黃怡然 張 茜 李文迅 董摩揚(yáng) 李 娜 丁婷婷 路問(wèn)天 嚴(yán) 安 郭長(zhǎng)青

（北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京，100029）

針刺對(duì)骨骼肌急性鈍挫傷模型形態(tài)學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)觀察

黃怡然 張 茜 李文迅 董摩揚(yáng) 李 娜 丁婷婷 路問(wèn)天 嚴(yán) 安 郭長(zhǎng)青

（北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京，100029）

目的：觀察針灸針斜刺阿是穴對(duì)家兔腓腸肌急性鈍挫傷修復(fù)的形態(tài)學(xué)影響。方法：采用定量負(fù)荷自由落體復(fù)制肌肉急性閉合性鈍挫傷的方法對(duì)模型家兔右后肢腓腸肌進(jìn)行造模，分別于造模后即刻、造模后24 h、造模后48 h測(cè)量腓腸肌腫脹度，肌肉硬度，于造模后48 h取材，并檢測(cè)血清中肌酸激酶、乳酸脫氫酶含量，并通過(guò)HE染色光鏡和透射電鏡觀察家兔腓腸肌形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果：造模后48 h各組家兔血清肌酸激酶（CK）含量比較，與正常組相比，模型組、針刺組、CsA模型組、CsA針刺組均顯著身高（P＜0.05），與模型組相比，CsA模型組顯著升高（P＜0.05）；造模后48 h各組家兔乳酸脫氫酶（LDH）含量，與空白組比較，模型組和CsA模型組顯著升高（P＜0.05），與模型組相比，針刺組和CsA針刺組顯著降低（P＜0.05）；HE染色光鏡下，模型組及各干預(yù)組可見(jiàn)不同程度的肌纖維損害；透射電鏡下模型組及各干預(yù)組可見(jiàn)不同程度的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)中的造模方法可以成功復(fù)制腓腸肌急性閉合性鈍挫傷模型，針灸針斜刺阿是穴可有效地促進(jìn)腓腸肌急性鈍挫傷修復(fù)，環(huán)孢素干預(yù)一定程度降低了針刺的修復(fù)作用。

針刺；骨骼??；形態(tài)學(xué)

骨骼肌的損傷在生活及運(yùn)動(dòng)中非常常見(jiàn)，包括多種原因?qū)е碌募毙該p傷、疲勞性損傷以及廢用性肌肉萎縮[1]，其發(fā)生率從10%～55%不等[2]。骨骼肌的損傷和再生是一個(gè)連續(xù)病理過(guò)程中的不同階段[3-5]，包括骨骼肌的變性壞死和肌纖維結(jié)構(gòu)破壞、炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)（主要是巨噬細(xì)胞）吞噬壞死細(xì)胞成分、衛(wèi)星細(xì)胞的激活、分裂增殖形成新的肌管細(xì)胞進(jìn)而發(fā)育成肌纖維、再生肌纖維的分化成熟和肌肉功能恢復(fù)等過(guò)程。中醫(yī)治療肌肉損傷歷史悠久，針刺治療效果佳，具有療效高，見(jiàn)效快，療程短，費(fèi)用低，簡(jiǎn)便易行等顯著優(yōu)點(diǎn)。但針刺治療骨骼肌肌損傷的機(jī)制尚不明確，有待研究。骨骼肌應(yīng)對(duì)環(huán)境刺激的重塑是肌纖維在生理、生化、形態(tài)、功能等各方面的協(xié)調(diào)適應(yīng)，這一過(guò)程可能涉及細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活以及多個(gè)基因的程序化表達(dá)，最終引起肌肉體積、質(zhì)量、代謝狀態(tài)與工作能力的適應(yīng)性變化。對(duì)骨骼肌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及骨骼肌重塑的細(xì)胞分子機(jī)制研究中，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）信號(hào)在骨骼肌重塑中的作用近幾年備受關(guān)注。研究者通過(guò)環(huán)孢素A抑制大鼠CaN活性來(lái)研究CaN/NFAT信號(hào)通路[6]。有研究表明抑制CaN[抑制劑：環(huán)孢霉素A（CsA）]顯著減少大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維的生長(zhǎng)[7]。CaN/NFAT通路能促進(jìn)I型肌表型和刺激肌肉生長(zhǎng)，然而，機(jī)械刺激通過(guò)神經(jīng)鈣蛋白信號(hào)促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)，是否反映肌肉對(duì)機(jī)械刺激的直接應(yīng)答仍然不清楚[8-11]。本實(shí)驗(yàn)試圖通過(guò)觀察針灸針斜刺阿是穴干預(yù)腓腸肌急性鈍挫傷家兔，研究針灸針斜刺對(duì)家兔腓腸肌急性鈍挫傷修復(fù)的形態(tài)學(xué)影響，探究針斜刺治療骨骼肌損傷的機(jī)制，進(jìn)一步揭示損傷的骨骼肌組織結(jié)構(gòu)是如何恢復(fù)正常的，從而為臨床治療肌肉損傷提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)6月齡新西蘭兔30只，雌性，體重（2.25±0.1）kg，由北京金牧陽(yáng)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（京）2013-0022。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵守國(guó)家科技部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。正常環(huán)境下單籠常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)房間為每12 h光暗循環(huán)，溫度控制在24℃，濕度60%。自由進(jìn)食與飲水。

1.2 動(dòng)物分組及處理方法 將30只新西蘭兔隨機(jī)分為5組，每組各6只，分別為空白組、模型組、針刺組、CsA模型組和CsA針刺組。

1.2.1 空白組（N） 正常飼養(yǎng)。

1.2.2 模型組（M） 造模后正常飼養(yǎng)。

1.2.3 針刺組（Z） 于造模成功后24 h進(jìn)行腓腸肌斜刺治療，常規(guī)備皮、消毒，然后腓腸肌移行為跟腱的部位進(jìn)針，直刺過(guò)皮后，將毫針調(diào)整角度至與腓腸肌成30度角，斜刺穿過(guò)腓腸肌肌束，出針并按壓片刻止血。不留針，治療1次。

1.2.4 CsA模型組（CsAM） 于造模前3 d注射開(kāi)始注射CsA，按每只兔9.25 mg/（kg·d）（諾華制藥25 mg）劑量分2次行腹腔注射，直至取材（于造模成功后48 h以空氣栓塞法處死各組兔進(jìn)行取材）。

1.2.5 CsA針刺組（CsAZ） CsA注射同CsA模型組；針刺治療同針刺組。

1.3 儀器與試劑 4%多聚甲醛，100%乙醇，石蠟，二甲苯等試劑均采購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。CK、LDH試劑盒由北京中杉生物工程高技術(shù)公司提供。毫針：環(huán)球牌不銹鋼針灸針，直徑0.40 mm，長(zhǎng)40 mm，蘇州環(huán)球針灸醫(yī)療器械有限公司制。

1.4 模型制備 25%烏拉坦4 mL/kg耳緣靜脈麻醉，俯臥位固定在解剖臺(tái)上，右后肢褪毛，右后肢于伸膝、踝背屈約90度位固定，顯示腓腸肌。選定腓腸肌肌腹中段做為打擊中心（距跟骨6.5 cm處），將固定導(dǎo)管（直徑2.2 cm）置于小腿腓腸肌上方，壓緊，以防目標(biāo)肌群發(fā)生位移，500 g鐵棒（直徑1.5 cm）從固定導(dǎo)管內(nèi)30 cm標(biāo)記處自由下落，動(dòng)能為1.47 J，導(dǎo)致一次肌肉挫傷，同一部位連續(xù)打擊20次，造成家兔腓腸肌鈍性損傷，不作任何處理，正常環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)，形成急性腓腸肌鈍挫傷動(dòng)物模型。

判定模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：1）肉眼觀察可見(jiàn)砸傷部位皮膚完整，局部腫脹、皮膚青紫、瘀血。2）砸傷后動(dòng)物活動(dòng)減少，傷肢屈曲，行走不利。3）解剖病理觀察：局部解剖可見(jiàn)損傷范圍涉及整個(gè)腓腸肌，表現(xiàn)為腫脹充血，并波及周邊其他肌肉組織，但沒(méi)有骨折；HE染色光鏡下顯示，部分的肌纖維斷裂、肌細(xì)胞的變性壞死和大量的炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.5 行為學(xué)觀測(cè) 各組動(dòng)物分別于造模后即刻、造模后24 h、造模后48 h測(cè)試行為學(xué)。行為學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)為觀察造模前后動(dòng)物的雙側(cè)后肢腫脹程度（距跟骨6.5 cm處測(cè)量周徑），骨骼?。ň喔?.5 cm處）硬度。

1.5.1 腫脹 腫脹程度用測(cè)量法，測(cè)試儀器采用皮尺，測(cè)試時(shí)，兔采取側(cè)臥、膝踝關(guān)節(jié)屈曲90度放松位，實(shí)驗(yàn)側(cè)在上，在距跟骨6.5 cm處測(cè)量周徑，同時(shí)測(cè)量健側(cè)對(duì)稱部位。

1.5.2 硬度 測(cè)試儀器采用國(guó)家體委科研研制的皮脂計(jì)。測(cè)試時(shí)，兔采取側(cè)臥、膝踝關(guān)節(jié)屈曲90度放松位，實(shí)驗(yàn)側(cè)在上。測(cè)試部位：距跟骨6.5 cm處的肌肉硬度。

1.6 生化檢測(cè) 所有動(dòng)物均于取材前從耳緣靜脈采血3 mL，然后放于離心機(jī)中1 000 r/min，離心10 min，將上層淡黃色血清移于小離心管保存在-20℃度冰箱中。利用E COM-F 6124型半自動(dòng)生化分析儀對(duì)CK、LDH活性進(jìn)行測(cè)定：1 mL工作液+20μL血清，延遲1 min后，測(cè)定其1 min內(nèi)吸光度的變化（CK）；500 μL工作液+20μL血清，延遲30 s后，測(cè)定其1 min內(nèi)吸光度的變化（LDH）。

1.7 取材與形態(tài)學(xué)觀察 于造模成功后48 h以空氣栓塞法處死各組兔進(jìn)行取材。

1.7.1 光鏡標(biāo)本制作 于腓腸肌肌腹中段取5 mm× 5 mm×8 mm方塊，切取兩塊3 cm×3 cm×4 cm大小的新鮮骨骼肌，標(biāo)本均放入10%甲醛溶液中固定3 d，梯度脫水、浸蠟、包埋處理，分別將兩塊標(biāo)本縱向和橫向包埋，以5μm厚度連續(xù)切片，HE和甲苯胺藍(lán)染色后光鏡下觀察，觀察肌細(xì)胞的形態(tài)、肌纖維斷裂情況和異常細(xì)胞數(shù)量。

1.7.2 電鏡標(biāo)本制作 剩余標(biāo)本切成1 cm×1 cm×2 cm大小，經(jīng)戊二醛固定1周，2.5%的戊二醛固定液4℃固定2 h，之后電鏡常規(guī)制樣操作，在透射電鏡下觀察肌纖維超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.8 數(shù)據(jù)分析方法 運(yùn)用SPSS 18.0軟件，進(jìn)行單因素ANOVA分析、秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀測(cè)結(jié)果

2.1.1 腫脹 測(cè)量結(jié)果顯示，造模后即刻各組右后肢均無(wú)明顯腫脹（P＞0.05）；造模后24 h，與空白組比較，其他四組的右后肢腫脹程度均有明顯增大（P＜0.01），說(shuō)明造模成功，與模型組相比，針刺組和CsA模型組腫脹度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；造模后48 h，與正常組相比，其他四組腫脹差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），模型組比較，CsA模型組腫脹明顯降低（P＜0.05），針刺組和CsA針刺組的腫脹程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與CsA模型組比較，針刺組和CsA針刺組的腫脹程度較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明CsA阻斷的CaN/NFAT通路可能是損傷肌肉進(jìn)行修復(fù)的重要通道。詳見(jiàn)表1。

表1 各組腫脹程度比較（±s，n＝6）

表1 各組腫脹程度比較（±s，n＝6）

注：*均值差的顯著性水平為0.05，與空白組組比較（P＜0.05）；**均值差的顯著性水平為0.01，與空白組組比較（P＜0.01）；△均值差的顯著性水平為0.05，與模型組組比較（P＜0.05）；▲均值差的顯著性水平為0.05，與CsA模型組比較（P＜0.05）。

0.067±0.082 0.100±0.110 0.083±0.075模型組0.067±0.082 1.933±1.093**1.967±0.662**針刺組0.067±0.082 1.450±0.789**△1.817±0.574**▲CsA模型組0.063±0.121 1.400±0.482**△1.233±0.273**△CsA針刺組0.083±0.076 2.133±0.698**2.017±1.092 48 h空白組組別造模后即刻造模后24 h造模后**▲

2.1.2 硬度 測(cè)量結(jié)果顯示，造模后即刻，與空白組比較，其他四組右后肢腓腸肌硬度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明造模成功，且造模各組損傷程度相當(dāng)；造模成功后24 h，與正常組相比，其他四組腓腸肌硬度極顯著升高（P＜0.01），與模型組比較，針刺組、CsA模型組、CsA針刺組的腓腸肌硬度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與CsA模型組比較，針刺組、CsA針刺組的腓腸肌硬度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與針刺組比較，CsA針刺組的腓腸肌硬度差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模成功后48 h，與空白組比較，其他四組腓腸肌硬度升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與模型組相比，針刺組和CsA模型組組的腓腸肌硬度明顯下降（P＜0.05），與CsA模型組相比，模型組、針刺組和CsA針刺組腓腸肌硬度升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 各組腓腸肌硬度比較（±s，n＝6）

表2 各組腓腸肌硬度比較（±s，n＝6）

注：*均值差的顯著性水平為0.05，與空白組組比較（P＜0.05）；**均值差的顯著性水平為0.01，與空白組組比較（P＜0.01）；△均值差的顯著性水平為0.05，與模型組比較（P＜0.05）；▲均值差的顯著性水平為0.05，與CsA模型組比較（P＜0.05）。

0.333±0.408 0.417±0.204 0.583±2.124模型組6.583±0.917**6.667±2.443**4.583±1.281**▲針刺組6.417±2.710**5.417±3.169**3.333±2.160**△▲CsA模型組5.500±2.214**5.417±2.311**2.333±2.090**△CsA針刺組6.000±2.259**6.000±2.280**6.833±3.125 48 h空白組組別造模后即刻造模后24 h造模后**▲

2.2 生化檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 血清肌酸激酶（CK） 檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組，其他四組CK值顯著升高（P＜0.05），四組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與模型組比較，CsA模型組顯著升高（P＜0.05）；與CsA模型組組相比，模型組、針刺組和CsA針刺組均顯著降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

2.2.2 乳酸脫氫酶（LDH） 檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組和CsA模型組顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組和CsA針刺組顯著降低（P＜0.05）；與CsA模型組比較，針刺組和CsA針刺組顯著降低（P＜0.05），針刺組和CsA針刺組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表3

表3 各組CK值和LDH值比較（±s，U/L，n＝6）

表3 各組CK值和LDH值比較（±s，U/L，n＝6）

注：均值差的顯著性水平為0.05，*與空白組組比較（P＜0.05）；△與模型組比較（P＜0.05）；▲與CsA模型組比較（P＜0.05）。

組別CK值LDH值1645.162±424.121 253.262±39.419模型組2457.807±299.297*▲425.572±58.857*針刺組2566.788±827.591*▲251.132±137.429△▲CsA模型組3214.048±920.845*△402.730±83.753*CsA針刺組2143.183±201.294*▲235.758±76.208空白組△▲

2.3 光鏡結(jié)果

2.3.1 空白組（N） 圖1，A、B、C為空白組肌纖維橫切面分別放大40倍、100倍和400倍，鏡下可見(jiàn)：肌纖維橫切面呈多邊形，大小均等，肌原纖維之間的肌漿呈粉紅色，核呈圓形或橢圓形位于邊緣；D、E、F為空白組肌纖維橫切面分別放大40倍、100倍和400倍，鏡下可見(jiàn)：肌纖維縱切面肌細(xì)胞呈長(zhǎng)條狀，相互平行排列，肌纖維之間有少量成纖維細(xì)胞核，每條肌纖維有許多扁橢圓形的核，位于肌纖維的周邊。

2.3.2 模型組（M） 圖2，A、B、C為模型組肌纖維橫切面分別放大40倍、100倍和400倍，鏡下可見(jiàn)：肌纖維橫切面邊界模糊，大小不一，部分肌纖維損傷處肌漿外漏，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且以彌散性炎性細(xì)胞增多為主，毛細(xì)血管增生明顯；D、E、F為模型組肌纖維橫切面分別放大40倍、100倍和400倍，鏡下可見(jiàn)：大量肌纖維萎縮，少量肌纖維溶解，肌細(xì)胞間質(zhì)水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌細(xì)胞核增多。

圖1 光鏡下空白組肌纖維橫切及縱切HE染色

圖2 光鏡下模型組肌纖維橫切及縱切HE染色

2.3.3 針刺組（Z） 圖3，A、B、C為針刺組肌纖維橫切面分別放大40倍、100倍和400倍，鏡下可見(jiàn)：肌纖維橫切面為不規(guī)整多邊形，大小較均等，排列較整齊，部分肌細(xì)胞水腫，間隙較空白組減小，損傷局部大量紅細(xì)胞聚集；D、E、F為針刺組肌纖維橫切面分別放大40倍、100倍和400倍，鏡下可見(jiàn)：損傷局部部分肌纖維腫脹，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且較模型組損傷局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)更明顯，炎性反應(yīng)集中于肌纖維損傷處且表現(xiàn)為從外向里滲透。

圖3 光鏡下針刺組肌纖維橫切及縱切HE染色

2.3.4 CsA模型組（CsAM） 圖4，A、B、C為CsA模型組肌纖維橫切面分別放大40倍、100倍和400倍，鏡下可見(jiàn)：肌纖維橫切面為不規(guī)整多邊形，部分肌纖維邊界模糊甚至溶解，肌漿外漏，肌纖維腫脹程度較CsA模型組減輕，肌細(xì)胞間隙明顯減小，出現(xiàn)少量空泡（因正常血液循環(huán)被破壞，使肌纖維缺乏營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)而壞死、萎縮所致）；D、E、F為CsA模型組肌纖維橫切面分別放大40倍、100倍和400倍，鏡下可見(jiàn)：肌纖維腫脹，損傷處出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有大量紅細(xì)胞聚集。

2.3.5 CsA針刺組（CsAZ） 圖5，A、B、C為CsA針刺組肌纖維橫切面分別放大40倍、100倍和400倍，鏡下可見(jiàn)：肌纖維橫切面為不規(guī)整多邊形，大小較均等，可見(jiàn)肌纖維腫脹明顯，肌細(xì)胞間隙明顯減小，肌細(xì)胞核增多，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；D、E、F為CsA針刺組肌纖維橫切面分別放大40倍、100倍和400倍，鏡下可見(jiàn)：可見(jiàn)部分肌纖維溶解，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。

圖4 光鏡下CsA模型組肌纖維橫切及縱切HE染色

圖5 光鏡下CsA針刺組肌纖維橫切及縱切HE染色

2.4 電鏡結(jié)果

2.4.1 空白組（N） 圖6，透射電鏡下A圖放大8 000倍，顯示肌節(jié)；B圖放大12 000倍，顯示肌節(jié)、線粒體；C圖放大25 000倍，顯示線粒體、肌纖維、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，鏡下可見(jiàn)：空白組肌節(jié)、肌絲排列整齊，肌節(jié)完整，肌原纖維中Z線、M線清晰。

圖6 透射電鏡下空白組骨骼肌超微結(jié)構(gòu)（縱切）

2.4.2 模型組（M） 圖7，透射電鏡下A圖放大8 000倍，顯示肌節(jié)；B圖放大12 000倍，顯示肌節(jié)、線粒體；C圖放大25 000倍，顯示線粒體、肌纖維、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，鏡下可見(jiàn)：模型組肌原纖維溶解消失，無(wú)法區(qū)分A、I帶，Z線、M線溶解。

圖7 透射電鏡下模型組骨骼肌超微結(jié)構(gòu)（縱切）

2.4.3 針刺組（Z） 圖8，透射電鏡下A圖放大8 000倍，顯示肌節(jié)；B圖放大12 000倍，顯示肌節(jié)、線粒體；C圖放大25 000倍，顯示線粒體、肌纖維、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，鏡下可見(jiàn)：針刺組肌原纖維形態(tài)正常，肌絲總體排列整齊，肌節(jié)未見(jiàn)腫脹，Z線、M線清晰，部分損傷局部Z線、M線略有位移，線粒體數(shù)量少。

圖8 透射電鏡下針刺組骨骼肌超微結(jié)構(gòu)（縱切）

2.4.4 CsA模型組（CsAM） 圖9，透射電鏡下A圖放大8 000倍，顯示肌節(jié)；B圖放大12 000倍，顯示肌節(jié)、線粒體；C圖放大25 000倍，顯示線粒體、肌纖維、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，鏡下可見(jiàn)：CsA模型組肌節(jié)腫脹明顯，肌絲紊亂，結(jié)構(gòu)不清，大量肌原纖維斷裂、溶解，Z線、M線溶解消失。

圖9 透射電鏡下CsA模型組骨骼肌超微結(jié)構(gòu)（縱切）

2.4.5 CsA針刺組（CsAZ） 圖10，透射電鏡下A圖放大8 000倍，顯示肌節(jié)；B圖放大12 000倍，顯示肌節(jié)、線粒體；C圖放大25 000倍，顯示線粒體、肌纖維、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，鏡下可見(jiàn)：CsA針刺組肌節(jié)明顯腫脹，部分Z線、M線斷裂溶解，部分肌原纖維扭曲、斷裂，損傷局部有結(jié)締組織增生，可見(jiàn)大量聚集的線粒體，且部分線粒體明顯水腫，嵴開(kāi)始融解，出現(xiàn)空泡化。

圖10 透射電鏡下CsA針刺組骨骼肌超微結(jié)構(gòu)（縱切）

3 分析及討論

骨骼肌損傷屬于中醫(yī)的＂經(jīng)筋?。⒌姆懂牐端貑?wèn)·調(diào)經(jīng)論》中指出“病在筋，調(diào)之筋”，指出治療經(jīng)筋病宜以調(diào)筋為主；《靈樞經(jīng)·官針第七》指出：“病痹氣痛而不去者，取以毫針?！薄熬旁桓〈?，傍入而浮之，以治肌急而寒者也?！痹谶m應(yīng)五臟的五種刺法中又指出：“四曰合谷刺，合谷刺者，左右雞足，針于分肉之間，以取肌痹?！薄鹅`樞經(jīng)·經(jīng)筋第十三》論述筋病的治療原則時(shí)說(shuō)：“治在燔針劫刺，以知為數(shù)，以痛為腧”?！鹅`樞·官針》云：“傍針刺者，直刺、傍刺各一，以治留痹久居者也”。《內(nèi)經(jīng)·十二刺》云：“恢刺者，直刺傍之，舉之前后，恢筋急，以治筋痹也”。這些論述指出了肌病、筋病等疼痛日久的痹癥，應(yīng)選用毫針，取阿是穴，采用斜刺的針?lè)ㄖ委?。盧鼎厚等[12-16]借鑒了中醫(yī)療法，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，斜刺阿是穴治療肌肉損傷是通過(guò)加強(qiáng)收縮蛋白的組裝、合成，促進(jìn)收縮結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)而達(dá)到治療目的的，且其效果主要不是通過(guò)神經(jīng)和經(jīng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，而是通過(guò)肌肉本身所固有的外周機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。故本實(shí)驗(yàn)選取針灸針斜刺阿是穴治療骨骼肌鈍挫傷家兔模型，并且選擇在造模成功后24 h開(kāi)始進(jìn)行針刺治療。

對(duì)骨骼肌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及骨骼肌重塑的細(xì)胞分子機(jī)制研究中，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）信號(hào)在骨骼肌重塑中的作用近幾年備受關(guān)注。IGF-Ⅰ使肌纖維細(xì)胞膜上的Ca2+通道活性提高，導(dǎo)致細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+增加。胞質(zhì)中的Ca2+與鈣調(diào)節(jié)蛋白（CaM）結(jié)合激活CaN，具有活性的CaN對(duì)激活T細(xì)胞核因子（Nuclear Factor of Activated T Cells，NFAT）去磷酸化，將活化T細(xì)胞核因子易位到細(xì)胞核并且導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄[17]。CaN是蛋白磷酸脂酶，在肌肉肥大中起著重要的作用，是骨骼肌纖維重構(gòu)的重要信號(hào)因子[18-21]，CaN/NFAT信號(hào)激活能促進(jìn)肌纖維的融合和分化。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入研究就可探討CaN/NFAT通路是否為針刺促進(jìn)損傷骨骼肌修復(fù)的重要通路。

行為學(xué)觀察結(jié)果顯示急性鈍挫傷造模成功，各組家兔右后肢腓腸肌腫脹程度對(duì)比顯示，針刺組較CsA組、CsA針刺組骨骼肌較明顯修復(fù)，而腓腸肌硬度的指標(biāo)作為檢測(cè)指標(biāo)，在造模后48 h，模型組出現(xiàn)自然恢復(fù)，而較模型組相比針刺組、CsA模型組的肌肉硬度顯著降低，說(shuō)明針刺和環(huán)孢素均可在一定時(shí)間內(nèi)降低損傷肌肉硬度，促進(jìn)其向正常組織硬度恢復(fù)。造模后48 h各組家兔血清肌酸激酶（CK）含量較正常顯著增加，與模型組相比，針刺組、CsA針刺組無(wú)顯著差異，CsA模型組顯著升高，說(shuō)明急性鈍挫傷造模及針刺刺激均使模型兔的CK值升高，且CsA模型組損傷程度最高，急性鈍挫傷造模及環(huán)孢素均可導(dǎo)致肌損傷，其損傷作用可因損傷條件疊加出現(xiàn)累積效應(yīng)。乳酸脫氫酶（LDH）含量，與空白組比較，模型組和CsA模型組均顯著升高，與模型組比較，針刺組和CsA針刺組均顯著降低，說(shuō)明急性鈍挫傷造模及環(huán)孢素均使模型兔血清中乳酸脫氫酶含量升高，而針刺能有效改善肌損傷模型兔血清中乳酸脫氫酶含量，即使環(huán)孢素阻斷條件下，針刺仍顯示其促進(jìn)骨骼肌外周循環(huán)方面的修復(fù)作用。

本實(shí)驗(yàn)HE染色光鏡下，模型組可見(jiàn)大量肌纖維萎縮，局部肌纖維斷裂，損傷處肌漿外漏，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且以彌散性炎性細(xì)胞增多為主，毛細(xì)血管增生明顯，少量肌纖維溶解，肌細(xì)胞間質(zhì)水腫，肌細(xì)胞核增多；損傷局部部分肌纖維腫脹，針刺組肌纖維排列較整齊，肌細(xì)胞間隙較空白組減小，損傷局部大量紅細(xì)胞聚集，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且較模型組損傷局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)更明顯，炎性反應(yīng)集中于肌纖維損傷處且表現(xiàn)為從外向里滲透。該結(jié)果也與田野等在對(duì)骨骼肌纖維超微結(jié)構(gòu)的影響中總結(jié)出的骨骼肌急性損傷的典型病理變化遵循特點(diǎn)一致[22-23]。說(shuō)明本造模方法可成功復(fù)制腓腸肌急性閉合性鈍挫傷模型，且針刺能有效促進(jìn)損傷的骨骼肌修復(fù)。CsA模型組可見(jiàn)肌纖維腫脹明顯，部分肌纖維溶解肌細(xì)胞間隙明顯減小，肌細(xì)胞核增多，少量毛細(xì)血管增生，無(wú)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，CsA針刺組肌纖維腫脹程度較CsA模型組減輕，肌細(xì)胞間隙明顯減小，出現(xiàn)少量空泡（因正常血液循環(huán)被破壞，使肌纖維缺乏營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)而壞死、萎縮所致），損傷處出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有大量紅細(xì)胞聚集。說(shuō)明阻斷CaN/NFAT通路后，損傷骨骼肌的修復(fù)受到了很大的影響。透射電鏡下，模型組肌原纖維溶解消失，無(wú)法區(qū)分A、I帶，Z線、M線溶解，針刺組肌原纖維形態(tài)正常，肌絲排列整齊，肌節(jié)未見(jiàn)腫脹，Z線、M線清晰，損傷局部聚集較多線粒體和肌質(zhì)網(wǎng)，正常的肌節(jié)附近有普遍增多的線粒體，進(jìn)一步證明了針灸針斜刺阿是穴可以有效地促進(jìn)腓腸肌急性鈍挫傷修復(fù)。CsA模型組肌絲紊亂，結(jié)構(gòu)不清，大量肌原纖維斷裂、溶解，Z線、M線溶解CsA針刺組肌節(jié)腫脹明顯，肌節(jié)腫脹，Z線溶解，部分肌原纖維扭曲、斷裂，損傷局部有結(jié)締組織增生，有大量線粒體聚集，并出現(xiàn)線粒體損傷現(xiàn)象，環(huán)孢素可減緩骨骼肌局部損傷反應(yīng)，同時(shí)也降低了針刺的修復(fù)作用，也進(jìn)一步佐證了CaN/NFAT通路不是針刺誘導(dǎo)損傷骨骼肌修復(fù)的唯一通路，但其在促進(jìn)骨骼肌修復(fù)的過(guò)程中起重要作用。

[1]Mastaglia FL，Papadimitriou JM，KakulasB A.Regeneration ofmuscle induchennemuscular dystrophy：an electron microscopic study[J].Neurol，1970，11：425-444.

[2]Lehto MU，jarvine MJ.Muscles injuries，their healing process and treatment[J].Ann Chir Gynaecol，1991，80：102-108.

[3]Zacks SI，Kurek JB，Margarita Romanella，et al.The role of Leukenmia Inhibitory factor in skeletalmuscle regeneration and growth[J].Muscle＆Nerve，2002，12：234-256.

[4]Senf SM1，Howard TM，Ahn B，et al.Loss of the inducible Hsp70 delays the inflammatory response to skeletal muscle injury and severely impairs muscle regeneration[J].PLoSOne，2013，8（4）：e62687.

[5]Krause MP，Al-Sajee d，D＇Souza dM，et al.Impaired macrophage and satellite cell infiltration occurs in amuscle-specific fashion following injury in diabetic skeletalmuscle[J].PLoSOne，2013，8（8）：e70971.

[6]Angus LM，Chakkalakal JV，Mejat A，et al.Calcineurin-NFAT signaling，together with GABP and peroxisome PGC-1 alpha，drives utrophin gene expression at the neuromuscular junction[J].Am J Physiol Cell Physiol，2005，289（4）：C908-917.

[7]Bigard AX，Koulmann N，Bahi L，et al.Thyroid hormones and muscle phenotype：involvement of new signaling pathways[J].JSocBio，2008，202（2）：93-100.

[8]朱一力，張國(guó)華，曾凡星.機(jī)械刺激誘導(dǎo)肌肉生長(zhǎng)的細(xì)胞信號(hào)通路[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（28）：5507-5512.

[9]林清，張宏，趙謙，等.推拿法引發(fā)人骨骼肌細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制探討[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，2（27）：81-84.

[10]Adams GR，Bamman MM.Characterization and regulation ofmechanical loading-induced compensatory muscle hypertrophy[J].Compr Physiol，2012，2（4）：2829-2870.

[11]Angus LM，Chakkalakal JV，Mejat A，et al.Calcineurin-NFAT signaling，together with GABP and peroxisome PGC-1 alpha，drives utrophin gene expression at the neuromuscular junction[J].Am J Physiol Cell Physiol，2005，289（4）：C908-917.

[12]盧鼎厚，張志廉.斜刺對(duì)骨骼肌損傷的治療作用[J].中國(guó)針灸，1989，9（6）：1-4.

[13]盧鼎厚.骨骼肌損傷的病因和治療[M].北京：北京體育學(xué)院出版社，1993.

[14]段昌平，傅湘琦，趙天德，等.針刺和靜力牽張對(duì)延遲性酸痛過(guò)程中骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的影響[J].北京體育學(xué)院學(xué)報(bào)，1984，10（4）：8-19.

[15]張建國(guó)，樊景禹，盧鼎厚.針刺（直刺，斜刺）對(duì)大負(fù)荷斜蹲后骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的影響[J].體育科學(xué)，1988，8（1）：61-64.

[16]盧鼎厚，樊景禹，屈竹青，等.針刺和靜力牽張對(duì)大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌收縮結(jié)構(gòu)變化影響的免疫電鏡研究[J].體育科學(xué)，1992，12（6）：47-51.

[17]Tidball JG.Mechanical signal transduction in skeletal muscle growth and adaptation[J].JAppl Physiol，2005，98：1900-1908.

[18]Parsons SA，Millay d P，Wilkins B J，et al.Genetic loss of calcineurin blocks mechanical overload induced skeletal muscle fiber type switching but not hypertrophy[J].JBiol Chem，2004，279（25）：26192-26200.

[19]Sanna B，Brandt E B，Kaiser R A，et al.Modulatory calcineurin interacting proteins 1 and 2 function as calcineurin facilitators in vivo[J]. PNAS，2006，103（19）：7327-7332.

[20]Bassel duby R，Olson E N.Signaling pathways in skeletal muscle remodeling[J].Annu Rev Biochem，2006，75：19-37.

[21]Talmadge R J，Otis JS，Rittler M R，et al.Calcineurin activation influences muscle phenotype in amuscle-specific fashion[J].BMCCell Biol，2004，5：28-40.

[22]Brock Symons T，Clasey JL，Gater dR，et al.Effects of deep heat as a preventative mechanism on delayed muscle soreness[J].JStrength Cond Res，2004，18（1）：155-161.

[23]田野，楊錫讓.運(yùn)動(dòng)性骨骼肌纖維結(jié)構(gòu)、功能變化的機(jī)制研究力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌纖維超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，1992，11（4）：202-204.

[24]Sorichter，S，J.Mair，A.Koller，et al.Skeletal muscle trcponin I release and magnetic resonance imaging signal intensity changes after eccentric exercise-induced skeletal muscle injury[J].Clinica.Chimic.Acta，1997，262：139-146.

[25]vande Vyver M1，Myburgh KH.Cytokine and satellite cell responses to muscle damage：interpretation and possible confounding factors in human studies[J].JMuscle Res CellMotil，2012，33（3-4）：177-185.

（2013-10-25收稿 責(zé)任編輯：王明）

Observation on Experiment of the Morphological Effects of Acupuncture on Acute Blunt Skeletal Muscle Contusion Model

Huang Yiran，Zhang Qian，LiWenxun，Dong Moyang，Li Na，Ding Tingting，Lu Wentian，Yan An，，Guo Changqing
（School of Acupuncture and Moxibustion，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Objective：To observe the morphological effects of acupuncture on Ashi points of rabbits with acute gastrocnemius blunt contusion.Methods：Modeling was given on gastrocnemius muscle in rabits＇hindquarter by using method of free falling with quantitative load to duplicate acute skeletal muscle injury.The swelling degree and hardness of gastrocnemius（immediately，24hours，48hours after building the model）was measured.Materials were taken 48hours after building the model.The content of CK and LDH in serum were tested.The morphological changes of gastrocnemius under light microscope and electron microscope were observed.Results：48 hours after building the model，the content of CK of model group，acupuncture group，CsA model group and CsA acupuncture group increased significantly compared the nature group（P＜0.05）；compared with the nature group，differences of the content of LDH of model group and CsA model group increased significantly（P＜0.05）；compared with the model group，acupuncture group，CsA model group and CsA acupuncture group decreased significantly（P＜0.05）.Under light microscope，different kinds of muscle fiber trauma could be found in all groups except the nature group.Under electron microscope，Ultrastructural changes could be seen in all groups except the nature group.Conclusion：The modeling method can successfully copy acute closed skeletal gastrocnemius muscle injury model.Acupuncture could promote the reparative process of acute blunt muscle effectively，while CsA would partially reduce the repairing effect of acupuncture.

Acupuncture；Skeletal muscle；Morphology

R274.3；R246.9

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.04.025

北京中醫(yī)藥大學(xué)青年教師自主課題（編號(hào)：2012-QNJSZX010）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：201210026019）

黃怡然（1981—），北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，博士生，研究方向：針推康復(fù)治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，E-mail：caicai13＠126.com

郭長(zhǎng)青（1959—），男，教授，主任醫(yī)師，北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院針刀中心主任，電話傳真：64287525，通信地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北三環(huán)東路11號(hào)，100029，E-mail：guochangqing66＠163.com