許曉嘉 徐麗媛 郭志勇 潘麗麗 袁少雄 郝 變 呂劍波 李向日

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，100102）

中藥研究

HPLC法同時(shí)測(cè)定中藥菟絲子中五種黃酮類成分含量的研究

許曉嘉 徐麗媛 郭志勇 潘麗麗 袁少雄 郝 變 呂劍波 李向日

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，100102）

目的：建立中藥菟絲子中金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素的含量的高效液相色譜測(cè)定方法。方法：采用Agilent TC C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸，紫外檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，流速為1 mL/min，梯度洗脫：0→60min→80min，甲醇的比例由25%→40%→60%，柱溫45℃，測(cè)定中藥菟絲子中5種黃酮類成分的含量。結(jié)果：色譜峰分離情況良好，菟絲子中5種化學(xué)成分在各自的濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系；加樣回收率為98.0%～102.2%，RSD為1.44%～2.63%。結(jié)論：所建方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于菟絲子藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

HPLC；菟絲子；黃酮類成分

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australis R.Br.或菟絲子Cuscuta chinensis Lam.的干燥成熟種子[1]。中藥菟絲子是臨床上常用的補(bǔ)陽(yáng)藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并被列為上品，具有補(bǔ)肝腎、益精明目、安胎等功效，是中醫(yī)補(bǔ)腎壯陽(yáng)的要藥?，F(xiàn)代藥理研究表明黃酮類成分具有增強(qiáng)生殖系統(tǒng)作用[2-4]，提高心血管系統(tǒng)功能，提高免疫力、抗氧化[2-4]、抗衰老[2-4]、抗癌[2-4]、保肝明目等作用，黃酮類成分是菟絲子的主要有效成分。目前文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道菟絲子的黃酮類成分主要有金絲桃苷、紫云英苷、山柰酚、槲皮素、異鼠李素、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖（2-1）β-D-芹糖苷等，因此本研究選擇菟絲子和南方菟絲子中共有五種單體黃酮，即金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素（化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1）作為指標(biāo)性成分，建立其含量測(cè)定的方法。本文首次采用HPLC法對(duì)菟絲子中五種黃酮成分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

1 儀器、試劑與試藥

Waters液相色譜儀包括1525色譜泵，2489雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，Breeze工作站；金絲桃苷（111521-200303）、紫云英苷（MUST-09030603）、槲皮素（100081-200907）、山柰酚（110861-200808）、異鼠李素（110860-200608）、綠原酸（110753-200413），購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇色譜純、磷酸（分析純）、甲醇分析純、娃哈哈純凈水。

菟絲子（批號(hào)：090215為樣品1，100523為樣品2）產(chǎn)地為黑龍江，河北光明飲片有限公司飲片廠供應(yīng)；菟絲子（批號(hào)：110301為樣品3，090601為樣品4）產(chǎn)地內(nèi)蒙古，哈爾濱市盛泰中藥飲片加工廠提供。樣品1和3為南方菟絲子（Cuscuta australis R.Br.），樣品2和4為菟絲子（Cuscuta chinensis Lam.），其中混有少量南方菟絲子（Cuscuta australis R.Br.）。所有樣品均經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)楊瑤珺教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent TC C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸；紫外檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量15μL，柱溫45℃。梯度洗脫：0→60 min→80 min，甲醇的比例由25%→40%→60%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精確稱取金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素各1.00mg，甲醇定容于10 m L，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，色譜圖見(jiàn)圖2。

2.3 供試液的制備 精密稱取菟絲子過(guò)60目粉末1.00 g，精密加入50 mL 80%甲醇溶液，密塞稱重，回流提取2 h，冷卻后補(bǔ)重，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.4.1 金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取金絲桃苷10.20 mg，定容于20mL，分別精密吸取0.1mL、0.4 mL、4 mL、6 mL、8 m L的原液定容于10 mL。原液和各稀釋液分別進(jìn)樣25μL，以峰面積對(duì)質(zhì)量作回歸曲線方程，經(jīng)計(jì)算得y＝2 323 873x+173 893，r＝0.999 9。

2.4.2 紫云英苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取紫云英苷對(duì)照品9.96 mg，定容于20 mL，分別精密吸取0.125 mL、0.5 mL、1.25 mL、2.5 m L、3.75 mL、5 m L的原液定容于10 mL。各稀釋液分別進(jìn)樣20μL，以峰面積對(duì)質(zhì)量作回歸方程，經(jīng)計(jì)算得y＝2 802 318x-83 742，r＝0.999 9。

2.4.3 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取槲皮素對(duì)照品5.20 mg，定容于50 mL，分別精密吸取0.1 mL、0.6mL、5mL、10mL、15mL的原液定容于20 mL，原液和各稀釋液進(jìn)樣20μL，以峰面積對(duì)質(zhì)量作回歸方程，經(jīng)計(jì)算得y＝4 178 732x+12 709，r＝0.999 9。

2.4.4 山柰酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取山柰酚對(duì)照品5.10 mg，定容于50 mL，分別精密吸取0.1 mL、0.4 mL、5 mL、10 mL、15 m L的原液定容于20 mL，原液和各稀釋液進(jìn)樣20μL，以峰面積對(duì)質(zhì)量作回歸方程，經(jīng)計(jì)算得y＝4 477 936x-29 527，r＝0.999 9。

2.4.5 異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取異鼠李素對(duì)照品5.01 mg，定容于100 mL，分別精密吸取0.05 mL、0.2 mL、5 m L、10 m L、15 m L的原液定容于20 m L，原液和各稀釋液進(jìn)樣20μL，以峰面積對(duì)質(zhì)量作回歸方程，經(jīng)計(jì)算得y＝4 681 860x-28 099，r＝0.999 9。

2.5 精密度考察 按“2.1”項(xiàng)下方法，各對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣10μL，測(cè)得金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素的峰面積值，平行測(cè)定6份，其RSD分別為2.27%、2.22%、1.42%、1.72%和1.77%。

2.6 穩(wěn)定性考察 按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份。按照“2.1”項(xiàng)下液相條件，測(cè)定2、4、6、8、10、12、16、24 h內(nèi)測(cè)得金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素的峰面積值的峰面積。其RSD分別為3.05%、1.29%、2.57%、2.10%和1.03%。說(shuō)明：供試品溶液在放置24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.7 重復(fù)性考察 按照“2.3”項(xiàng)下方法同時(shí)制備6份供試品溶液。照“2.1”項(xiàng)下方法分別進(jìn)樣15μL，測(cè)得金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素的峰面積值的峰面積。其RSD分別為2.21%、2.21%、2.22%、2.21%和1.55%。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取菟絲子過(guò)60目粉末0.5 g，加入各對(duì)照品適量，按照“2.3”項(xiàng)下方法同時(shí)制備6份供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下液相條件進(jìn)樣15 μL，記錄峰面積，計(jì)算含量和回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率結(jié)果

圖1 化合物的結(jié)構(gòu)式

2.9 樣品的含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地不同批次的菟絲子藥材，按照供試品溶液的制備方法得到樣品溶液，按照液相條件測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖2，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 混合對(duì)照品和樣品的HPLC圖

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的選擇 本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中，采用LC-ESI-MSn方法，結(jié)合對(duì)照品，比較相對(duì)保留時(shí)間和特征碎片，對(duì)菟絲子中的成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)定性[12]，在定性過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，紫云英苷和槲皮苷結(jié)構(gòu)式相近（見(jiàn)圖1），紫云英苷的分子量和槲皮苷的分子量一樣，均為448，且二者的出峰時(shí)間一樣，但是在碎片離子中并未發(fā)現(xiàn)m/z303，而是m/z287，因此確定菟絲子中含有紫云英苷，不含槲皮苷。而以往有文獻(xiàn)把紫云英苷誤認(rèn)為槲皮苷進(jìn)行測(cè)定是不正確的。因此本實(shí)驗(yàn)選擇金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素為指標(biāo)性成分，同時(shí)使用金絲桃苷和紫云英苷同時(shí)作為指標(biāo)性成分。

3.2 提取方法的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)中考察了超聲提取和加熱回流兩種方法對(duì)菟絲子中5種黃酮類成分含量的影響，發(fā)現(xiàn)加熱回流對(duì)異鼠李素的提取效率明顯優(yōu)于超聲提??；同時(shí)對(duì)溶劑濃度（100%、80%）和加熱回流時(shí)間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）進(jìn)行了考察。最終確定80%甲醇50 mL，加熱回流2 h提取效果最好。

3.3 樣品含量測(cè)定結(jié)果比較 從樣品的含量測(cè)定結(jié)果可以看出中藥菟絲子中黃酮苷的含量要大于苷元的含量，而菟絲子中以金絲桃苷含量最高，南方菟絲子中以紫云英苷的含量最高；目前的文獻(xiàn)報(bào)道[13-16]，紫云英苷具有良好的藥理活性，同時(shí)菟絲子中紫云英苷含量也比較高，而現(xiàn)行的藥典中對(duì)菟絲子含量測(cè)定中僅規(guī)定了金絲桃苷的含量不得少于0.10%，有待繼續(xù)完善和提高。

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（2013-08-26收稿 責(zé)任編輯：王明）

Study on Simultaneous Determination of Five Kinds of Flavonoids in Seed of Semen Cuscutae by HPLC

Xu Xiaojia，Xu Liyuan，Guo Zhiyong，Pan Lili，Yuan Shaoxiong，Hao Bian，LV Jianbo，Li Xiangri
（School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective：To determine the content of five kinds of flavonoids in the seed of semen cuscutae，including hyperoside，astragalin，quercetin，kaempferol and isorhamnetin.Methods：The HPLCmethod was used to determine the contentof flavonoids in the seeds of semen cuscutae.The analysis was carried out on Agilent TC C18 column（250 mm×4.6 mm，5μm），with MeOH-0.4% H3PO4asmobile phase，the flow rate of1mL·min-1and wave length at360 nm.The gradientelute time was0→60min→80min，and the proportion ofmethanol was 25%→40%→60%.at45℃.Results：Chromatographic peak separation was in good condition，and five kinds of flavonoids had good linear relationship respectively within their own scope of concentration；the recovery was 98.0%～98. 0%，RSD was 1.44%～2.63%.Conclusion：The established method is simple，accurate，and reproducible and can be used as the quality evaluation of semen cuscutae.

HPLC；Semen cuscutae；Flavonoids

R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.04.029

國(guó)家自然基金項(xiàng)目（編號(hào)：81274081）

李向日（1972.11—），女，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)橹兴幣谥婆c質(zhì)量控制研究，Tel：（010）84738616，E-mail：lixiangri＠sina.com