曹龍輝,李曉珺,趙文紅,2*,朱豪,洪澤淳
(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東廣州510225;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州510642)
麥角甾醇的研究進(jìn)展
曹龍輝1,李曉珺1,趙文紅1,2*,朱豪1,洪澤淳1
(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東廣州510225;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州510642)
麥角甾醇主要存在于酵母菌、霉菌等真菌和某些植物中,是一種重要的植物甾醇,具有重要的生理作用,是食品、飼料及醫(yī)藥等工業(yè)中常用的一種原料。文章總結(jié)近十年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)麥角甾醇的研究狀況,分別對(duì)麥角甾醇的生物合成途徑、高產(chǎn)麥角甾醇菌株的選育和麥角甾醇的萃取方法予以綜述,為進(jìn)一步研究麥角甾醇提供參考。
麥角甾醇;生物合成;菌株選育;萃取
麥角甾醇,別名麥角固醇,為白色或無(wú)色光亮的小葉晶或白色結(jié)晶粉末。麥角甾醇不但具有獨(dú)特的生理作用,還被廣泛應(yīng)用到藥物的開發(fā)中。麥角甾醇作為真菌細(xì)胞膜的重要組成成分,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,專一性強(qiáng),對(duì)測(cè)定生物量來(lái)說(shuō),它比葡糖胺更具代表性[1],所以可以通過(guò)檢測(cè)麥角甾醇的含量來(lái)測(cè)量真菌的生物量[2]。目前,麥角甾醇的來(lái)源主要通過(guò)微生物發(fā)酵合成得到,近年來(lái)也有學(xué)者從一些菌絲體中提取。我國(guó)研究麥角甾醇機(jī)能的時(shí)間較遲,生產(chǎn)工藝相對(duì)落后,年產(chǎn)量不能滿足消費(fèi)者的需求,需要從國(guó)外進(jìn)口,但從總體來(lái)看,我國(guó)對(duì)麥角甾醇的需求量呈逐年上升的趨勢(shì)。因此,對(duì)麥角甾醇的開發(fā)和利用具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
麥角甾醇化學(xué)名為24β-甲基膽固醇-5,7烯-3β-羥基,分子式為C28H44O,強(qiáng)氧化劑能破壞麥角甾醇,遇到光和空氣中的氧時(shí),即使在常溫下也會(huì)被氧化而發(fā)黑。麥角甾醇不溶于水,但易溶于有機(jī)溶劑(三氯甲烷、乙醇、乙醚等)。
麥角甾醇是微生物細(xì)胞膜的重要組成部份,對(duì)確保細(xì)胞活力、膜的流動(dòng)性、膜結(jié)合酶的活性、膜的完整性以及細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸?shù)绕鹬匾饔肹3]。具有良好的流動(dòng)性的酵母細(xì)胞膜,具有較高的耐凍能力[4]。宋振玉等[5]研究指出,低糖適應(yīng)性耐凍酵母菌的麥角甾醇含量明顯高于普通酵母。目前的大多數(shù)常用的抗真菌藥物都是針對(duì)麥角甾醇生物合成中必需的關(guān)鍵酶設(shè)計(jì)的抑制劑,其通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地與關(guān)鍵酶結(jié)合,抑制麥角甾醇合成,使真菌的細(xì)胞膜受到破壞,從而抑制真菌的生長(zhǎng)繁殖。
麥角甾醇可以增強(qiáng)人體抵抗疾病的能力,是重要的脂溶性維生素D2源,具有明顯的抑菌、抗腫瘤[6]功效。而轉(zhuǎn)化物維生素D2可以作為飼料添加劑添加在飼料中,增加畜禽的產(chǎn)蛋率和孵化率[3]。麥角甾醇也可以作為重要的醫(yī)藥化工原科,用于生產(chǎn)“可的松”、“激素黃體酮”等甾醇類藥物。
麥角甾醇的合成途徑主要分為4個(gè)關(guān)鍵步驟,首先是甲羥戊酸的生物合成。甲羥戊酸是膽甾醇、萜烯(terpene)類等類戊二烯生物合成的重要中間體,由乙酰輔酶A縮合成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A,HMGCoA)后,經(jīng)還原并脫去輔酶A而產(chǎn)生;其次是甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為角鯊烯,接著角鯊烯環(huán)化形成羊毛甾醇;最后羊毛甾醇轉(zhuǎn)化為麥角甾醇,這是相比前三個(gè)步驟較為復(fù)雜的一個(gè)過(guò)程,其中參與的基因和酶有很多種[7]。途徑中的每個(gè)基因與生物體的生存密不可分,這些基因分為2種:必需基因和非必需基因,在合成途徑前期的一些基因如ERG9、ERG1、ERG7、ERG11、ERG24、ERG25、ERG 26、ERG 27被當(dāng)作是必需基因,而其他基因則被當(dāng)作是非必需基因[7]。ERG9基因編碼角鯊烯合成酶[7-8],催化2分子焦磷酸法呢酯形成麥角甾醇生物合成途徑中第一個(gè)甾醇分子,是麥角甾醇合成的直接前提[8];ERG1基因和ERG7基因分別編碼角鯊烯環(huán)氧酶和羊毛甾醇合成酶[7-8],這兩種酶在麥角甾醇的合成途徑中是兩個(gè)重要、獨(dú)特而且必需的酶;ERG6基因高表達(dá)的重組酵母菌,不但可以補(bǔ)償ERG2基因高表達(dá)對(duì)甾醇合成的負(fù)效應(yīng),而且進(jìn)一步提高了麥角甾醇含量[9]。ERG2基因和ERG24基因是酵母甾醇生物合成基因,分別編碼C-8固醇異構(gòu)酶和C-14還原酶[7-8,10],是嗎啉抗真菌化合物的目標(biāo),酵母ERG24基因編碼的C-14還原酶是有氧酵母生存必不可少的[10],而進(jìn)一步的遺傳分析表明,ERG24基因結(jié)合突變ERG6基因或ERG28基因可以致死[11]。
生物體內(nèi)合成麥角甾醇是多種酶參與的復(fù)雜的代謝過(guò)程,至少涉及到15種酶的參與[7]、23步反應(yīng)以及25個(gè)結(jié)構(gòu)基因,由于各反應(yīng)在整個(gè)代謝途徑中的位置不同,在代謝調(diào)控中的作用不同,因此相關(guān)基因高效表達(dá)的效果也不盡相同。有些基因與麥角甾醇的合成起協(xié)同作用,而有些基因的高度表達(dá)則抑制麥角甾醇的合成。
國(guó)內(nèi)外麥角甾醇的生產(chǎn)主要采用微生物發(fā)酵法,目前大量生產(chǎn)麥角甾醇主要的菌株是酵母菌,也有利用曲霉等生產(chǎn)。菌株的種類影響最后麥角甾醇產(chǎn)量的多少,高產(chǎn)菌株的篩選方法有很多,最常見的有自然選育、誘變選育、原生質(zhì)體融合和基因工程4種。
3.1 自然選育
自然選育是從現(xiàn)有菌株中篩選高產(chǎn)菌株,是選育優(yōu)良菌株的基本方法[12]。楊婉身等[13]介紹一種快速、簡(jiǎn)便、可靠的篩選麥角固醇高產(chǎn)酵母菌株的方法,就是將自溶后的酵母菌用超聲波破碎,用乙醚萃取其所含麥角甾醇,利用乙酸酐在酸性條件下與麥角甾醇生成綠色化合物的原理,可直接根據(jù)綠色深淺來(lái)判斷菌株的優(yōu)劣。朱效剛等[14]對(duì)16株產(chǎn)麥角甾醇的紅曲菌進(jìn)行篩選,得到一株產(chǎn)麥角甾醇較高的紅曲菌SJS-20,并對(duì)其產(chǎn)麥角甾醇的條件進(jìn)行了優(yōu)化,每克干曲中可含8.1mg的麥角甾醇。宋文霞等[15]篩選到一株產(chǎn)麥角甾醇的紅酵母,這株菌株可以獲得0.338 3g/100mL的麥角甾醇,每克干菌絲體中麥角甾醇的含量最多可達(dá)3.612g。
3.2 誘變選育
誘變選育是利用能提高誘發(fā)基因突變頻率的誘變劑對(duì)菌株進(jìn)行處理,誘變劑的種類一般可分為3類:物理誘變、化學(xué)誘變和生物誘變。這種方法可以直接獲得高產(chǎn)麥角甾醇的菌株,并且誘變產(chǎn)生的菌株效果比較理想,但誘變選育的隨機(jī)性太大,整個(gè)過(guò)程耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng),且誘變選育的工作量非常大,結(jié)果具有不確定性。張滄桑等[16]通過(guò)氦氖(He-Ne)激光和紫外線對(duì)釀酒酵母S-12進(jìn)行誘變,得到了可產(chǎn)麥角甾醇含量達(dá)2.39%的突變株S-97-71。謝宗良[17]從63株酵母菌中篩選出高產(chǎn)麥角甾醇的菌株“石-3”,并對(duì)其進(jìn)行化學(xué)和物理誘變,從120株誘變菌株中得到麥角甾醇高產(chǎn)菌株“石-3-57”,其菌體中的麥角甾醇含量高達(dá)0.34g/L,比“石-3”菌株中的含量提高了11.5%。
3.3 原生質(zhì)體融合
原生質(zhì)體融合方法突破了傳統(tǒng)方法的一些局限性,其是將擁有高生物量和麥角甾醇含量等優(yōu)良性狀的菌株的單倍體進(jìn)行原生質(zhì)體融合,從而獲得優(yōu)于親株的融合子。劉波等[18]以麥角甾醇含量較高的釀酒酵母和細(xì)胞生物量較高產(chǎn)阮假絲酵母為親本菌,通過(guò)原生質(zhì)體電融合,篩選得到融合子PF-4菌株,經(jīng)測(cè)定其麥角甾醇含量達(dá)到2.01%,比親本菌株的含量要高。熊寧波[19]從10個(gè)不同種屬的酵母菌中,篩選得到生物量較高的酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)和麥角甾醇含量較高的酵母菌(Saccharomyces kluyveri),經(jīng)甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)誘變這兩種菌株分離得到的單倍體后得到TK15-94-33、TK63-41-72菌株,然后以這兩種菌株為親本進(jìn)行原生質(zhì)體融合得到一株具有兩親株優(yōu)良特性的菌株TKF37,經(jīng)過(guò)檢測(cè),TKF37的麥角甾醇含量為2.12%,生物量為3.7lg/100mL。
3.4 基因工程
基因工程可以對(duì)菌株體內(nèi)特性的基因及其特定編碼表達(dá)的酶進(jìn)行改造,控制麥角甾醇在整個(gè)代謝過(guò)程的表達(dá)方向,獲得高產(chǎn)麥角甾醇的基因工程菌株。宮莉等[20]對(duì)麥角甾醇酵母基因工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行研究,并在實(shí)驗(yàn)中得到了高達(dá)3.05%的麥角甾醇含量。孟云霞等[21]研究了ERG6基因片段的表達(dá)對(duì)酵母菌合成麥角甾醇的影響,釀酒酵母單倍體菌株YS58用載體質(zhì)粒YEp352和表達(dá)質(zhì)粒pPERG6轉(zhuǎn)化,得到重組菌株YS58(pPERG6),而重組菌株YS58(pPERG6)的生物量和麥角甾醇含量分別是對(duì)照菌YS58(YEp352)的1.23和1.32倍,進(jìn)一步證明了甾醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶活性的高度表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)胞合成麥角甾醇的能力。利用現(xiàn)代生物技術(shù)提高酵母細(xì)胞合成麥角甾醇含量、降低生產(chǎn)成本是以后研究的新思路,由于這種技術(shù)花費(fèi)的成本較高,技術(shù)難度大,所以還沒(méi)有得到廣泛應(yīng)用,隨著麥角甾醇的生物合成途徑被揭示,基因工程將會(huì)成為選育麥角甾醇高產(chǎn)菌株的一種非常重要、新穎的手段。
酵母菌是生產(chǎn)麥角甾醇最主要的菌種,菌種的優(yōu)劣直接關(guān)系到麥角甾醇產(chǎn)量的多少。經(jīng)研究證明,培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH和溫度以及無(wú)機(jī)鹽[22]等對(duì)酵母菌株生產(chǎn)麥角甾醇起著至關(guān)重要的作用。除了發(fā)酵條件和麥角甾醇合成酶系的研究之外,篩選高產(chǎn)麥角甾醇的菌株同樣是亟待解決的問(wèn)題,由于各個(gè)生物體合成麥角甾醇的能力存在顯著的差異,因此,必須通過(guò)不同的方法來(lái)誘導(dǎo)、篩選出高產(chǎn)麥角甾醇的菌株。工業(yè)中采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)麥角甾醇,但得率一般在2%以下,使得企業(yè)的生產(chǎn)成本花費(fèi)較高,造成資源浪費(fèi)。而經(jīng)過(guò)篩選出來(lái)的菌株,麥角甾醇的含量明顯有所提升?;葚S立等[23-24]從12株產(chǎn)麥角甾醇的酵母菌中,篩選出的一株產(chǎn)量較高的酵母菌YN2,經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)條件后得到2.2%麥角甾醇,生物量稍微有所提升;張博潤(rùn)[25]篩選出一株高產(chǎn)麥角甾醇酵母工程菌,大大提高了生產(chǎn)得率,降低了生產(chǎn)成本;張毅[26]則篩選出一株釀酒酵母scut-B6305,該酵母麥角甾醇高產(chǎn)菌株的單位細(xì)胞麥角固醇含量達(dá)到5.63mg/g,比出發(fā)菌株提高了30.32%。
5.1 皂化回流法
在皂化萃取麥角甾醇的過(guò)程中,影響麥角甾醇產(chǎn)率的因素很多,皂化劑、皂化溫度、純堿比都是影響麥角甾醇收率的重要因素,皂化萃取時(shí),可以加入一些低級(jí)醇,提高皂化反應(yīng)的反應(yīng)速率[27]。因?yàn)榫晟硖匦缘牟顒e,各文獻(xiàn)中的皂化具體條件差別較大,為了得到最佳皂化條件,姚廣印等[28]對(duì)酵母產(chǎn)麥角甾醇的具體提取方法進(jìn)行研究,并在各類菌株上進(jìn)行驗(yàn)證,最后對(duì)比其他方法,提出了對(duì)麥角甾醇進(jìn)行皂化提取的最佳方法。韓慶雪等[27]以皂化溫度、堿濃度、醇?jí)A比和物料皂化劑比等因素作為研究對(duì)象,分析得出乙醇在皂化液中的比例是影響麥角甾醇萃取效率的主要因素。而薛冬樺等[29]研究認(rèn)為,乙醚相比乙醇、氯仿、正庚烷3種有機(jī)溶劑是比較好的萃取劑。作為最傳統(tǒng)的萃取方法,皂化回流法成本低、耗能少、操作方便,但這種方法萃取麥角甾醇的缺點(diǎn)是有機(jī)溶劑的使用量大,生產(chǎn)成本高,而且生產(chǎn)管理要求嚴(yán)格,安全系數(shù)小。因此,研究一種簡(jiǎn)便快速、無(wú)毒安全的綠色萃取技術(shù),對(duì)酵母中麥角甾醇的測(cè)定十分必要。李敏等[30]在乙醇?jí)A皂化體系中加鹽形成雙水相體系,用雙水相萃取代替?zhèn)鞯囊颐?、石油醚或正庚烷的溶劑萃取,不需再加任何溶劑,不僅價(jià)廉、無(wú)毒,而且更簡(jiǎn)便、快速,具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。相比其他方法,皂化回流法仍然有著不可比擬的優(yōu)勢(shì),因此也是萃取麥角甾醇最常用的方法之一。
5.2 超聲波、微波萃取法
超聲波萃取法省時(shí)、節(jié)能、高效,并且可以避免高溫對(duì)提取物的影響。影響超聲波萃取麥角甾醇的關(guān)鍵有4個(gè)因素,分別是浸提液、浸提反應(yīng)溫度、超聲波振動(dòng)時(shí)間以及浸提比。蔣嵐等[31]利用超聲波處理從古尼擬青霉菌絲體中獲得7.84mg/g的麥角甾醇;謝翎等[32]利用三氯甲烷作為浸提劑,超聲波處理30min,每克干菌絲可獲得7mg左右的麥角甾醇。微波萃取的速度比常規(guī)方法快約6倍,并且可以克服其他方法樣品和試劑使用量大等缺點(diǎn),MONTGOMERY H J等[33]使用微波萃取土壤中的麥角甾醇,首次使用這種方法來(lái)分析土壤中真菌的生物量。
5.3 超臨界流體CO2萃取法
超臨界流體CO2萃取法因具有安全、潔凈、穩(wěn)定、提取的產(chǎn)品質(zhì)量高和產(chǎn)品成分不易受到干擾而被廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥等工業(yè)中,是近年來(lái)出現(xiàn)的一種基于水溶性高聚物的新型萃取體系[34]。宋師花等[35]通過(guò)對(duì)超臨界CO2萃取法提取靈芝中麥角甾醇進(jìn)行研究,結(jié)果表明,超臨界流體CO2萃取法可以跟傳統(tǒng)的方法取得同等的效果,證實(shí)了超臨界流體CO2萃取法在實(shí)際應(yīng)用中的作用,為麥角甾醇的提取提供了一種全新、可靠、可行的方法。
超臨界CO2萃取分離技術(shù)是一種很有前途的綠色環(huán)保技術(shù),能提供更高的選擇性,縮短萃取時(shí)間,并且不使用有毒的有機(jī)溶劑,超臨界流體萃取法有可能取代傳統(tǒng)使用有機(jī)溶劑萃取的方法[36]。實(shí)際使用中常與高效液相色譜法、氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用等檢測(cè)方法結(jié)合,能提高對(duì)天然產(chǎn)物活性成分含量測(cè)定的效率與精確度,對(duì)于促進(jìn)超臨界CO2萃取技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展具有十分重要的意義。
麥角甾醇作為一種安全、營(yíng)養(yǎng)、滋補(bǔ)的天然產(chǎn)物,在現(xiàn)今食品問(wèn)題頻繁出現(xiàn)的情況下越顯得符合人們生活水平提高后渴望無(wú)公害的產(chǎn)品的期望。麥角甾醇在醫(yī)藥、化工、食品中應(yīng)用廣泛,是一種潛在的具有豐富的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和研究?jī)r(jià)值的代謝物,研究麥角甾醇具有重大的意義。在今后的研究,對(duì)麥角甾醇可以從以下3個(gè)方面進(jìn)一步研究:(1)篩選高產(chǎn)麥角甾醇的菌株,利用微生物生長(zhǎng)周期短,繁殖能力強(qiáng),安全易提取等特點(diǎn)大量生產(chǎn)麥角甾醇;(2)運(yùn)用生物技術(shù)等現(xiàn)代科技弄清麥角甾醇的合成機(jī)制,為麥角甾醇的生產(chǎn)提供進(jìn)一步的理論基礎(chǔ);(3)開發(fā)新的提取和檢測(cè)方法,提高麥角甾醇的產(chǎn)量。
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Research progress on ergosterol
CAO Longhui1,LI Xiaojun1,ZHAO Wenhong1,2*,ZHU Hao1,HONG Zechun1
(1.College of Light Industry and Food Science,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225; 2.College of Food Science,South China Agriculture University,Guangzhou 510642)
Ergosterol is an important plant sterol and plays an important physiological role in yeast,mold,other fungi and certain plants.It is commonly used as a raw material in food,feed and pharmaceutical industries.The ergosterol research status home and abroad in the last decade was summarized;meanwhile,the ergosterol biosynthetic pathway,the extraction method and ergosterol breeding high-yielding strains of ergosterol were reviewed to provide a reference for the further study.
ergosterol;biosynthesis;strains breeding;extraction
TS201.3
A
0254-5071(2014)04-0009-04
10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.003
2014-02-28
國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2011GA780013)
曹龍輝(1990-),男,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。
*通訊作者:趙文紅(1966-),女,教授,碩士,研究方向?yàn)槭称费芯颗c開發(fā)。