中國(guó)飼料工業(yè)協(xié)會(huì) 王黎文 譯

1 前言

眾所周知，腸球菌是胃腸道的人畜共生菌，與許多動(dòng)物一樣，多數(shù)人群一般都會(huì)攜帶。人類腸球菌感染包括心內(nèi)膜炎、尿路感染以及由糞便微生物污染造成的腹腔或盆腔感染（Murray，2000），但感染發(fā)生在醫(yī)院等醫(yī)療機(jī)構(gòu)之外的病例極為罕見。

在當(dāng)今醫(yī)療機(jī)構(gòu)中，腸球菌菌株通常是從感染病例分離回收獲得。第一次大范圍的與醫(yī)院有關(guān)的腸球菌感染 （主要是糞腸球菌）是在20世紀(jì)80年代伴隨對(duì)廣譜頭孢菌素的使用（腸球菌對(duì)其有抗性）以及免疫系統(tǒng)受損病人數(shù)量的增加而產(chǎn)生，這也是腸球菌感染的主要原因。廣譜頭孢菌素殺死了胃腸道中的大多數(shù)固有微生物，但由于腸球菌對(duì)其具有抗性而存活下來。因此，腸球菌菌群存在于大多數(shù)住院病人的腸道內(nèi)，且數(shù)量巨大。植入導(dǎo)管、免疫抑制以及化療導(dǎo)致的黏膜發(fā)炎等影響因素改變了以往宿主的菌群平衡，進(jìn)而促進(jìn)了菌體感染的發(fā)生。患者的抗生素使用似乎是引發(fā)可控共生菌感染的關(guān)鍵因素（Ubeda 等，2010；Murray，2000）。

在20世紀(jì)90年代初，醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床分離得到的腸球菌中，90%～95%為糞腸球菌，僅有5%為屎腸球菌。在過去的15～20年中，美國(guó)從醫(yī)療機(jī)構(gòu)感染區(qū)域分離得到的屎腸球菌已經(jīng)明顯增多，目前大約已占35%。與此同時(shí)，相對(duì)于社區(qū)環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的屎腸球菌而言，源于醫(yī)療機(jī)構(gòu)的屎腸球菌分離株對(duì)氨芐青霉素和哌拉西林具有更為普遍的抗性。在美國(guó)還發(fā)現(xiàn)，這一具有氨芐青霉素抗性的屎腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素也具有抗性。目前，70%來自美國(guó)醫(yī)療機(jī)構(gòu)的屎腸球菌分離株具有萬(wàn)古霉素抗性，而90%具有氨芐青霉素抗性。相反，僅1%～5%的糞腸球菌對(duì)這兩種抗生素具有抗性，這可能是醫(yī)療機(jī)構(gòu)中屎腸球菌相對(duì)于糞腸球菌增多的原因，即主要是由于頻繁使用對(duì)糞腸球菌有抑制作用的抗生素所導(dǎo)致的 （Bertics等，2009；Hidron 等，2008）。

在歐盟，具有萬(wàn)古霉素抗性的屎腸球菌菌株（VER）是在20世紀(jì)80年代首次被檢出，這些菌株是從使用糖肽阿伏霉素的養(yǎng)殖場(chǎng)動(dòng)物的糞便中分離得到的，其中大多數(shù)是氨芐青霉素敏感菌株。從動(dòng)物源性食品和健康人群的糞樣中也分離得到了屎腸球菌菌株。然而，上述屎腸球菌菌株在醫(yī)院之外的感染很少見。最近，在歐盟的住院患者中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有氨芐青霉素抗性的屎腸球菌，其中部分像早些時(shí)候在美國(guó)一樣，也已經(jīng)獲得了萬(wàn)古霉素的抗性，而且在醫(yī)療機(jī)構(gòu)中的感染頻率正在上升，現(xiàn)在占到醫(yī)院腸球菌感染的40%～50% （Werner 等 ，2008；Top 等 ，2007；Leavis等，2003；Bonten 等，2001）。

目前已經(jīng)認(rèn)可屎腸球菌由兩個(gè)不同的亞種或分支組成，并且分支可能早在成千上萬(wàn)年前就已經(jīng)形成。這些分支可以通過多位點(diǎn)序列分型（MLST）來區(qū)分，即通過共有核心基因的序列比對(duì)、是否含有IS16插入序列和其他獲得元件，以及是否具有對(duì)氨芐青霉素的抗性來判定菌種屬于哪個(gè)分支。其中一個(gè)亞種（2012年P(guān)almer等根據(jù)全基因組系統(tǒng)發(fā)生法將其稱為B分支）主要是從健康人群糞便中分離得到的，且對(duì)氨芐青霉素敏感；另一個(gè)亞種（A分支）包括多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床分離的具有氨芐青霉素抗性的菌株 （Palmer等，2012；Galloway-P en～a 等 ，2011；Willems 和 van Schaik，2009；Leavis等，2007），同時(shí)，A 分支也包括具有氨芐青霉素抗性的來自于狗的分離菌株（De Regt等，2012）。 根據(jù)MLST數(shù)據(jù)進(jìn)行菌群遺傳分析后預(yù)測(cè)，源于養(yǎng)殖動(dòng)物的氨芐青霉素敏感菌株也將歸至A分支。

2 屎腸球菌的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和基因組學(xué)

屎腸球菌的進(jìn)化關(guān)系分析大多采用MLST法，該方法中等位基因圖譜依據(jù)7個(gè)看家基因序列而測(cè)定 （Homan等，2002）。第一個(gè)關(guān)于屎腸球菌種群結(jié)構(gòu)的MLST研究是針對(duì)全球范圍收集的人類來源（醫(yī)院和社區(qū)分離的）和非人類來源（動(dòng)物和環(huán)境中分離的）屎腸球菌菌株進(jìn)行的表征研究，同時(shí)定義了175個(gè)序列類型 （STs）。用e-BURST軟件對(duì)序列類型進(jìn)行分組，將任意大小的MLST數(shù)據(jù)集分解成與分離株相關(guān)或與克隆復(fù)合體（CCs）相關(guān)的數(shù)據(jù)組，并預(yù)測(cè)每一個(gè)CC的起源基因型。該項(xiàng)研究表明，全球大多數(shù)醫(yī)院分離的代表性菌株，其基因型和進(jìn)化史關(guān)系都十分相近，同屬于某一CC，該CC被命名為CC17（Willems等， 2005）。

然而，根據(jù)當(dāng)前MLST數(shù)據(jù)庫(kù)（http://efaecium.mlst.net/）中所有有效的STs并利用eBURST軟件所推測(cè)出來的屎腸球菌的菌群結(jié)構(gòu)，是一個(gè)龐大的CC，包括先前命名的CC17，同時(shí)也包括次要的CC和序列。該數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋了69%的屎腸球菌的STs（Willems等，2011）。這些發(fā)現(xiàn)和基因組基礎(chǔ)研究表明，從醫(yī)院分離得到的屎腸球菌并不是最近才從單一的共同祖先進(jìn)化而來（van Schaik等，2010），因此，最初確定CC17為醫(yī)院屎腸球菌的CC很有可能是錯(cuò)誤的。

相反，從醫(yī)院分離得到的菌株構(gòu)成了一個(gè)多克隆屎腸球菌亞種，且具有明顯的進(jìn)化克隆體（Willems 等，2011；Willems 和 van Schaik，2009）。比較基因組雜交和基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌臨床分離株富含某幾個(gè)基因，其中最具代表性的就是 IS16插入序列 （van Werner等，2011；Schaik等，2010；Leavis等，2007）， 該基因可能賦予了屎腸球菌對(duì)其宿主一定程度的基因組適應(yīng)性，從而促進(jìn)其獲得與毒性或與抗生素抗性相關(guān)的額外基因元件。

MLST和基因組測(cè)序同時(shí)還揭示了來源于健康人群的菌株呈現(xiàn)一個(gè)明顯的區(qū)分簇 （Zhang等，2011；van Schaik 和 Willems，2010）。 這些菌株可能已經(jīng)適應(yīng)了哺乳動(dòng)物共生菌的生活。Galloway-Pen～a等（2011）也鑒定了屎腸球菌兩個(gè)主要亞種之間的區(qū)別，并以其對(duì)氨芐青霉素的抗性進(jìn)行表征。

3 氨芐青霉素抗性

事實(shí)上，從醫(yī)院感染患者分離得到的大多數(shù)屎腸球菌菌株屬于同一個(gè)分支，且與另一個(gè)分支明顯不同，兩個(gè)分支內(nèi)在本質(zhì)的區(qū)別可能能夠解釋其不同的感染情況。區(qū)別之一就是從醫(yī)院分離菌株具有氨芐青霉素抗性（MICs>128 mg/L），并引發(fā)菌株產(chǎn)生對(duì)哌拉西林的交互抗性以及對(duì)頭孢菌素的高度抗性。在經(jīng)常使用萬(wàn)古霉素、頭孢菌素和哌拉西林的醫(yī)院中，耐藥菌所具有的β-內(nèi)酰胺類藥物抗性和萬(wàn)古霉素的抗性為其提供了選擇優(yōu)勢(shì)（Murray，2000）。

此外，當(dāng)腸道中革蘭氏陰性細(xì)菌被抗生素抑制時(shí)，抗腸球菌宿主的凝集素RegIIIγ的負(fù)調(diào)節(jié)作用使得腸球菌得以增殖（Brandl等，2008）。

細(xì)胞壁合成酶通常被認(rèn)為是青霉素結(jié)合蛋白質(zhì)（PBPs），這是因?yàn)榍嗝顾赝ㄟ^結(jié)合這些蛋白質(zhì)，以削弱其細(xì)胞壁合成功能來抑制細(xì)胞壁的形成。PBP5是一種屎腸球菌細(xì)胞壁合成酶，其蛋白質(zhì)的編碼基因是屎腸球菌核心基因組的一部分。像屎腸球菌兩個(gè)分支的多數(shù)共有基因一樣，PBP5的編碼基因存在兩個(gè)等位基因，即pbp5-S和pbp5-R，二者的DNA序列有5%的差異。屎腸球菌中PBP5-S和PBP5-R的氨基酸序列差異是決定其是否具有氨芐青霉素抗性的主要因素。在已測(cè)序菌株中，從感染患者分離到的屎腸球菌菌株（分支A）具有pbp5-R基因，而社區(qū)健康人群中分離到的絕大多數(shù)屎腸球菌菌株（分支B）具有pbp5-S基因。進(jìn)一步研究比較氨芐青霉素對(duì)每個(gè)菌株pbp5基因的最低抑菌濃度（MIC）發(fā)現(xiàn)，32株氨芐青霉素MIC>4 mg/L的屎腸球菌菌株都具有pbp5-R基因，氨芐青霉素MIC<4 mg/L的屎腸球菌菌株具有pbp5-S基因，而在氨芐青霉素MIC=4 mg/L的屎腸球菌菌株中，有的含pbp5-R基因，有的含pbp5-S基因。因此，氨芐青霉素MIC≤2 mg/L能夠準(zhǔn)確地排除主要從病人處分離得到的菌株 （分支A），并排除胃腸道中對(duì)氨芐青霉素、阿莫西林或結(jié)構(gòu)類似的抗生素可能有選擇性優(yōu)勢(shì)的菌株（Galloway-等，2011；Rice等，2004）。

4 毒性因子和與醫(yī)院分離菌株有關(guān)的標(biāo)記物

腸球菌已經(jīng)被廣泛認(rèn)為是條件致病菌，尤其是屎腸球菌，它是醫(yī)療機(jī)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的幾乎唯一可引發(fā)感染的病原菌 （Willems和 van Schaik，2009）。很多可能與屎腸球菌毒性有關(guān)的因素已經(jīng)被確認(rèn)，但對(duì)于安全性評(píng)估，下列毒力因子和標(biāo)記物與安全性最為相關(guān)：

4.1 IS16（醫(yī)院分離菌株標(biāo)記物） IS因子是最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座因子，只編碼對(duì)其轉(zhuǎn)位所必需的酶。腸球菌有大量的可移動(dòng)遺傳元件，IS16可以在諸如Tn1547轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼等位置被發(fā)現(xiàn)，該因子使屎腸球菌具有萬(wàn)古霉素抗性。IS16是醫(yī)院分離的屎腸球菌亞種（分支A）的一個(gè)特殊的標(biāo)記物，同時(shí)也是臨床糞腸球菌分離株的標(biāo)記物 （Hegstad等，2010）。 Werner等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，97%的血培養(yǎng)屎腸球菌菌株顯示IS16陽(yáng)性，但是，僅4%的人畜共生菌菌株攜帶該因子。

4.2 Esp[致病島（PAI）標(biāo)記物] Esp 是一個(gè)約200 kDa的屎腸球菌表面蛋白，通過LPxTG型基序與細(xì)胞壁以共價(jià)鍵連接 （Heikens等，2007；Leavis等，2004）。esp基因是一個(gè)大型致病島（60～100 kbp）的一部分，該島同時(shí)攜帶其活動(dòng)基因（Top 等，2011；van Schaik 等，2010）。esp 基因在屎腸球菌生物膜的形成中發(fā)揮著重要作用（Heikens等，2007），并已有試驗(yàn)證明esp基因能夠促使模型動(dòng)物心內(nèi)膜炎 （Heikens等，2011）和尿路感染（Leendertse等，2009）的發(fā)生。esp基因廣泛存在于具有氨芐青霉素和萬(wàn)古霉素抗性的屎腸球菌分離株中（Vankerchoven 等，2004；Rice 等，2003）。

4.3 hyl-like基因 HylEfm最初被描述為一種透明質(zhì)酸酶，但最近被認(rèn)為是一種糖基水解酶。糖基水解酶可促進(jìn)腸道細(xì)菌菌群的定植（Freitas等，2010）。來自社區(qū)分支的菌株幾乎不含hyl-like基因的大質(zhì)粒，然而，醫(yī)院分離的菌株則通常具有該基因，比例約為30% （Rice等，2003）。hyl質(zhì)粒已被證明能夠提高小鼠胃腸道細(xì)菌的定植能力，同時(shí)提高腹膜炎模型小鼠的死亡率，因此，對(duì)至少一部分來自醫(yī)院分支中的菌株的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用（Panesso 等，2011；Rice 等，2009）。

5 評(píng)估

該評(píng)估的主要目的是將屬于醫(yī)院相關(guān)分支的菌株排除在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中使用的屎腸球菌之外，原因在于消費(fèi)者中的易感人群可能會(huì)受到其危害。

安全性評(píng)估之前，必須采用適當(dāng)?shù)姆肿訉W(xué)方法鑒定其確實(shí)屬于屎腸球菌，之后測(cè)定氨芐青霉素的最小抑菌濃度。

若MIC>2 mg/L，則該菌株被認(rèn)為是不安全的，不應(yīng)用作飼料添加劑。

若MIC≤2 mg/L，應(yīng)檢測(cè)菌株是否含有IS16、hylEfm和esp遺傳元件（方法見附錄）。

若檢測(cè)不到三個(gè)遺傳元件中的任意一種，那么該菌株用作飼料添加劑使用則可以認(rèn)為是安全的。

若檢測(cè)到三個(gè)遺傳元件中的一種或多種，那么該菌株則被認(rèn)為是不安全的，不應(yīng)用作飼料添加劑?！?/p>

附錄推薦方法

1 氨芐青霉素的MIC

測(cè)定氨芐青霉素的MIC時(shí)，應(yīng)采用瓊脂或肉湯培養(yǎng)基并運(yùn)用連續(xù)兩倍稀釋法，同時(shí)使用與之相關(guān)的質(zhì)量控制菌株。測(cè)試應(yīng)當(dāng)按照國(guó)際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，如歐盟委員會(huì)的抗生素敏感性測(cè)試（EUCAST）、臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）等機(jī)構(gòu)制定的標(biāo)準(zhǔn)或其他類似標(biāo)準(zhǔn)。菌體培養(yǎng)后，MIC被定義為抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗生素濃度。一般不允許采用定性或半定量方法來間接測(cè)定MIC，如擴(kuò)散法。

2 醫(yī)院分離菌株相關(guān)的標(biāo)記物檢測(cè)

如有可能，需要進(jìn)行包括染色體和質(zhì)粒在內(nèi)的全基因組分析，來篩查是否存在IS16、esp和hyl基因。此外，也可以采用以下方法來分析：

2.1 IS16 推薦使用 Werner等（2011）的方法來檢測(cè)IS16，并使用以下PCR引物：IS16-F（正向）5'-CATGTTCCACGAACCAGAG 和 IS16-R（反向）5'-TCAAAAAGTGGGCTTGGC（屎腸球菌的目標(biāo)片段預(yù)計(jì)為547 bp）。PCR分析應(yīng)使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照菌株，屎腸球菌DSMZ 25390可作為陽(yáng)性對(duì)照菌株，屎腸球菌DSMZ 25389可作為陰性對(duì)照菌株。

2.2 esp 檢測(cè)esp基因最好采用雜交技術(shù)，因?yàn)樵摲椒ê苌僖蕾囉谝锝Y(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)突變，而點(diǎn)突變可導(dǎo)致假陰性結(jié)果。制備探針的引物為：esp14F （正向）5'-AATTGATTCTTTAGCATCTGG-3'和esp12R（反向）5'-AGATTTCATCTTTGATTCTTGG-3'（Leavis等， 2003）。 Hendrickx 等（2007）描述了用于Southern印跡的雜交條件，而Rice等（2003）和Hendrickx等（2007）描述了用于斑點(diǎn)印跡的雜交條件。菌落裂解物也可以用于雜交 （Singh等，1998）。雜交分析應(yīng)使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照菌株，屎腸球菌DSMZ 25390可作為陽(yáng)性對(duì)照菌株，屎腸球菌DSMZ 25389可作為陰性對(duì)照菌株。

2.3 hylEfm 推薦使用Rice等（2003）的方法來檢測(cè)hylEfm基因，采用以下PCR引物：5'-GAGTAGAGGAATATCTTAGC-3' （nt 856-nt 875）和反向引物hylEfm 5'-AGGCTCCAATTCTGT-3'（nt 1517-nt 1503）[屎 腸 球 菌 ATCC BAA-472（TX16）的目標(biāo)片段預(yù)計(jì)為 661 bp]。

作為一種替代方法可以采用菌落裂解物雜交或 Southern印跡雜交法 （Rice等，2003；Singh等，1998）。基因探針的引物為：正向引物hylEfm（5'-GTT AGA AGA AGT CTG GAA ACC G-3'；nt 149-nt 170）， 反向引物hylEfm （5'-TGC TAA GAT ATT CCT CTA CTC G-3'；nt 876-nt 855）， 屎 腸 球 菌ATCC BAA-472（TX16）的目標(biāo)片段預(yù)計(jì)為727 bp。

PCR和雜交技術(shù)應(yīng)使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照菌株，屎腸球菌DSMZ 25390可作為陽(yáng)性對(duì)照菌株，屎腸球菌DSMZ 25389可作為陰性對(duì)照菌株。