李景峰 鄭啟新 陳廖斌 郭曉東 鄒枕瑋 張樹威

1(武漢大學(xué)中南醫(yī)院骨科，武漢 430071)2(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科，武漢 430022)

表面礦化修飾煅燒骨/BMP2活性多肽復(fù)合MC3T3-E1細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨

李景峰1*鄭啟新2陳廖斌1郭曉東2鄒枕瑋2張樹威1

1(武漢大學(xué)中南醫(yī)院骨科，武漢 430071)2(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科，武漢 430022)

探討表面礦化修飾煅燒骨/BMP2活性多肽復(fù)合材料、表面礦化修飾煅燒骨和單純煅燒骨復(fù)合MC3T3-E1細(xì)胞構(gòu)建的組織工程骨在體內(nèi)的成骨能力。實驗分3組，A組：表面礦化修飾煅燒骨/BMP2活性多肽復(fù)合材料，B組：表面礦化修飾煅燒骨，C組：單純煅燒骨。誘導(dǎo)培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞，將其分別接種于3組材料，倒置相差顯微鏡和環(huán)境掃描電鏡分別觀察細(xì)胞生長情況。將18只新西蘭大白兔隨機分成3組，每只大白兔作兩側(cè)骶棘肌肌袋模型，然后將3組材料分別植入大白兔骶棘肌內(nèi)，分別于術(shù)后第4、8周各組處死大白兔3只，行組織學(xué)觀察及新生骨面積測定。通過觀察發(fā)現(xiàn)MC3T3-E1細(xì)胞在3組材料表面生長良好，表面礦化修飾煅燒骨/BMP2活性多肽復(fù)合材料能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞在其表面粘附與增殖并能較好地保持細(xì)胞的形態(tài)。術(shù)后第4、8周組織學(xué)觀察A組材料新生骨明顯多于B組，B組多于C組。術(shù)后4周和8周新生骨面積測定值A(chǔ)、B、C組分別為(19 712.524±3 782.126)μm2、(28 227.617±2 455.375)μm2，(11 648.507±1 047.221)μm2、(14 592.892±899.532)μm2，(7 986.655±903.487)μm2，(11 254.822±669.508)μm2。表面礦化修飾煅燒骨/BMP-2活性多肽復(fù)合材料是一種較理想的骨組織工程復(fù)合材料，有望應(yīng)用于臨床。

表面修飾；煅燒骨；BMP2活性多肽；骨組織工程

引言

目前，遭受創(chuàng)傷以及患有骨腫瘤和慢性炎癥疾病而引起骨缺損的患者越來越多，這些患者中大部分均需行骨移植術(shù)。自體骨移植作為治療骨不連和骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)被廣泛應(yīng)用于臨床治療中[1]。然而，自體骨材料來源有限，而且會引起患者持續(xù)性疼痛、神經(jīng)損害和新的骨折發(fā)生[2]。同種異體骨的利用也是有限的，因為其存在一些不利的因素，如免疫排斥反應(yīng)，可能引起感染性疾病的傳播以及供體的短缺[3]。因此，亟需構(gòu)建與研發(fā)出一種可替代骨缺損修復(fù)材料。

在前期研究中，已制備出安全可靠的表面礦化修飾煅燒骨材料[7]，本實驗通過將BMP2活性多肽與表面礦化修飾煅燒骨進(jìn)行復(fù)合后與MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，植入大白兔骶棘肌肌袋中，評價表面礦化修飾煅燒骨/BMP2活性多肽材料在體內(nèi)的成骨能力，進(jìn)一步為擴(kuò)大表面礦化修飾煅燒骨和BMP2活性多肽在骨組織工程中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1單純煅燒骨

制備方法詳見文獻(xiàn)[7,11]。首先將新鮮小牛松質(zhì)骨部分劇成骨條，經(jīng)煮沸、氫氧化鈉、雙氧水溶液浸泡后，脫去松質(zhì)骨中部分有機物質(zhì)。然后將干燥的骨條放入馬弗爐中先后經(jīng)過800℃、維持6 h，1 200℃、維持1 h兩次高溫煅燒制備成單純煅燒骨。根據(jù)需要將煅燒骨條通過尖刀片和砂紙進(jìn)行修整打磨，最后超聲清洗并烘干，制成直徑為4 mm、長4 mm大小骨塊，消毒后備用。

1.1.2表面礦化修飾煅燒骨

將制備好的煅燒骨塊浸泡在配制好的1.5倍SBF中，每天更換模擬體液，同時溫度保持在37℃，浸泡時間為14 d。浸泡結(jié)束后取出煅燒骨材料用去離子三蒸水超聲清洗放入烘箱70℃烘干，消毒后備用。

1.1.3BMP2活性多肽的合成

本課題組采用芴甲基羰基/叔丁氧基(FMOC/tBu)固相多肽合成法自主設(shè)計并合成，其中BMP2活性多肽的序列為S[PO4]KIPKASSVPTELSA ISTLYLDDD。

1.1.4表面礦化修飾煅燒骨/BMP2活性多肽復(fù)合材料的制備

將每塊制備好的表面礦化修飾煅燒骨放入充分溶解5 mg BMP2活性多肽的1 mL去離子水中，然后將混合物放入低溫真空干燥箱負(fù)壓吸引24 h,再將其放入冷凍干燥機中低溫(-55℃)冷凍干燥48 h后，酒精蒸氣消毒備用。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組

實驗分為3組：A組為表面礦化修飾煅燒骨/BMP2活性多肽材料，B組為表面礦化修飾煅燒骨材料，C組為單純的煅燒骨材料。

1.2.2小鼠MC3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng)

小鼠胚胎成骨細(xì)胞株MC3T3-E1購買于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。將MC3T3-E1細(xì)胞株置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM。隔天換液一次，待細(xì)胞長至接近鋪滿瓶底時，用0.25%胰酶消化，1∶3傳代，按3×104/mL接種進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.3材料表面掃描電鏡觀察

將3組材料進(jìn)行隨機取樣，噴鉑，在環(huán)境掃描電鏡(QUANTA200，F(xiàn)EI公司，荷蘭)下觀察3種煅燒骨材料表結(jié)構(gòu)以及BMP2活性多肽的復(fù)合情況。

1.2.4細(xì)胞與材料復(fù)合培養(yǎng)及鏡下觀察

將消毒好后的3組材料分別用完全培養(yǎng)基浸泡1d,置于培養(yǎng)板中備用。將傳至第3代的小鼠MC3T3-E1細(xì)胞以1×105/塊的密度通過負(fù)壓抽吸使細(xì)胞均勻接種于材料中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每組6塊材料。MC3T3-E1細(xì)胞與3組材料共培養(yǎng)3 d后在倒置相差顯微鏡(CKX41，Olympus公司，日本)下觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長情況。同時用2%戊二醛固定，酒精梯度脫水干燥，噴鉑，環(huán)境掃描電鏡下觀察1、3、7 d等3個時間點MC3T3-E1細(xì)胞在表面礦化修飾煅燒骨/BMP2活性多肽復(fù)合材料表面的黏附和生長情況。

1.2.5實驗動物

取4-6月齡新西蘭大白兔18只，雄性，體重2.0～2.5 kg，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。所有動物喂養(yǎng)均嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)施行。所有動物實驗均在武漢大學(xué)與華中科技大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)下實行。

1.2.6手術(shù)方法

每只大白兔術(shù)前均用戊巴比妥鈉(25 mg/kg)和甲苯噻嗪(8 mg/kg)肌肉注射麻醉。麻醉滿意后，用彎剪剔除大白兔背部兔毛，然后用1%活力碘消毒滅菌，常規(guī)鋪巾。沿背部兩側(cè)分別作縱行切口，長約3 cm，顯露雙側(cè)骶棘肌，制成小肌袋，用生理鹽水沖洗傷口，將3組材料隨機植入。每個肌袋植入一塊材料，紗布加壓止血，縫合肌層及皮膚層，包扎傷口。動物分組做好標(biāo)記后，分籠喂養(yǎng)。術(shù)后所有實驗大白兔均肌注青霉素40萬u，QD，連續(xù)7 d。

1.2.7術(shù)后觀察指標(biāo)

2 結(jié)果

2.1材料表面觀察

電鏡觀察顯示：3組材料均保留了天然的空隙結(jié)構(gòu)，孔徑大小為200～850 μm。A組材料可見白色絮狀或纖維狀活性多肽緊貼在礦化修飾煅燒骨孔壁表面，B組材料煅燒骨表面可見一層較完整、均一的類骨磷灰石層形成(見圖1)。

2.2細(xì)胞與材料共培養(yǎng)鏡下觀察

2.2.1倒置相差顯微鏡下觀察

MC3T3-E1細(xì)胞與3組材料共培養(yǎng)3 d后，倒置相差顯微鏡下觀察材料周圍細(xì)胞均生長良好，細(xì)胞呈梭形或多角形生長，可見3組材料對細(xì)胞均無毒性，細(xì)胞生物相容性良好(見圖2)。

2.2.2電鏡觀察

MC3T3-E1細(xì)胞在表面礦化修飾煅燒骨/BMP2活性多肽表面復(fù)合培養(yǎng)1、3、7 d后，通過電鏡掃描觀察可見，培養(yǎng)1 d時，材料表面細(xì)胞主要呈圓形或類圓形；3 d時MC3T3-E1細(xì)胞增殖，數(shù)量增多，呈梭形或多角形；7 d時MC3T3-E1細(xì)胞數(shù)量較前明顯增多，細(xì)胞與材料表面結(jié)合緊密，細(xì)胞之間連接成片，細(xì)胞外基質(zhì)分泌較多(見圖3)。

2.3一般情況

術(shù)后所用大白兔均在2 h內(nèi)蘇醒。術(shù)后分籠喂養(yǎng)，自由活動，進(jìn)食正常。動物傷口均愈合良好，未見紅腫、滲血滲液等。進(jìn)入實驗研究中的動物均健康生存直至取材。

2.4組織學(xué)(HE)觀察

3組材料植入肌袋4周后，可見A組中新生骨沿煅燒骨表面排列，類骨質(zhì)沉積于煅燒骨孔隙表面，成骨細(xì)胞較其他兩組為多，部分可見軟骨樣組織形成；而B組與C組新生骨量明顯較A組少(圖4中(a)～(c))。植入8周后，A組可見大量新生骨及板層骨形成，材料孔隙及周圍可見大量成骨細(xì)胞，可見血管形成和長入，周圍大量骨基質(zhì)形成；而B組與C組新生骨量明顯不如A組(圖4中(d)～(f))。

2.5新生骨面積測定

3組材料分別植入肌袋4周和8周后，A組新生骨面積在兩個時間點均明顯優(yōu)于B組和C組，B組優(yōu)于C組，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

3 討論和結(jié)論

實驗中，設(shè)計合成了一種仿生骨基質(zhì)材料表面礦化修飾煅燒骨/BMP2活性多肽P24，通過將其植入兔骶棘肌肌袋在不同時間點進(jìn)行組織學(xué)觀察和成骨量檢測發(fā)現(xiàn)，表面礦化修飾煅燒骨/P24材料能有效地誘導(dǎo)和促進(jìn)成骨細(xì)胞的長入與增殖，是一種較理想的骨組織工程骨復(fù)合材料。

本實驗中，MC3T3-E1細(xì)胞與3種材料共培養(yǎng)后鏡下觀察，3種材料細(xì)胞相容性良好，MC3T3-E1細(xì)胞能在表面礦化修飾煅燒骨表面保持良好的細(xì)胞形態(tài)，且表面礦化修飾煅燒骨與BMP2活性肽P24復(fù)合后，能促進(jìn)煅燒骨的成骨誘導(dǎo)能力。組織學(xué)觀察顯示，4周時，A組中新生骨沿煅燒骨表面排列，類骨質(zhì)沉積于煅燒骨孔隙表面，成骨細(xì)胞較其他兩組為多，部分可見軟骨樣組織形成；而B組與C組新生骨量明顯較A組少。8周時，A組可見大量新生骨及板層骨形成，材料孔隙及周圍可見大量成骨細(xì)胞，可見血管形成和長入，周圍大量骨基質(zhì)形成；而B組與C組新生骨量明顯不如A組。新生骨成骨面積檢測顯示3組材料分別植入肌袋4周和8周后，A組新生骨面積在兩個時間點均明顯優(yōu)于B組和C組，B組優(yōu)于C組。其中，4周時，A組成骨面積為(19 712.524±3 782.126)μm2，B組成骨面積為(11 648.507±1 047.221)μm2，C組成骨面積為(7 986.655±903.487)μm2。8周時，3組成骨面積分別為(28 227.617±2 455.375)μm2、(14 592.892±899.532)μm2、(11 254.822±669.508)μm2。通過體外細(xì)胞共培養(yǎng)電鏡觀察和體內(nèi)組織學(xué)觀察與成骨定量檢測，表面礦化修飾煅燒骨/BMP2活性多肽P24材料是一種較理想的骨組織工程復(fù)合材料。

表面礦化修飾煅燒骨/BMP2活性多肽P24材料誘導(dǎo)成骨主要機制為：①煅燒骨的主要成分為β-TCP，其降解產(chǎn)物Ca2+、PO43-可以參入骨代謝并促進(jìn)骨形成；②煅燒骨表面經(jīng)礦化修飾后所形成的粗糙表面增大了細(xì)胞黏附的表面積，同時BMP2活性肽P24通過信號傳遞系統(tǒng)參與細(xì)胞粘附過程，能顯著提高煅燒骨表面的細(xì)胞親和性；③表面修飾化煅燒骨表面經(jīng)含氨基酸活性基團(tuán)的BMP2活性肽P24修飾后，產(chǎn)生了表面化學(xué)的差異性，有利于鈣磷沉積，有利于誘導(dǎo)周圍細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，增殖；④通過表面礦化修飾煅燒骨的載體作用，BMP2活性肽P24能夠在一定時間內(nèi)緩慢釋放出骨誘導(dǎo)活性的P24，持續(xù)地發(fā)揮誘導(dǎo)成骨作用?；谝陨显?，在本實驗中，表面礦化修飾煅燒骨/BMP2活性多肽P24材料在體內(nèi)具有明顯的誘導(dǎo)成骨作用。

綜上所述，體外構(gòu)建的表面礦化修飾煅燒骨/BMP2活性多肽P24材料是一種較理想的骨組織工程復(fù)合材料，能在體內(nèi)啟動經(jīng)典的軟骨內(nèi)化骨過程。如果能成功應(yīng)用于臨床，將是廣大骨病患者的福音。

[1] Lane JM, Tomin E, Bostrom MPG. Biosynthetic Bone Grafting[J]. Clin Orthop, 1999,367:S107-S117.

[2] Yaszemski MJ, Payne RG, Hayes WC,etal. Evolution of bone transplantation: molecular, cellular and tissue strategies to engineer human bone [J]. Biomaterials, 1996,17:175-185.

[3] Chang SC, Chuang H, Chen YR,etal. Cranial repair using BMP-2 gene engineered bone marrow stromal cells [J]. J Surg Res, 2004,119: 85-91.

[4] Li Xiaoke, Chang Jiang. Preparation and characterization of bioactive collagen/ wollastonite composite scaffolds [J]. J Mater Sci Mater Med, 2005,16:361-365.

[5] Hsu HC, Wu SC, Yang CH,etal. ZrO(2)/hydroxyapatite coating on titanium by electrolytic deposition[J]. J Mater Sci Mater Med, 2009,20:615-619.

[6] Herliansyah MK, Hamdi M, Ide-Ektessabi A,etal. The influence of sintering temperature on the properties of compacted bovine hydroxyapatite[J]. Mater Sci Eng, 2009,29: 1674-1680.

[7] 李景峰，鄭啟新，郭曉東. 表面修飾煅燒骨的制備及其理化性質(zhì)的研究[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2012，29(3)：474-478.

[8] Wu Bin, Zheng Qixin, Guo Xiaodong,etal. Preparation and ectopic osteogenesis in vivo of scaffold based on mineralized recombinant human-like collagen loaded with synthetic BMP-2-derived peptide [J]. Biomed Mater, 2008,3:44111.

[9] Culpepper BK, Phipps MC, Bonvallet PP,etal. Enhancement of peptide coupling to hydroxyapatite and implant osseointegration through collagen mimetic peptide modified with a polyglutamate domain[J]. Biomaterials, 2010,31(36): 9586-9594.

[10] Li Jingfeng, Hong Jijun, Zheng Qixin,etal. Repair of rat cranial bone defects with nHAC/PLLA and BMP-2-related peptide or rhBMP-2[J]. J Orthop Res, 2011,29(11):1745-1752.

[11] 鄭啟新, 劉蘇南. 煅燒牛松質(zhì)骨的制備、理化性能及生物相容性研究[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 2005,22(1):95-98.

[12] Li Jingfeng, Lin Zhenyu, Zheng Qixin,etal. Repair of rabbit radial bone defects using true bone ceramics combined with BMP-2-related peptide and type I collagen[J]. Mater Sci Eng C, 2010,30: 1272-1279.

TissueEngineeredBoneConstructedbySinteredBonewithSurfaceMineralizationModification/BMP-2-RelatedPeptideandMC3T3-E1Cells

LI Jing-Feng1*ZHENG Qi-Xin2CHEN Liao-Bin1GUO Xiao-Dong2ZOU Zhen-Wei2ZHANG Shu-Wei1

1(DepartmentofOrthopadics,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China)2(DepartmentofOrthopaedics，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China)

The aim of this study is to investigate the osteogenesis of tissue engineered bone constructed by sintered bone with surface mineralization modification/BMP-2-related peptide (P24) composite with MC3T3-E1 cellsinvivo. The biomaterials were divided into three groups: Group A (sintered bone with surface mineralization modification / P24 composite); Group B (sintered bone with surface mineralization modification) and Group C (sintered bone). The MC3T3-E1 cells were induced by osteogenic medium and then seeded into the three materials. The cell-material samples were observed by inverted microscopy and environment scanning electron microscopy (ESEM). Eighteen New Zealand white rabbits were divided into three groups with 6 in each group. The model of sacrospinalis myo-bag was established by implanting above material samples in the myo-bag on the two sides. Every three rabbits in the three groups were killed at the 4thand 8thweek after implantation, and then the new bone was observed by histologically (HE) and the areas of new osseous tissues were measured. Results from the inverted microscopy and ESEM showed that cells were grown well on the surface of the three materials, and BMP-2-related peptide of Group A was confirmed to improve the adhesion rate and proliferation ability of MC3T3-E1 cells, and maintained the morphology of cells. At different postoperative time points, HE staining results showed new bone of Group A was significantly more than that of Group B and Group C, and that of Group B was significantly more than that of Group C. The areas of the new osseous tissue of group A, B, and C were (19 712.524±3 782.126) μm2, (28 227.617±2 455.375) μm2, and (11 648.507±1 047.221) μm2at the 4thweek post-surgery, and (14 592.892±899.532)μm2, (7 986.655±903.487)μm2, and (11 254.822±669.508) μm2at 8thweek post-surgery respectively. Sintered bone with surface mineralization modification / P24 composite is an ideal scaffold for bone tissue engineering, which is expected to be applied to clinical studies.

surface modified; sintered bone; BMP2-related peptide; bone tissue engineering

10.3969/j.issn.0258-8021. 2014. 03.012

2013-10-25， 錄用日期:2014-03-30

國家自然科學(xué)基金(81301538)

R318

A

0258-8021(2014) 03-0343-06

*通信作者(Corresponding author)，E-mail: hbjfeng@163.com