機(jī)選取每組3只大鼠,采用腹腔注射利多卡因麻醉后行頸椎脫臼法處死,固定到一木板上,手術(shù)刀切開大鼠創(chuàng)面邊緣皮膚,銳性剝離燙傷全層組織,剪成5mm條索狀,用10%甲醛固定,石蠟包埋,切片,用于免疫組化.

1.5.5 燙傷面積愈合率的計算:造模成功采用透明膜描記加稱重法計算燙傷大鼠創(chuàng)面愈合率,大鼠燙傷24h后,先取透明膜描計各組創(chuàng)面輪廓,剪取同樣大小面積,質(zhì)地均勻的膠片用電子天平稱重,其重量為大鼠創(chuàng)面原始燙傷面積,采用相同描計方法計算大鼠未愈創(chuàng)面,把膠片的重量帶入下列公式進(jìn)行計算,創(chuàng)面愈合率=[(原始面積膠片重量-未愈面積膠片重量)/原始面積膠片重量]X100%.

1.5.6 燙傷組織微血管密度:各時點10%甲醛固定標(biāo)本組織,石蠟包埋,切片成功后,嚴(yán)格按照CD34免疫組化步驟進(jìn)行操作,給大鼠各時點切片染色后,顯微鏡下觀察到棕黃色為血管內(nèi)皮細(xì)胞陽性染色,每張染色片在10X40倍取6個視野計數(shù)微血管密度(MVD)數(shù)量,計算平均值作為新生血管形成指標(biāo).采用Pareek[9]方法計算MVD.

1.5.7 燙傷組織Ⅰ型膠原蛋白:取大鼠各組各時點部分切片,行大鼠Ⅰ型膠原免疫組化染色,顯微鏡下觀察,陽性產(chǎn)物為棕黃色或黃色.在10X40倍鏡下,創(chuàng)面隨機(jī)選取5個視野,應(yīng)用圖像分析軟件計算得出Ⅰ型膠原的陽性面積,取其均值.

1.5.8 統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示,各組間的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK檢驗;檢驗水準(zhǔn)α=0.05.

2 結(jié)果

2.1 各組燙傷糖尿病大鼠各時點血糖測定:見表1.

2.2 糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合觀察:糖尿病大鼠燙傷24h后,燙傷面積與模板面積大小一致,燙傷邊緣與周圍正常組織界限清楚,界限明顯發(fā)紅,水腫.燙傷3天后各組大鼠創(chuàng)面均未見縮小,創(chuàng)面皮溫增高,有大量滲出液,部分滲出物結(jié)痂,用生理鹽水棉球輕輕去除滲出物后可見創(chuàng)面基地部呈紅白相間,水腫較明顯,痛覺較為遲鈍.其中B組大鼠創(chuàng)面滲出明顯較多,水腫也最為明顯,A、C、D組大鼠次之,三組之間無明顯差異,E組大鼠相對其它組滲出物較少.各組大鼠創(chuàng)面滲出物部分結(jié)痂,結(jié)痂物周圍顏色輕微黃,質(zhì)稀薄,無特殊氣味.燙傷15天,愈合面積E>D>C>A,除B組外,其余各組大鼠創(chuàng)面周圍及毛囊邊緣創(chuàng)面已部分愈合,其中E組大鼠創(chuàng)面皮膚角化形成良好.B組大鼠創(chuàng)面開始愈合,可見邊緣上皮組織向中央爬行.燙傷21天,E組大鼠燙傷創(chuàng)面大部分基本已愈合,僅燙傷中央留少量未愈創(chuàng)面,愈合創(chuàng)面新生成的皮膚組織角化形成良好,可見密集細(xì)小的毛發(fā)生長,C、D組也大部分愈合,但中央存留未愈面積較E組大,皮膚角化形成好,見細(xì)小少量毛發(fā)生長,A組較C、D、E組愈合差,B組創(chuàng)面是各組愈合中最差.各組大鼠實驗中均無死亡及感染.

2.3 微血管密度(MVD)的檢測:CD34免疫組化均成陽性在燙傷后各組大鼠時點均表達(dá),但隨時間增長E組大鼠陽性細(xì)胞最多,其余各組次之,B組陽性表達(dá)最少.11天時E組大鼠陽性表達(dá)達(dá)最大值,其余各組大鼠于15天時達(dá)高峰(見圖1).B、E組大鼠各觀測時點與其他各組大鼠相比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,即:<0.05.燙傷3天時,A、C、D組大鼠CD34陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,即>0.05.從燙傷7天開始,燙傷創(chuàng)面C、D組大鼠組織CD34陽性細(xì)胞表達(dá)均高于A組,存在明顯差異性,即<0.05. C、D組糖尿病大鼠創(chuàng)面CD34陽性細(xì)胞表達(dá)各觀測時點比較差異不明顯,無統(tǒng)計學(xué)意義,即:>0.05.見表2.

2.4Ⅰ 型膠原表達(dá)的測定:燙傷3天后C、D組大鼠創(chuàng)面Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)無顯著差異,但隨時間延長,Ⅰ型膠原陽性細(xì)胞逐漸增多,E組大鼠創(chuàng)面組織含量最高,其余各組次之,B組大鼠創(chuàng)面膠原含量最少.燙傷7、11、15天,除E組大鼠外,其余各組主要表達(dá)于肉芽組織及血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍,E組大鼠在7、11天時表達(dá)于肉芽組織及血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍,15天時Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)在真皮層沉積,呈小團(tuán)塊無序線性排列(見圖2).21天時各組Ⅰ型膠原均主要在新生上皮基底細(xì)胞表達(dá),C、D組真皮層可見大量膠原,數(shù)量多且粗大,B組真皮層膠原含量最少,A組膠原含量次于C、D組,而E組真皮層缺損處可見大量膠原纖維填充,創(chuàng)面部分輕微攣縮.E組糖尿病大鼠燙傷組織Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)從燙傷3天開始與其他組相比較有明顯的差異性,而B組大鼠表達(dá)最低,E、B組比較及兩組與其余各組大鼠比較均存在差異性(<0.05);燙傷7、11、15、21天時,A組Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)均低于C、D、E組(<0.05),燙傷3天時,Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)A組與C、D組比較無明顯差異性(>0.05),各檢測時點Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)C、D組間比較均無差異均性(>0.05).見表3.

圖1 傷后15天各組大鼠創(chuàng)面CD34免疫組化微血管陽性(SPX400)表達(dá)情況

圖2 傷后15天各組大鼠創(chuàng)面Ⅰ型膠原陽性(SPX400)表達(dá)情況

表1 各組大鼠各時相點血糖(mmol/L)

表2 各組大鼠不同時相點微血管密度表達(dá)(n=3,條/mm2,±)

表3 各組大鼠不同時相點Ⅰ型膠原密度表達(dá)(n=3,條/mm2,±)

3 討論

創(chuàng)面愈合是一個連續(xù)的由多個互相交叉重疊過程組成,需通過各種細(xì)胞相互活動,相互影響來協(xié)同完成.這些活動并非隨意發(fā)生,而是有序地進(jìn)行調(diào)節(jié),與傷口中不同類型細(xì)胞的參與有關(guān)[10].而實驗證實,糖尿病患者皮膚組織血糖與細(xì)胞因子水平呈負(fù)相關(guān)、過度的蛋白酶分解以及皮下神經(jīng)、血管病變等諸多因素,導(dǎo)致了皮膚創(chuàng)面不愈或延遲愈合[11-13].

研究表明,糖尿病大鼠皮膚深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面局部組織VEGF含量低下導(dǎo)致血管分化低下,致創(chuàng)面血供明顯少于非高血糖組織,肉芽組織形成遲緩等變化,呈現(xiàn)創(chuàng)面不愈或難愈的特征[14].近年,糖尿病合并燙傷創(chuàng)面難愈合研究發(fā)現(xiàn),局部細(xì)胞因子含量對創(chuàng)面愈合影響至關(guān)重要,其中VEGF是非常重要的因子之一.VEGF是能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,又能促進(jìn)血管保持正常狀態(tài)[15].在血管形成發(fā)展過程中,缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是轉(zhuǎn)錄活化編碼VEGF基因的活化因子,從而刺激血管形成[16-17].而HIF-l的活性[18]由缺氧誘導(dǎo)因子-1a(Hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a)決定.組織中HIF-1a含量升高將抑制HIF-l的活性,糖尿病慢性創(chuàng)面引起了組織缺血缺氧,使創(chuàng)面組織中HIF-1a分泌增加,致VEGF含量減少[19]從而導(dǎo)致創(chuàng)面的愈合延遲或不愈合.喬亮等[20]利用熒光微球?qū)μ悄虿〈笫笊睥蚨葼C傷創(chuàng)面血管化進(jìn)行觀察,得出創(chuàng)面新生血管化程度、數(shù)量及質(zhì)量與對照組相比明顯降低.由此推斷糖尿病創(chuàng)面VEGF濃度較正常創(chuàng)面降低,使其無法促進(jìn)血管生成,致新鮮肉芽組織明顯缺乏.本實驗就是利用糖尿病大鼠皮膚組織中HIF-1活性抑制,VEGF含量不足,外用VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和體表血管生成,初步證實外用一定濃度的VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠對創(chuàng)面愈合有明顯的促進(jìn)作用.

創(chuàng)面愈合中膠原的形成也非常重要,膠原由成纖維細(xì)胞分泌,參與組成肉芽組織,以覆蓋創(chuàng)面,促進(jìn)創(chuàng)面愈合.膠原蛋白的生成與成纖維細(xì)胞增殖呈正相關(guān).成纖維細(xì)胞在傷口4~5天開始通過有絲分裂增殖、分化,并合成和分泌大量的膠原纖維和基質(zhì)成分,與新生毛細(xì)血管、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞共同組成肉芽組織,填充組織缺損,覆蓋創(chuàng)面,為表皮細(xì)胞的生成創(chuàng)造條件[21].成纖維細(xì)胞合成的膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組分,膠原形成數(shù)量直接影響創(chuàng)面的修復(fù)質(zhì)量和愈合時間.在成纖維細(xì)胞分泌合成的膠原中,在皮膚組織中起主要作用的是I、Ⅲ型膠原,Ⅰ型膠原纖維位于真皮層,起支持作用,而Ⅲ型膠原呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)環(huán)繞在外周決定膠原纖維的彈性[22].而糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合過程中,成纖維細(xì)胞有絲分裂的S期數(shù)量及質(zhì)量明顯低于正常大鼠,成纖維細(xì)胞的DNA合成水平明顯下降,表明在皮膚組織高血糖狀態(tài)下成纖維細(xì)胞的增殖明顯放緩[23].這與本實驗B組大鼠檢測膠原蛋白免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)量明顯偏少是一致的.同時有研究也表明,VEGF對增生性瘢痕形成有促進(jìn)作用[24],VEGF及其受體在增生性瘢痕組織中表達(dá)活躍.岳毅剛等[25]利用血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體局部注射治療增生性瘢痕,結(jié)果顯示瘢痕體積明顯減少,組織內(nèi)血管數(shù)量減少,膠原纖維明顯減少,大劑量尤為明顯.這表明VEGF可以促進(jìn)創(chuàng)面膠原蛋白生成.

研究證實,視網(wǎng)膜mü ller細(xì)胞在高濃度的胰島素作用下能促進(jìn)的VEGF高表達(dá)[26],這說明胰島素可能抑制組織中HIF-1a的活性,促進(jìn)HIF-1在組織水平升高,從而刺激VEGF增高,促進(jìn)血管生成.胰島素外用于創(chuàng)面可調(diào)節(jié)創(chuàng)面周圍物質(zhì)代謝, Zhang等[27]用小劑量胰島素治療燙燒大鼠,運用同位素追蹤技術(shù)測量蛋白質(zhì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰島素治療組創(chuàng)面中蛋白質(zhì)的含量明顯高于對照組,且炎癥反應(yīng)輕,低血糖反應(yīng)發(fā)生率低,進(jìn)一步證實胰島素能加速創(chuàng)面愈合.本實驗也證實了這點,C組創(chuàng)面愈合率、愈合時間、MVD、Ⅰ型膠原蛋白等指標(biāo)均優(yōu)于于B組大鼠和A組大鼠.

本實驗設(shè)計采用空白凝膠、含胰島素凝膠、含VEGF165凝膠和含VEGF165-胰島素凝膠作為分組,以抵消卡波姆凝膠本身對創(chuàng)面愈合的影響.而卡波姆對活體細(xì)胞及組織無任何損害,以卡波姆凝膠作為VEGF165、胰島素的賦形劑,既方便了創(chuàng)面敷藥物的操作性,同時也保證了一定時間內(nèi)局部創(chuàng)面VEGF165、胰島素濃度的持續(xù)性和穩(wěn)定性.同時凝膠還可以為創(chuàng)面提供溫暖、濕潤的局部微環(huán)境,在一定程度上能夠保護(hù)創(chuàng)面及促進(jìn)愈合[28].卡波姆溶于水呈酸性,直接用于創(chuàng)面治療,酸性pH值對愈合影響巨大[29].人體生理條件下微環(huán)境pH值通常維持在7.35~7.45之間,微堿性,因此本實驗將實驗組及對照組凝膠的pH值設(shè)置接近人體.通過實驗,卡波姆凝膠應(yīng)用到燙傷創(chuàng)面能有效保護(hù)創(chuàng)面,防止感染,不對創(chuàng)面造成二次損傷,達(dá)到了本次實驗作為基質(zhì)運用的效果.

本實驗結(jié)果表明:保持一定穩(wěn)定濃度的VEGF165、胰島素外用對深I(lǐng)I度燙傷的糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合有顯著地促進(jìn)作用.創(chuàng)面外敷VEGF165-胰島素凝膠后,創(chuàng)面愈合時間明顯提前,創(chuàng)面愈合率比同期對照組高.早期膠原蛋白含量及毛細(xì)血管數(shù)量明顯增多,上皮化時間早,新生表皮厚度大于同期對照組.創(chuàng)面局部膠原蛋白、新生毛細(xì)血管的陽性數(shù)量表達(dá)遠(yuǎn)高于同期對照組.

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Impact VEGF165-insulin composite gel in diabetic rats localⅡdeep degree burn wounds expression of MVD and collagenⅠ

QI Wan-qiang1,XUE Xiao-dong2,RUAN Tao1,LIU Jin-ke1
(1.The First Clinical Medical College of Lanzhou University,Lanzhou 730000,Gansu,China; 2.Department of Plastic Surgery,Gansu Province People's Hospital,Lanzhou 730000,Gansu,China)

ObjectivePreparation of topical gel VEGF165-insulin complex and observe its deepⅡde-gree burn wound healing in diabetic rats role.MethodsCarbomer with new gel matrix,were added to VEGF165,insulin,insulin were formulated into a gel,VEGF165 gel,VEGF165-insulin composite gel and control gel.Gel characters of each group,the pH value of the detection.75 SPF male Wistar rats weighing 190~290g,were randomly divided into normal control group,diabetic control group,insulin gel group,VEGF165 gel group,VEGF165-insulin gel composite groups 15.Inaddition to the normal control group,the other groups of rats were fasted 12h after intraperitoneal injection of streptozotocin(55mg/kg)Preparation of type 1 diabetes model,normal control rats injected at the same dose fasting sodium citrate buffer fluid.Type 1 diabetes in rats after successful modeling,using heated water bath 80℃,the preparation of deepⅡdegree burn model.Normal control group,diabetic control group topical wound gel matrix blank,the rest of the group corresponding topical gel formulation,dressing once a day.DeepⅡdegree burns after a successful modeling survival of the rats was observed at 3,7,11,15,21d point of wound healing in diabetic rats and calculate the rate of wound healing in each group were sacrificed at each time point 3 rats take full thickness skin burns specimens were taken for histological sections and immunohistochemical staining of inflammatory cells at each time point,angiogenesis and collagen.Results Each group prepared a transparent gel,moisturizing excellent,good adhesion,easy painting and cleaning,no tissue toxicity.The rats without infection and death.3d no after burn wounds in each group was significantly reduced,7,11,15,21d when VEGF165-insulin compound gel group the highest rate of wound healing,diabetic group was the lowest,VEGF165-insulin compound gel group healing rate with the rest of the group,the difference were statistically significant(<0.05).Histopathological examination shows each time point VEGF165-insulin compound gel group granulation tissue formation and epithelialization were better than the rest of the group.Immunohistochemical staining showed that the number of microvessels in each group,Ⅰcollagen expression positive rates start at 3d,and the positive cells was significantly increased with time;each time point VEGF165-insulin highest composite gel group microvessel density and collagen typeⅠdiabetes lowest group,with other groups and VEGF165-insulin compound gel group,the difference was statistically significant(<0.05) between the diabetic group.ConclusionDiabetic rat skin deepⅡdegree burns topical gel VEGF165-insulin complex on wound healing have significant role in promoting

VEGF;insulin;carbomer gel;diabetic rats;wound healing

R587.1

A

1008-6455(2014)21-1799-07

2014-09-27

2014-11-13

編輯/張惠娟

薛曉東,男,教授,主任醫(yī)師,碩士研究生導(dǎo)師;擅長危重?zé)齻木戎?難愈性創(chuàng)面的治療和各種美容整形手術(shù).甘肅省人民醫(yī)院整形科,蘭州市城關(guān)區(qū)東崗西路204號,郵編:730000