杜麗娟 徐軍全 宋彬妤 康杰 姚瑞強(qiáng) 王明亮

川芎嗪對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響

杜麗娟 徐軍全 宋彬妤 康杰 姚瑞強(qiáng) 王明亮

目的 觀察川芎嗪對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響, 探討川芎嗪治療肝纖維化的作用機(jī)制。 方法 四氯化碳皮下注射制備大鼠肝纖維化模型, 設(shè)立正常對(duì)照組、肝纖維化模型組和川芎嗪治療組, 川芎嗪治療組在造模過(guò)程中每天給予鹽酸川芎嗪注射液腹腔注射, 6周后, 乙醚麻醉, 腹主動(dòng)脈采血, 產(chǎn)色基質(zhì)偶氮法鱟試劑定量測(cè)定血漿內(nèi)毒素；肝組織常規(guī)HE染色觀察肝臟病變, 天狼猩紅膠原染色、肝組織羥脯氨酸含量測(cè)定評(píng)測(cè)肝纖維化程度；West-blotting法檢測(cè)肝組織內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá), TBA法檢測(cè)肝組織丙二醛(MDA)水平, 酶顯色定量分析法檢測(cè)肝組織谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)含量。 結(jié)果 川芎嗪治療組與肝纖維化模型組相比, 肝損傷較輕, 肝纖維化程度明顯降低, 血漿內(nèi)毒素含量降低, Nrf2蛋白表達(dá)量增多, 肝組織中MDA含量降低, GST的含量升高。結(jié)論川芎嗪的抗肝纖維化作用可能與其降低內(nèi)毒素血癥, 激活肝內(nèi)Nrf2/ARE抗氧化通路進(jìn)而使得抗氧化酶GST等含量增加有關(guān)。

肝纖維化；川芎嗪；抗氧化；Nrf2；內(nèi)毒素

傳統(tǒng)中藥川芎為傘形科藁本屬植物, 味辛, 性溫, 歸肝、膽、心經(jīng), 氣香升散, 具有活血行氣, 祛風(fēng)止痛的功效, 被前人譽(yù)為血中之氣藥。川芎嗪, 化學(xué)名2,3,5,6-四甲基吡嗪(TMP), 是從川芎的根莖中提取出的生物堿, 具有活血化瘀、抗血小板凝聚、改善微循環(huán)、擴(kuò)張小動(dòng)脈、抗氧化、抗組織器官纖維化等廣泛的藥理學(xué)作用。近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)研究表明,川芎嗪具有良好的抗肝纖維化作用, 可能與其抗脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)［1］, 但其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)觀察川芎嗪對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響, 進(jìn)一步探討其防治肝纖維化的作用機(jī)制, 為臨床治療肝纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性SD大鼠24只, 清潔級(jí), 體重(200±20) g, 購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心, 普通飼料喂養(yǎng), 自由進(jìn)水。四氯化碳(CCl4)為中邦化工分析純；產(chǎn)色基質(zhì)偶氮法鱟試劑盒購(gòu)自廈門(mén)市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司；谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)、丙二醛(MDA)TBA法試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；羥脯氨酸(hydroxyproline, HYP )標(biāo)準(zhǔn)品、天狼猩紅、固綠FCF購(gòu)自Sigma公司；鹽酸川芎嗪注射液(鄭州卓峰制藥有限公司) ；兔抗NFE2抗體購(gòu)自武漢博士德；小鼠抗β-actin、山羊抗小鼠IgG/HRP、山羊抗兔IgG/HRP抗體購(gòu)自北京中杉金橋。

1. 2 動(dòng)物分組及處理 將健康清潔級(jí)SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后, 隨機(jī)分為三組, A組(正常對(duì)照組)、B組(肝纖維化模型組)、C組(川芎嗪治療組)。A組不給予特殊處理, B、C組首次給予5 ml/kg體重CCl4分析純皮下注射, 然后按3 ml/kg體重皮下注射40% CCl4植物油(V/V)混合液, 每周2次, C組于造模同時(shí)給予腹腔注射60 mg/kg鹽酸川芎嗪注射液, 每周6次。6周后, 在乙醚麻醉無(wú)菌無(wú)熱源條件下, 腹主動(dòng)脈采血取血漿測(cè)定血漿內(nèi)毒素水平；取肝左葉一部分于4%多聚甲醛中固定, 24 h后流水沖洗、脫水、石蠟包埋, 行肝組織形態(tài)學(xué)檢測(cè), 其余部分于-86℃ 保存用于下述指標(biāo)檢測(cè)。1. 3 指標(biāo)檢測(cè)及分析 石蠟包埋組織切片, 天狼猩紅膠原染色及常規(guī)HE染色。JD-801形態(tài)學(xué)圖像采集分析系統(tǒng)觀察分析, 計(jì)算肝組織的FI (纖維化指數(shù), FI=纖維染色區(qū)面積/整個(gè)視野面積×100%)；肝組織HYP含量測(cè)定參照本實(shí)驗(yàn)室以往改良的氯胺T法［2］；血漿內(nèi)毒素及肝組織MDA、GST含量測(cè)定依照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作；Western-blotting檢測(cè)肝組織中Nrf2的表達(dá)量, 根據(jù)目的條帶與內(nèi)參β-actin積分光密度比值行半定量分析。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件, 數(shù)據(jù)以(±s)表示, 行單因素方差分析(One-way ANOVA), LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較, 以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 形態(tài)學(xué)觀查 正常對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)清晰, 肝小葉結(jié)構(gòu)正常, 膠原少, 主要分布在血管壁；肝纖維化模型組肝細(xì)胞變性, 肝竇及匯管區(qū)結(jié)構(gòu)破壞, 膠原組織明顯增多；川芎嗪治療組肝細(xì)胞變性較肝纖維化模型組輕, 膠原形成較肝纖維化模型組少。

2. 2 川芎嗪治療組與肝纖維化模型組相比血漿內(nèi)毒素, 肝組織HYP、MDA和肝纖維化指數(shù)均降低, GST含量升高, Nrf2表達(dá)量增加(見(jiàn)表1)。

表1 各組大鼠血漿ET及肝組織HYP、MDA、GST、FI的變化( ±s)

表1 各組大鼠血漿ET及肝組織HYP、MDA、GST、FI的變化( ±s)

注：與正常對(duì)照組比較, aP<0.01, bP<0.05；與正常對(duì)照組比較, cP<0.01；與肝纖維化模型組比較, dP<0.01；與肝纖維化模型組比較, eP<0.05

組別 n ET HYP MDA GST FI Nrf2(Nrf2/β-actin)正常對(duì)照組 8 0.22±0.04 0.08±0.15 2.31±0.57 66.42±8.58 0.32±0.08 0.34±0.27肝纖維化模型組 8 0.78±0.29a 0.35±0.19a 14.86±2.11a 86.02±15.60a 5.25±0.56a 0.43±0.31b川芎嗪治療組 8 0.41±0.08bd 0.19±0.09cd 4.86±0.95cd 105.55±10.47cd 4.23±0.54ad 0.54±0.78be

3 討論

研究表明, 氧化應(yīng)激與肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)［3］。氧化應(yīng)激主要通過(guò)啟動(dòng)膜脂質(zhì)過(guò)氧化改變生物膜功能、與生物大分子共價(jià)結(jié)合及破壞酶的活性等在細(xì)胞因子的共同作用下引起不同程度的肝損傷, 同時(shí)活化肝星狀細(xì)胞, 促進(jìn)肝纖維化。所以抗氧化治療對(duì)防治肝臟疾病起著重要的作用［4,5］。

Nrf2(NF-E2-related factor 2)/ARE(antioxidant response element)是近年新發(fā)現(xiàn)的機(jī)體抵抗內(nèi)外氧化和化學(xué)等刺激的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路．生理狀態(tài)下, Nrf2與胞漿蛋白伴侶分子Keap1結(jié)合使活性處于相對(duì)抑制狀態(tài), 氧化應(yīng)激作用下, Nrf2與Keap1解偶聯(lián)后轉(zhuǎn)移入核, 啟動(dòng)ARE調(diào)控的Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶的表達(dá), 如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、血紅素氧合酶-1(HO-1)等, 從而增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抗性, 為肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展起到積極的防護(hù)作用［4］。有研究發(fā)現(xiàn), 在Nrf2敲除的小鼠中,正常情況和誘導(dǎo)情況下的Ⅱ相酶水平如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、還原型輔酶Ⅰ醌類(lèi)氧化還原酶(NQO1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)顯著減少［6］。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群研究中發(fā)現(xiàn), Nrf2與各種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近來(lái)研究表明, 一些藥物可激活Nrf2改善各種肝臟疾病?？诜S素可誘導(dǎo)Nrf2與ARE元件結(jié)合, 繼而啟動(dòng)HO-1表達(dá), 保護(hù)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝損傷［7］。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn), 中藥川芎中的有效成分川芎嗪在治療肝纖維化中發(fā)揮了較好的治療效果。它可以抗肝細(xì)胞損傷和抗脂質(zhì)過(guò)氧化, 抑制HSC的增殖與活化, 對(duì)肝纖維化形成起主要作用的信號(hào)通路如TGF-β、PDGF等信號(hào)通路的抑制,抑制肝細(xì)胞凋亡等, 從而有效發(fā)揮抗肝纖維化作用。實(shí)驗(yàn)證明［8］, 川芎嗪能降低肝纖維化大鼠肝組織中丙二醛水平, 顯著減輕肝臟膠原纖維增生程度,防止和延緩實(shí)驗(yàn)性肝纖維化作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)川芎嗪干預(yù)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化, 檢測(cè)血漿內(nèi)毒素含量, 肝組織中Nrf2、GST及MDA的含量, 進(jìn)一步探討川芎嗪抗肝纖維化的作用機(jī)制。結(jié)果顯示, 川芎嗪治療組與肝纖維化模型組相比, 肝纖維化程度減輕, 血漿內(nèi)毒素內(nèi)毒素含量減少, 肝組織Nrf2、GST含量增加, MDA含量減少, 提示川芎嗪抗肝纖維化機(jī)制還可能與降低腸源性內(nèi)毒素血癥, 激活Nrf2/ARE抗氧化通路, 上調(diào)Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶表達(dá)有關(guān), 從而為川芎嗪的臨床應(yīng)用提供更加充實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ 馬進(jìn),鄭仕中, 陸茵,等.川芎嗪抑制肝纖維化作用機(jī)制的研究進(jìn)展.中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 2010(05):395-398.

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Effect of ligustrazine on Nrf2/ARE pathway in liver tissue of hepatic fibrosis rats induced by CCl4

DU Li-juan, XU Jun-quan, SONG Bin-Yu, et al. Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

Objective To explore the effect of ligustrazine on Nrf2/ARE pathway in liver tissue of hepatic fibrosis rats induced by CCl4 for studying the mechanism of its effect on hepatic fibrosis.MethodsHepatic fibrosis in rats was induced by carbon tetrachloride, rats were randomly divided into normal control group, hepatic fibrosis group and treatment group. treatment group rats were given ligustrazine intraperitoneally everyday while inducing hepatic fibrosis by carbon tetrachloride. After 6 weeks, rats were killed for collecting blood and liver tissues. Endotoxin in blood plasma was measured with a limulus amebocyte lysate test kit. The pathological changes of liver were observed by hematoxylin-eosin staining, the degree of liver fibrosis was assessed by stained of Sirius red for collgen and the contents of hydroxyproline in liver tissues. Nrf2 protein expression in liver tissues was detected by West-blotting method. The contents of malondialdehyde(MDA) in liver tissues were determined by TBA method, glutathione S-transferase(GST) by colorimetric enzymatic assay.ResultsFibrotic changes in liver of treatment group were ameliorated significantly compared with the hepatic fibrosis model group, and the content of plasma endotoxin were reduced, liver expression of Nrf2 was increased as well as GST, MDA was reduced accordingly.ConclusionThe protective effect of ligustrazine on liver fibrosis is possibly related to reducing endotoximia and activating Nrf2/ARE pathway in liver, thus increasing the content of antioxidant enzymes such as GST.

Hepatic fibrosis; Ligustrazine; Antioxidant; NF-E2-Related Factor 2; Endotoxin

030001 太原, 山西醫(yī)科大學(xué)(杜麗娟)；山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院(徐軍全 宋彬妤 康杰 姚瑞強(qiáng) 王明亮)

徐軍全 E-mail：xujq@ sina.com