李理，劉冶，滿(mǎn)朝新，姜毓君,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.筑波大學(xué)生命環(huán)境科學(xué)研究科，日本筑波3058572；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開(kāi)發(fā)中心，哈爾濱 150028）

0 引 言

γ-氨基丁酸 （gamma-aminobutyric acid，GABA）又名4-氨基丁酸、γ-氨酪酸，是一種在自然界廣泛分布的非蛋白質(zhì)氨基酸，動(dòng)物、植物和微生物甚至一些生存在極端環(huán)境中的微生物體內(nèi)均分離得到了GABA。GABA早期被研究者確定為哺乳動(dòng)物神經(jīng)中樞的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，此后GABA其他生物學(xué)功能也逐漸被發(fā)現(xiàn)并得到確認(rèn)[1]。Hayakawa等人通過(guò)比較GABA灌胃自發(fā)性高血壓癥小鼠和血壓正常小鼠后的收縮壓，證明GABA可以通過(guò)抑制交感神經(jīng)釋放去甲腎上腺素來(lái)抑制血壓的升高[2]。臨床實(shí)驗(yàn)還證明適當(dāng)提高病人血液中GABA水平可有效減少抑郁和神經(jīng)紊亂的發(fā)生，具有一定鎮(zhèn)靜安神和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的功效[3,4]。近年來(lái)，更多與GABA相關(guān)的生物學(xué)特性也相繼被報(bào)道?？诜欢縂ABA可以增加血漿中生長(zhǎng)激素含量，促進(jìn)腦部蛋白的合成[5]；抑制由丙二醛引起的一系列脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減緩氧化對(duì)機(jī)體造成的損傷[6]。不僅如此，GABA還能夠減少周身性免疫因子的產(chǎn)生并抑制炎癥的發(fā)生[7]。正因?yàn)镚ABA具有上述多種生理方面的益生作用，使得它成為近年來(lái)食品和藥品領(lǐng)域關(guān)注和研究的重點(diǎn)。

目前，GABA的合成方法主要有化學(xué)法和生物法。與化學(xué)合成相比，生物合成具有方法簡(jiǎn)單、條件溫和、合成效率高以及耗能低等優(yōu)勢(shì)[8]。生物合成主要是利用代時(shí)短、易培養(yǎng)的微生物，以谷氨酸（Glu）或其鹽類(lèi)為底物通過(guò)谷氨酸脫羧酶對(duì)底物進(jìn)行脫羧從而合成GABA。由于乳酸菌具有特殊的生理活性如免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收、改善腸道內(nèi)環(huán)境，抑制致病菌增殖等[9,10]，另外還被認(rèn)為是食品安全級(jí)的微生物，因此近年來(lái)食品和藥品行業(yè)將乳酸菌作為合成GABA的首選，同時(shí)相關(guān)領(lǐng)域的專(zhuān)家和學(xué)者也在對(duì)如何提高乳酸菌合成GABA的能力進(jìn)行深入研究。本綜述主要從產(chǎn)GABA乳酸菌的種類(lèi)及來(lái)源、產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選方法、乳酸菌合成GABA的影響因素以及高產(chǎn)GABA乳酸菌的應(yīng)用等方面來(lái)進(jìn)行介紹和總結(jié)。

1 產(chǎn)GABA乳酸菌的種類(lèi)及來(lái)源

具有合成GABA能力的乳酸菌種類(lèi)較多且合成能力因菌株的種屬不同而差異較大。許多研究表明，來(lái)源多樣的短乳桿菌Lactbacillus brevis合成GABA的能力比較突出。泡菜是高產(chǎn)GABA乳酸菌的重要來(lái)源之一，從泡菜中篩選得到高產(chǎn)GABA的短乳桿菌也比較多，Park和Oh從韓國(guó)傳統(tǒng)泡菜中分離得到一株產(chǎn)GABA的短乳桿菌，在MRS培養(yǎng)基中其GABA產(chǎn)量為8 mmol/L左右[11]。Min和Keun也從韓國(guó)泡菜中分離得到若干種能夠產(chǎn)生GABA乳酸菌，其中一株短乳桿菌GABA的產(chǎn)量也比較高[12]。中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸菜中也分離到高產(chǎn)GABA的短乳桿菌[8]。除泡菜和酸菜外，研究人員在其他發(fā)酵食品中也分離得到了具有合成GABA能力的短乳桿菌，Siragusa等人從意大利干酪中分離出一株短乳桿菌，其GABA產(chǎn)量為15.0 mg/kg干酪[13]。不僅如此，2012年首次從人體腸道中分離出一株能夠利用谷氨酸作為底物合成GABA的短乳桿菌Lb.brevis DPC6108[14]。另外，一些從其他來(lái)源分離到的產(chǎn)GABA的短乳桿菌也有相應(yīng)報(bào)道，如Lb.brevis NBRC12,005[15]，Lb.brevis IFO-12005[16]和Lb.brevis GABA 057[17]。

除短乳桿菌外，植物乳桿菌[13]、副干酪乳桿菌[18]、布氏乳桿菌[16]和德式乳桿菌[13]等也都具有較好的GABA合成能力。從干酪中分離出來(lái)的植物乳桿菌Lb.plantarum C48在乙酸鈉緩沖液和復(fù)合發(fā)酵面粉中GABA的產(chǎn)量分別為16.0 mg/kg[13]和504 mg/kg[20]；Di等人也從干酪中分離出一株高產(chǎn)GABA的植物乳桿菌Lb.plantarum DSM19463，MRS純培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生498.1 mg/L的GABA[21]。泡菜中也分離得到了一些具有合成GABA能力的植物乳桿菌，如Lb.plantarum KCQ1，Lb.plantarum KC-R1和Lb.plantarum KC-R36[12]。不僅乳桿菌能夠合成GABA，乳酸菌家族中一些球菌，如嗜熱鏈球菌和乳酸乳球菌及其亞種[22]也能夠生成GABA且產(chǎn)量各異。有文獻(xiàn)報(bào)道，泡菜[23]，酸奶[24]，干酪[25]和干酪發(fā)酵劑[26]中都分離得到了能夠合成GABA的乳酸乳球菌，其中Lu等人從泡菜中分離出來(lái)的Lactococcus.lactis subsp.lactis合成GABA能力最強(qiáng)，MRS中GABA產(chǎn)量可達(dá)到7.2 g/L[23]。除上述分離于乳制品中的乳酸菌外，來(lái)源于發(fā)酵水產(chǎn)品的香腸乳桿菌Lb.farciminis[27]，來(lái)源于泡菜的清酒乳桿菌Lb.sakei B2-16[28],腸系膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides，乳明串珠菌Leuconostoc lactis和綠色魏斯氏菌Weissella viridescens[12]以及來(lái)源于發(fā)酵肉質(zhì)品中的戊糖片球菌Pediococcus pentosaccus HN8和Lb.namurensis NH2[29]都能夠合成GABA。

從上述文獻(xiàn)報(bào)道中不難發(fā)現(xiàn)，合成GABA能力較強(qiáng)的乳酸菌主要有短乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和乳酸乳球菌，且這些菌種的來(lái)源大多集中在一些酸性發(fā)酵食品中，如泡菜、干酪和酸奶等。這些事實(shí)表明大部分能夠合成GABA的乳酸菌應(yīng)該是嗜酸性的，并且能夠利用酸性環(huán)境中某些特殊成分不斷產(chǎn)生并積累GABA，這一點(diǎn)不僅為產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選做出了提示，也說(shuō)明了pH是影響乳酸菌合成GABA的因素之一。

2 產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選方法

篩選具有合成GABA能力的乳酸菌是相關(guān)研究工作的第一步，目前主要以GABA的產(chǎn)量作為篩選依據(jù)。GABA的檢測(cè)方法較多，例如氨基酸分析儀法[21]、氣相色譜法[26]、高效液相色譜法[22],液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[30]和流動(dòng)注射分析法[31]。上述幾種方法檢測(cè)準(zhǔn)確、靈敏度高，但需要昂貴的儀器和復(fù)雜的樣品前處理，對(duì)于直接從復(fù)雜基質(zhì)中篩選菌株更加費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此為了減少篩菌工作量并降低成本，有必要先采用較簡(jiǎn)單的方法對(duì)菌株進(jìn)行初步篩選。Li等人[32]從泡菜中分離出1 000多株乳酸菌，他們先采用紙層析色譜法對(duì)具有合成GABA能力的菌株進(jìn)行初步篩選，再利用高效液相色譜法對(duì)疑似菌株GABA產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定，最后采用液相-質(zhì)譜聯(lián)用的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。采用不同手段對(duì)乳酸菌進(jìn)行分階段篩選不僅保證了篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)大大節(jié)約了篩選時(shí)間和成本。

除了分級(jí)篩選的方法，還有一些操作簡(jiǎn)單、平行性好，適合樣本數(shù)量較大的菌株篩選的方法。薄層色譜法（TLC）是一種快速分離和定性分析少量物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)。Cho等人[19]將從泡菜中分離到的乳酸菌經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，培養(yǎng)上清液采用TLC檢測(cè)其中GABA含量，由于此方法不需要復(fù)雜的檢測(cè)設(shè)備和繁瑣的樣品處理，許多產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選都選擇此種方法，或者做為初篩的方法[11,16,18]；還有一種方法是基于一系列與GABA相關(guān)的酶反應(yīng)，利用生成特定產(chǎn)物間接檢測(cè)GABA含量，同時(shí)結(jié)合光譜法和酶標(biāo)儀，使得一次可以檢測(cè)96個(gè)樣品，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)GABA乳酸菌的高通量篩選，這種方法與高效液相色譜法相比具有快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)[15]。

選擇一種合適的GABA定性或定量的方法對(duì)于產(chǎn)GABA乳酸菌篩選工作的順利進(jìn)行至關(guān)重要，考慮到實(shí)驗(yàn)條件、樣本大小、篩選成本和其他因素的限制，有時(shí)可能需要多種檢測(cè)手段結(jié)合起來(lái)才能完成菌株篩選工作。

3 乳酸菌合成GABA的影響因素

影響乳酸菌合成GABA的因素有很多，不同發(fā)酵條件會(huì)影響GABA的產(chǎn)量和產(chǎn)率，其中主要因素有底物Glu及其鹽類(lèi)的添加量、輔酶磷酸吡哆醛(PLP)的添加量、pH值、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵基質(zhì)。這些主要因素之所以能夠顯著影響GABA的產(chǎn)量其原因在于上述因素能夠影響GABA酶促反應(yīng)中關(guān)鍵酶—谷氨酸脫羧酶的活性，許多針對(duì)乳酸菌GABA產(chǎn)量?jī)?yōu)化的研究也正是通過(guò)優(yōu)化谷氨酸脫羧酶的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)提高菌株合成GABA的能力。

3.1 底物及輔酶的影響

乳酸菌中GABA主要是通過(guò)谷氨酸脫羧酶催化底物Glu及其鹽類(lèi)進(jìn)行脫羧反應(yīng)產(chǎn)生的，因此底物濃度會(huì)直接影響GABA產(chǎn)生的數(shù)量和速率；另外PLP是轉(zhuǎn)氨酶和脫羧酶類(lèi)的輔酶，它能夠促進(jìn)谷氨酸的脫羧，促進(jìn)GABA的產(chǎn)生，因此輔酶的添加量也是影響GABA產(chǎn)量的重要因素之一。在MRS培養(yǎng)基中添加一定量的Glu和PLP使得Lb.paracasei NFRI 7415合成GABA的能力明顯提高，當(dāng)?shù)孜锾砑恿繛?00 mmol/L時(shí)GABA產(chǎn)量最高可達(dá)到 161 mmol/L[18]。Lb.plantarum DSM1946在添加了18.4 mmol/L L-谷氨酸鈉（L-MSG）的葡萄汁和乳清中GABA的產(chǎn)量為4.83 mmol/L，較不添加底物和輔酶時(shí)有所提高[24]。短乳桿菌是產(chǎn)GABA能力較強(qiáng)的菌株之一，其合成GABA能力也受到底物和輔酶濃度的影響。Hang等人[33]和Li等人[34]都通過(guò)優(yōu)化L-MSG和PLP的添加量來(lái)提高短乳桿菌GABA的產(chǎn)量。還有文獻(xiàn)報(bào)道，在Glu含量比較豐富的發(fā)酵豆乳中短乳桿菌產(chǎn)GABA的量高于其在一般發(fā)酵乳中的產(chǎn)量[35]。但也有文獻(xiàn)指出，適量提高培養(yǎng)基中谷氨酸鈉的濃度對(duì)一些乳酸菌GABA的產(chǎn)量沒(méi)有影響[22]，這表明Glu及其鹽類(lèi)對(duì)于提高乳酸菌產(chǎn)GABA的能力具有一定的種屬特異性，或者在這些乳酸菌中可能存在其他GABA合成的途徑。類(lèi)似的，對(duì)于某些乳酸菌而言，PLP的增加也沒(méi)有提高其合成GABA的能力，這可能是由于基質(zhì)中或菌株本身就能夠提供充足的內(nèi)源性輔酶[21]。

3.2 發(fā)酵pH值的影響

乳酸菌合成GABA的能力主要受到谷氨酸脫羧酶活性的影響，不同乳酸菌中谷氨酸脫羧酶的性質(zhì)不同導(dǎo)致了GABA最大量積累時(shí)的pH值具有種屬特異性。植物乳桿菌Lb.plantarum DSM1946在pH為6.0時(shí)合成GABA的速率最大[21]；副干酪乳桿菌Lb.paracasei NFRI 7415產(chǎn)GABA的最適pH為5.0左右[18]；而短乳桿菌Lb.brevis GABA057能夠在更酸性的環(huán)境下，pH約為4.2時(shí)將10%的底物轉(zhuǎn)換成GABA[17]。在干酪中篩選得到的合成GABA能力較強(qiáng)的幾株乳酸菌，它們產(chǎn)GABA的最適pH值也大都集中在4～6的范圍內(nèi)[13]，上述文獻(xiàn)表明大部分乳酸菌的谷氨酸脫羧酶是酸性依賴(lài)的，但也有例外的情況。LU等人[23]優(yōu)化了Lc.lactis富集GABA的發(fā)酵條件，他們發(fā)現(xiàn)該菌株最大程度積累GABA的pH值為7.5～8.0，當(dāng)pH超過(guò)8.0后菌株合成GABA能力明顯下降，這說(shuō)明了就發(fā)酵pH值這一影響因素來(lái)說(shuō)，乳桿菌和乳球菌積累GABA的條件差異較大。

3.3 發(fā)酵時(shí)間的影響

GABA作為乳酸菌的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物其積累量受發(fā)酵時(shí)間影響較大，每種乳酸菌都有各自的生長(zhǎng)特性，從發(fā)酵開(kāi)始在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期，因此GABA的最大積累時(shí)間也有所不同。以乳桿菌為例，副干酪乳桿菌Lb.paracasei NFRI 7415最大積累GABA的時(shí)間是植物乳桿菌Lb.plantarum DSM19463積累時(shí)間的2倍[18,21]。另外，發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和發(fā)酵pH值會(huì)相互作用從而影響GABA的最終積累量。短乳桿菌Lb.brevis GABA 100在黑樹(shù)莓汁中發(fā)酵第15天時(shí)GABA的積累量達(dá)到最大，而當(dāng)pH和發(fā)酵溫度有較大變化時(shí)，則在第12天就達(dá)到了最大積累量[36]。一些研究還通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程的不同時(shí)間點(diǎn)添加底物或輔酶來(lái)增加乳酸菌合成GABA的量，這樣做也是考慮到發(fā)酵時(shí)間會(huì)對(duì)終產(chǎn)物積累量產(chǎn)生影響[22,23]。

3.4 發(fā)酵基質(zhì)及培養(yǎng)基添加物的影響

培養(yǎng)基中不同種類(lèi)的碳源會(huì)直接影響乳酸菌GABA的產(chǎn)量。在阿拉伯糖、核糖、D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖等多種碳源中，短乳桿菌Lactobacillus brevisNCL912合成GABA的最佳碳源是1.25%的葡萄糖[34]。Raffaella等人為了探索Lactobacillus plantarum DSM19463產(chǎn)GABA的最佳碳源，他們向培養(yǎng)基中添加不同量的葡萄汁，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄汁的添加量為總碳源的4%時(shí)，菌株合成GABA的量最大[21]。Lu等人還采用D-optimal mixture design的方法優(yōu)化了培養(yǎng)基中三種主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的添加比例，當(dāng)黑米汁∶發(fā)酵大豆汁∶酶解脫脂乳=33∶58∶9時(shí)乳酸乳球菌Lc.lactic B產(chǎn)GABA的量最高，可達(dá)到6.41 g/L[24]。除了培養(yǎng)基中主要的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)影響GABA的積累，一些額外添加的成分也會(huì)影響乳酸菌合成GABA的能力。很早就有文獻(xiàn)報(bào)道，適量的硫酸根離子可以增加谷氨酸脫羧酶的活性，促進(jìn)GABA的合成且具有濃度依賴(lài)性。向培養(yǎng)基中分別加入硫酸銨、硫酸鈉和硫酸鎂短乳桿菌Lb.brevis IFO 12005合成GABA的量均有不同程度的提高，其中硫酸銨提高的效果最為明顯[37]。在一些能夠產(chǎn)生GABA的植物和谷物中，某些金屬離子（如鈣離子）作為酶的活性中心也可以增加谷氨酸脫羧酶的活性，有利于GABA的積累[38]，但在乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中添加適量的鈣離子能否增加谷氨酸脫羧酶的活性并提高GABA產(chǎn)量還需要進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

4 高產(chǎn)GABA乳酸菌在乳制品中的應(yīng)用

近年來(lái)，人們對(duì)健康的關(guān)注度越來(lái)越高，消費(fèi)者希望購(gòu)買(mǎi)具有益生保健功能食品的愿望也越來(lái)越強(qiáng)烈。γ-氨基丁酸是一種天然的生物活性物質(zhì)，開(kāi)發(fā)富含GABA的保健食品具有廣闊的市場(chǎng)價(jià)值；同時(shí)乳酸菌作為一種公認(rèn)的食品級(jí)安全微生物其多種保健功能已逐漸被認(rèn)可，因此使用具有產(chǎn)GABA能力的乳酸菌作為發(fā)酵劑生產(chǎn)富含GABA的乳制品能夠?qū)⑷樗峋虶ABA兩者的益生功能加以結(jié)合。

目前，許多研究者都致力于開(kāi)發(fā)富含GABA的乳制品，如酸奶[35]、發(fā)酵豆奶[39]、干酪[26]、發(fā)酵乳及發(fā)酵乳飲料[40]等等，但由于乳酸菌合成GABA的能力各異，且乳酸菌的種類(lèi)及其作為發(fā)酵劑時(shí)的添加量都對(duì)發(fā)酵乳制品的感官品質(zhì)尤其是風(fēng)味影響較大，因此選擇合適的產(chǎn)GABA的菌株作為發(fā)酵劑是生產(chǎn)富含GABA乳制品的關(guān)鍵。另外，已報(bào)道的能夠產(chǎn)GABA的乳酸菌大部分需要以谷氨酸或其鹽類(lèi)作為底物，因此向乳制品中添加較多的谷氨酸或谷氨酸鹽以保證GABA的產(chǎn)量不僅影響乳制品本身的風(fēng)味和口感，也增加了產(chǎn)品生產(chǎn)成本，同時(shí)谷氨酸攝入量較多也不利于機(jī)體健康。今后，研制富含GABA發(fā)酵乳制品時(shí)應(yīng)當(dāng)不僅考慮發(fā)酵劑乳酸菌產(chǎn)GABA的能力，同時(shí)更應(yīng)該注意菌株是否能將底物盡可能多的轉(zhuǎn)化成我們需要的產(chǎn)物，以減少底物殘留對(duì)產(chǎn)品口感的影響。因此，篩選能夠高效利用谷氨酸或谷氨酸鹽產(chǎn)生GABA的乳酸菌，將會(huì)是開(kāi)發(fā)富含GABA的發(fā)酵乳制品未來(lái)方向。

5 總結(jié)與展望

利用乳酸菌合成γ-氨基丁酸是一種經(jīng)濟(jì)、安全、環(huán)保生產(chǎn)高附加值天然活性物質(zhì)的重要手段。具有合成GABA能力的乳酸菌種類(lèi)較多且合成能力具有種屬差異，因此從食品中或與食品相關(guān)環(huán)境中篩選高產(chǎn)GABA的乳酸菌是研究產(chǎn)GABA乳酸菌性質(zhì)和開(kāi)發(fā)相關(guān)產(chǎn)品的基礎(chǔ)。乳酸菌合成GABA的影響因素有很多，其中一些因素還會(huì)相互作用、綜合影響GABA的終產(chǎn)量。

谷氨酸脫羧酶的活性與GABA產(chǎn)量密切相關(guān)，目前對(duì)乳酸菌GABA產(chǎn)量的優(yōu)化主要從優(yōu)化該酶活性入手，與之相關(guān)的影響因素研究的也比較透徹。但與GABA代謝相關(guān)的酶除谷氨酸脫羧酶還有GABA轉(zhuǎn)氨酶和琥珀酸半醛脫氫酶等[38]，因此找到影響其他關(guān)鍵酶活性的因素并研究這些因素是否影響乳酸菌產(chǎn)GABA的能力對(duì)理解和分析乳酸菌GABA的整體代謝途徑至關(guān)重要，同時(shí)也有助于構(gòu)建乳酸菌中GABA合成與分解的代謝通路。

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