何麗娟 馬桂云 郭金芝 劉文波 任曉明

（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司,石家莊050035）

夏荔芪膠囊微生物限度檢查方法研究

何麗娟 馬桂云 郭金芝 劉文波 任曉明

（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司,石家莊050035）

目的 為了消除夏荔芪膠囊在微生物限度檢查中藥用成分的抑菌作用,建立其適宜的微生物限度檢查方法。方法 本試驗采用平皿法和培養(yǎng)基稀釋法對該品種進行微生物限度檢查方法驗證,通過三次獨立平行試驗,各試驗菌的回收率均可達到70%以上。結論 采用平皿法、培養(yǎng)基稀釋法聯(lián)用檢查細菌數,霉菌及酵母菌數,可客觀地反映該藥物中微生物的污染狀況,且可操作性強。

夏荔芪膠囊;微生物限度檢查;平皿法;培養(yǎng)基稀釋法;回收率

夏荔芪膠囊是我公司自主研發(fā)的國家中藥六類新藥。新藥“夏荔芪膠囊”針對良性前列腺增生的主要病證,以健脾益腎,利水散結為治療原則,結合多年臨床用藥經驗研制而成,為良性前列腺增生癥患者提供了一種療效確切、服用安全的中藥新制劑,為更多患者解除病痛。夏荔芪膠囊處方中有多味中藥材含有抑菌成分,抑制了藥品中污染微生物的生長,這就給藥品質量檢驗環(huán)節(jié)造成了安全隱患,因此為了準確而有效的保障藥品質量,我們根據《中國藥典》2010年版[1］的要求對夏荔芪膠囊進行了微生物限度檢驗方法驗證,以期獲得更具科學性和準確性的微生物限度檢查方法,從而保證檢驗結果的準確性。

1 藥物與試劑

1.1 樣品 夏荔芪膠囊,規(guī)格：0.45g/粒;批號：110201-1,110201-2,110201-3;生產廠家：石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司。

1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號：20120702）;改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號：121106）;玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：20111209）;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號：120610）;改良馬丁培養(yǎng)基（批號：120417）;來源：中國藥品生物制品檢定所。

1.3 菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003］;枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501］;大腸埃希菌[CM-CC（B）44102］;白色念珠菌[CMCC（F）98001］;黑曲霉[CMCC（F）98003］,來源：中國藥品生物制品檢定所[2］。

1.4 儀器 生化培養(yǎng)箱：LRH-250F上海一恒儀器有限公司;生物安全柜：FHC-1200A美國Frontline。

2 菌液及供試品的制備

2.1 菌懸液的制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,培養(yǎng)18～24h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上,培養(yǎng)24～48h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數為50～100cfu的菌懸液。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上,培養(yǎng)5～7d,加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。然后,采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內,用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數50～100cfu的孢子懸液[2］。

2.2 供試品制備 稱取樣品10g,加p H7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml制成1∶10的供試液。

3 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證

3.1 菌液組 取1ml上述制備的菌液,注入平皿中,立即傾倒瓊脂培養(yǎng)基,每株試驗菌平行制備3個平皿。結果見表1。

3.2 試驗組

3.2.1 平皿法 取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml和50～100cfu試驗菌,分別注入平皿中,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,每株試驗菌平行制備2個平皿,按平皿法測定其菌數。結果見表2。

3.2.2 培養(yǎng)基稀釋法 取1∶10供試液2ml,每1ml供試液等量分注2個平皿,每4個平皿為一組。取上述制備好的陽性對照菌液1ml,分組注入平皿中,傾注瓊脂培養(yǎng)基,混勻,凝固后,倒置培養(yǎng)。按平皿法測定其菌數,計算回收率,結果見表3。

4 結果與分析

表1 菌液組計數

由表1可知：五株試驗菌適宜稀釋度菌懸液菌落個數都在50～100cfu之間,因此符合微生物限度檢查方法驗證用菌種稀釋度要求。

表2 微生物限度檢查法(平皿法)污染菌回收率（%）

從表2可以看出：通過三次獨立平行試驗,計數結果顯示[2］,只有金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率在70%以下,而大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率均大于70%,因此可確定大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉可采用平皿法進行微生物限度檢查,而金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌應進一步進行微生物限度檢查方法驗證。

表3 微生物限度檢查法培養(yǎng)基稀釋法(0.2ml/皿)回收率（%）

從表3可以看出：采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率已在70%以上,因此可確定金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌可以采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）進行微生物限度檢查。

5 討論

通過方法驗證可知：細菌、霉菌及酵母菌限度檢查可采用平皿法聯(lián)合培養(yǎng)基稀釋法（細菌0.2ml/皿,霉菌1ml/皿）進行檢查。

中藥制劑質量標準檢查項目內容之一的微生物限度檢查是保障藥品使用安全的重要工作,日益受到重視[3］。本試驗采用平皿法聯(lián)合培養(yǎng)基稀釋法,解決了夏荔芪膠囊中抑菌成分對微生物檢驗的干擾問題,該法操作簡單,能科學、準確、有效地反映夏荔芪膠囊藥品中污染存活的微生物菌落數。

[1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S］.2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010,附錄XIJ,附錄107-113.

[2］許華玉,杜蕓,錢文靜,等.藥品微生物限度檢查法中細菌和真菌計數方法的驗證實驗[J］.中國中藥雜志,2005,30（24）：1918-1920.

[3］陶紅.中藥制劑微生物限度檢查方法研究進展[J］.中國藥房,2010,（19）：1813-1814.

Research on Microbial Limit Test for Xialiqi Capsule

He Lijuan Ma Guiyun Guo Jinzhi Liu Wenbo Ren Xiaoming
(Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co.,Ltd.,Shijiazhuang,Hebei Province,050035,China)

Objective To develop an appropriate protocol to remove the antimicrobial activity of Xialiqi Capsule and establish a suitable method for the microbial enumeration testing.Methods A combination of the plating procedure and media dilution method was used to do the validation.In the three independent parallel tests,the mean counts of each of the test organisms were all not less than 70%.Conclusion The combination of the plating procedure and media dilution method was verified to be an appropriate method for microbial enumeration testing.The validated method is easily operational,and can reflect the microbial contamination condition objectively.

Xialiqi Capsule;Microbial limit test;Plating procedure;Media dilution method;Recovery rate

10.3969/j.issn.1672-2779.2014.01.098

1672-2779（2014）-01-0154-02

??吳義紅 本文校對：馬 英

2013-11-11）