·綜述·

免疫佐劑研究進展及前景展望

李學釗1，洪 煬2，王治倉1，李祥瑞3，宋鴻雁4

（1.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學院，武威 733006；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，南京 210095；4.南通大學實驗動物中心，南通 226019）

本文從免疫佐劑的發(fā)現(xiàn)、作用機理、發(fā)展進行論述，綜述了傳統(tǒng)免疫佐劑、細胞因子佐劑、天然來源佐劑及新型免疫佐劑的類別與免疫機理，并就免疫佐劑的發(fā)展前景進行了展望。

疫苗；免疫佐劑；免疫機理

疫苗（vaccine）是用于預防傳染病的抗原制劑。通常用鈍化、弱化或無害的病原體或其產(chǎn)物制成，用以刺激機體產(chǎn)生保護性免疫力[1]。傳統(tǒng)疫苗中含有的一些滅活或者低活性的微生物會導致疫苗在使用過程中產(chǎn)生副作用，而通過現(xiàn)代生物技術(shù)獲得的重組蛋白和人工合成的多肽雖然比滅活疫苗更為安全，但是其免疫效果比滅活疫苗差，需要利用其他手段刺激免疫應答以得到更好的免疫效果。自1925年Ramon[2]首先發(fā)現(xiàn)在疫苗中加入某種其他物質(zhì)（瓊脂、金屬鹽、卵磷脂和皂甙）可以提高抗原的特異性免疫應答以來，如今各種不同的物質(zhì)被用作免疫佐劑。免疫佐劑（immunoadjuvant）就是指先于抗原或與抗原同時應用，能非特異性地改變或增強機體對該抗原的特異性免疫應答，能增強相應抗原的免疫原性或改變免疫反應類型，而本身無抗原性的物質(zhì)[3]。對于許多種傳染病，由于沒有合適的免疫佐劑而影響了菌苗、毒苗、重組蛋白、多肽和DNA疫苗等的發(fā)展。因此，傳染病的防控除了研發(fā)出高效低毒的疫苗外，免疫佐劑的研發(fā)也起著至關(guān)重要的作用。

1 免疫佐劑的作用機理

免疫佐劑增強機體對該抗原的特異性免疫應答的機理起初認為是“倉庫”效應，即在疫苗免疫中起到儲存抗原的作用，進而緩慢釋放抗原持續(xù)長久的刺激機體的免疫系統(tǒng)。近來的研究發(fā)現(xiàn)免疫佐劑也能夠影響遞呈抗原的樹突狀細胞（dendritic cells，DC），提高免疫應答和有效的記憶性免疫。在機體中DC通過監(jiān)測免疫環(huán)境來識別危險信號，扮演“哨兵”的角色。這些危險信號包括壞死細胞、受傷機體釋放的細胞因子和細菌等，它們都能激活DC，促進帶有相應受體的淋巴細胞通過淋巴管從淋巴結(jié)中遷移出來產(chǎn)生初次免疫。部分免疫佐劑的效果直接與其模擬危險信號的能力相關(guān)，這些信號的產(chǎn)生伴隨著機體的損傷，所以會在整個生物體內(nèi)或者注射部位引起炎癥反應。有些免疫佐劑能夠誘導機體不同類別細胞因子的分泌，從而控制或者改變機體對該抗原的免疫反應類型[3,4]。

2 傳統(tǒng)免疫佐劑

2.1 鋁鹽佐劑鋁鹽佐劑是目前應用最廣泛的免疫佐劑。1926年，Glenny首次用明礬沉淀白喉類毒素制成抗原免疫豚鼠，取得了較強的免疫效果。1931年，Glenny等又報道了氫氧化鋁吸附抗原制成的疫苗在注射部位具有緩慢釋放的功能，就此提出了氫氧化鋁佐劑的作用機制為儲存庫效應。最近的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞主要對抗原進行吞噬和破碎作用，鋁則激活細胞內(nèi)源性免疫應答相關(guān)的Nalp3炎性復合體，促進巨噬細胞分泌產(chǎn)生高水平的促炎癥因子IL-1β、IL-18[5]。Eisenbarth等[6]進一步研究證實氫氧化鋁佐劑還可激活Th2細胞分泌IL-4，誘導MHC-II類分子和CD83、CD86等的表達，誘導Th2型體液免疫應答。

但鋁鹽類佐劑也有一些缺陷，例如其在誘導細胞毒性T細胞及Th1型反應中作用很有限，在同高純度的小分子蛋白抗原共同使用時不能產(chǎn)生足夠的抗體應答，因此鋁鹽類佐劑在新型疫苗中的佐劑效果較差[7]。

2.2 油乳佐劑油乳佐劑是指一類由油類物質(zhì)和乳化劑按一定比例混合形成的佐劑，傳統(tǒng)劑型分水包油型乳劑（O/W）和油包水型乳劑（W/O）兩種。通常O/W型乳劑安全性高，但較稀薄，擴散快，佐劑活性較低；W/O型乳劑能在注射部位儲存相當長一段時間，能給抗原提供短期及長期的免疫增強作用，但是較黏稠，刺激性大，安全性不高。新型雙相型乳劑（W/O/W）安全性和活性介于以上兩者之間，是非常優(yōu)秀的佐劑。隨著乳化技術(shù)的發(fā)展，油乳佐劑中所含有的油成分逐漸降低（低于或等于5%），如法國Seppic公司研制開發(fā)的MONTANIDE ISA系列油乳佐劑。尤其是Seppic公司的MONTANIDE ISA系列雙相油乳佐劑（W/ O/W），與W/O型乳劑具有同等活性而且更易于吸收，更易于乳化，黏性更小，更為穩(wěn)定，使用更安全有效。MONTANIDE ISA系列W/O/W雙相油乳佐劑能刺激機體產(chǎn)生特異性抗體應答、淋巴細胞增殖和CD8+T細胞應答。這種佐劑雖然會產(chǎn)生輕微局部疼痛，但其免疫耐受性極好，且抗體滴度能夠維持兩個月，效果優(yōu)于鋁鹽佐劑[8]。

最早的油乳佐劑中油類物質(zhì)主要是礦物油，不穩(wěn)定且黏稠，毒副作用巨大，并且在機體內(nèi)不易代謝。選擇可代謝油取代傳統(tǒng)的礦物油來制備更為安全、穩(wěn)定、有效的新型免疫佐劑是目前油乳佐劑研究的方向，目前研制開發(fā)出的這類油乳佐劑有MF-59TM、AS03等。

MF-59TM由吐溫80和司盤85制備的水包鯊烯乳劑，是一種O/W納米油乳佐劑（平均粒徑＜250 nm），為繼鋁鹽佐劑之后唯一被批準的人用佐劑，在意大利獲準作為流感疫苗佐劑使用。它對各種動物和各年齡段的人均可產(chǎn)生高于鋁鹽佐劑水平的抗體，用量少、安全毒性極低[9]。Mosca等[10]研究證實，MF-59TM可誘導樹突狀細胞（dendritic cell，DC）增殖，增強抗原遞呈細胞（antigen presenting cell，APC）的抗原遞呈作用，刺激細胞因子的產(chǎn)生和APC向淋巴結(jié)的遷移，誘導產(chǎn)生強的IgG1和IgG2亞型免疫應答。

AS03由吐溫80、角鯊烯和維生素E乳化制得，也是一種O/W型油乳佐劑，安全無毒且能引起較強的免疫應答，并且具有交叉保護的能力，和MF-59TM同樣被歐盟批準在流感疫情緊急時候銷售[11]。

2.3 弗氏佐劑弗氏佐劑（Freund’s adjuvant）由美籍匈牙利細菌學家Freund于1935年研究成功，首先通過動物實驗證實了其免疫佐劑活性，其后在許多疫苗免疫試驗中證明弗氏佐劑可顯著提高疫苗的特異性免疫應答水平。弗氏佐劑有弗氏不完全佐劑與弗氏完全佐劑兩種。弗氏不完全佐劑是由液體石蠟油、無水羊毛脂、磷酸緩沖鹽制成，弗氏完全佐劑是在弗氏不完全佐劑中加入殺死的分枝桿菌或卡介苗制成。由于弗氏佐劑中石蠟油、羊毛脂等物質(zhì)進入動物機體不易代謝，從而影響食品安全問題[3]。因此，弗氏佐劑只適合用于試驗目的研究，不能用于制備疫苗。

3 細胞因子免疫佐劑

細胞因子（cytokines，CK）是一類存在于人和高等動物體中的、由白細胞和其他細胞合成的異源性蛋白或糖蛋白，一般以小分子分泌物形式釋放，可結(jié)合在靶細胞的特異受體上。細胞因子可使細胞間的各種信使分子連成一動態(tài)網(wǎng)絡，借以發(fā)揮其激活和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的多種功能，以便對外來的病原體感染或抗原性異物迅速作出免疫應答和其他生理反應。有人研究把細胞因子作為免疫佐劑與疫苗聯(lián)用，但由于細胞因子在體內(nèi)半衰期太短且造價昂貴，故未能在傳統(tǒng)疫苗中廣泛應用。鑒于DNA疫苗以質(zhì)粒作為抗原載體的啟發(fā)，有科學家將細胞因子基因亞克隆入DNA疫苗質(zhì)粒載體中，構(gòu)建了細胞因子-抗原基因免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗，克服了原有的弱點而在DNA疫苗領(lǐng)域得到更多的研究和應用。目前研究發(fā)現(xiàn)的具有免疫佐劑效應的細胞因子有干擾素（Interferon，IFN）、淋巴因子（IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-10等）、單核因子（IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等）及其他細胞因子如腫瘤壞子因子（Tumor necrosis factor ，TNF）、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，GMCSF）等。鑒于在DNA疫苗應用中研究比較多的是白細胞介素-2（IL-2）和干擾素（IFN），下面就這兩個細胞因子做重點論述。

3.1 白細胞介素-2白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）可引起T細胞增值和維持T細胞在體外的持續(xù)生長，故曾稱為T細胞生長因子。IL-2作為免疫佐劑可作用于多種免疫細胞，如包括T、B淋巴細胞、巨噬細胞和NK細胞等，對免疫應答具有廣泛的上調(diào)作用。IL-2除誘導外周T細胞增值及抑制T細胞凋亡外，還具有刺激胸腺產(chǎn)生T細胞的作用[12]。

3.2 干擾素干擾素（interferon，IFN）的免疫佐劑活性主要表現(xiàn)在抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抑制細胞分裂及抗腫瘤等方面。IFN具有廣譜的抗病毒作用，使病毒增值量減少，細胞損傷程度降低，其抗病毒活性較高。另外，IFN還能增強T細胞、B細胞和NK細胞的活性。IFN分子量小，可以自由出入細胞，作用無特異性。它能抗御各種病毒，但卻不能直接作用于病毒，而是促使宿主細胞阻止病毒生長。當病毒進入細胞內(nèi)時，IFN可以促使細胞產(chǎn)生一種抗病毒蛋白質(zhì)（antiviral protein，AVP），此物質(zhì)可以有效地阻止宿主細胞為病毒譯制病毒蛋白質(zhì)，從而達到抗病毒的作用。IFN的抗病毒作用非常明顯，只要細胞內(nèi)有IFN存在，一切病毒都不能增殖[13]。

4 天然來源免疫佐劑

從天然植物中提取的某些成份研究發(fā)現(xiàn)具有免疫佐劑活性，因其來源天然、毒性較低、代謝容易、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，在近年來的免疫佐劑研究中越來越受到重視和青睞。

4.1 多糖佐劑多糖（polysaccharide）具有增加胸腺、脾臟和禽法氏囊等免疫器官的重量及指數(shù)，對抗免疫損傷如環(huán)磷酸胺、放射線、化學藥物等所致的免疫器官的萎縮，恢復脾臟和淋巴系統(tǒng)的功能；活化和增強免疫細胞功能包括T、B淋巴細胞、NK細胞和白細胞等，促進淋巴細胞DNA的合成，提高淋巴細胞轉(zhuǎn)化率、T淋巴細胞百分率，激活單核巨噬細胞功能，加強其吞噬、處理、遞呈抗原的作用；促進抗體的合成與分泌，延長抗體存在時間，增強抗原物質(zhì)的免疫原性和穩(wěn)定性，還可以促進白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子等的分泌及活性[14,15]。具有佐劑活性的多糖有黃芪多糖、人參多糖、黨參多糖、枸杞多糖、淫羊藿多糖、當歸多糖、靈芝多糖、香菇多糖、牛膝多糖等。其中黃芪多糖已開發(fā)成產(chǎn)品在畜牧獸醫(yī)生產(chǎn)實踐中廣泛推廣應用。

4.2 黃酮佐劑黃酮（flavone）是天然植物中提取出來的另一類具有佐劑活性的物質(zhì)。白花蛇舌草總黃酮可促進小鼠溶血素形成，使脾臟以及胸腺增重并且能提高巨噬細胞吞噬能力。白花蛇舌草總黃酮還可以促進免疫功能低下小鼠由ConA或LPS誘導的脾淋巴細胞的增殖反應，并提高小鼠血清IL-2和IFN-γ的含量，促進免疫功能低下小鼠脾臟IgM抗體形成，并提高抗腫瘤藥物所致的小鼠白細胞減少。蜂膠黃酮能顯著提高雛雞的血清抗體效價，促進外周血T淋巴細胞增殖，且有一定的量效和時效關(guān)系。體外試驗研究表明蜂膠黃酮還能促進雞脾臟T淋巴細胞增殖，并且以低濃度的效果較好[16]。

4.3 皂甙佐劑天然植物中提取的皂甙（saponins）也具有佐劑活性。研究發(fā)現(xiàn)其能夠與細胞膜上的膽固醇形成復合物，是抗原強有力的免疫佐劑。機理包括促進T、B淋巴細胞增殖，提高NK細胞的殺傷活性，增強巨噬細胞吞噬能力及其代謝功能；誘導產(chǎn)生特異性MHC-I抗原限制性CTL；刺激分泌多種細胞因子，如IL-10、IL-4、IFN-γ、IL-2、IL-8、TNF-α；提高動物機體對抗原的特異性抗體水平，刺激產(chǎn)生IgG1、IgG2a和IgG2b抗體亞類。皂甙發(fā)揮佐劑活性的特點是誘導一個平衡的Th1/Th2反應[17,18]。研究表明皂甙對豬丹毒疫苗、奶牛金黃色葡萄球菌疫苗、豬細小病毒疫苗、雞新城疫疫苗、禽流感疫苗、口蹄疫疫苗均有顯著的佐劑作用，并且主要增強IgG2免疫反應[19]。同時研究還發(fā)現(xiàn)皂甙和氫氧化鋁鋁膠混合具有協(xié)同發(fā)揮佐劑作用。

4.4 蜂膠佐劑蜂膠（propolis）是一種有黏性、膠狀、含有樹脂的物質(zhì)。工蜂從樹芽（如楊樹）、樹皮（如松柏）或其他植物幼芽上采集來樹脂，并混入它的上鄂腺分泌物和蜂蠟等加工而成蜂膠。其中含樹脂類化合物、多酚類化合物、多糖類化合物，是一種具有廣譜生物學活性的天然物質(zhì)。蜂膠作為一種安全、綠色、天然的免疫佐劑，具有增進機體免疫功能和促進組織再生的作用，具有良好的應用前景。將蜂膠配合抗原免疫動物機體能增強免疫功能，增強補體和吞噬細胞活力，增加白細胞的產(chǎn)生和抗體產(chǎn)量，并使特異性凝集素的產(chǎn)生大大增加[20]。在我國，沈志強研究發(fā)明的禽霍亂蜂膠疫苗已推廣到全國30多個省市區(qū)。

5 新型免疫佐劑

5.1 免疫刺激復合物佐劑隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展，亞單位抗原和合成肽抗原不斷出現(xiàn)，這些抗原分子量小，純度高，但免疫原性較弱，難以誘導機體產(chǎn)生足夠的保護性免疫反應，使用免疫佐劑便是提高這些抗原免疫原性的有效途徑。免疫刺激復合物（immunostimulating complex，ISCOM）是由抗原物質(zhì)與糖苷QuilA及膽固醇按1:1:1混合后自發(fā)形成的一種具有較高免疫活性的脂質(zhì)小泡，主要適用于提高亞單位疫苗的免疫原性。ISCOM是一種全新的抗原遞呈系統(tǒng)，它能活化免疫系統(tǒng)的三種抗原特異性淋巴細胞：輔助性T細胞、細胞毒性T細胞和B細胞，可在增強體液免疫應答的同時誘導細胞免疫應答。ISCOM不僅是疫苗抗原的遞呈者，遞呈免疫刺激，且由于含有佐劑成分，提高免疫應答，具有抗原遞呈和免疫佐劑的雙重功能，所以ISCOM可刺激機體產(chǎn)生強烈而持久的“全面”的免疫應答反應[21]。ISOCM還能有效地通過黏膜給藥，從而提高黏膜免疫功能，用于抗呼吸道感染。此外，試驗證實ISOCM具有明顯提高DNA疫苗免疫效果的作用。

5.2 CpG ODN佐劑很久以前人們就發(fā)現(xiàn)高等生物進化過程中逐漸形成了對入侵微生物的天然識別機制，能夠被高等生物免疫系統(tǒng)識別的病原成分中就包括細菌和病毒的DNA，而CpG-ODN（CpG oligonucleotide，CpG寡脫氧核苷酸）是含有非甲基化CpG胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸的脫氧核苷酸。相比較而言，非甲基化的CpG在細菌DNA中更普遍，而在脊椎動物DNA中很少見，也更易引起脊椎動物的免疫反應。CpG對鼠類和人類B細胞能直接刺激和誘導有絲分裂，誘導細胞因子產(chǎn)生、免疫球蛋白分泌及細胞凋亡；CpG也直接激活巨噬細胞產(chǎn)生炎性細胞因子IL-12，增加B7-1和B7-2水平，刺激抗原特異性T細胞活化；CpG活化NK細胞產(chǎn)生干擾素，增加細胞溶解作用。

CpG-ODN在與淋巴細胞表面的DNA黏合蛋白結(jié)合后進入細胞內(nèi)涵體，內(nèi)涵體可以作為CpG的起始識別信號，TLR9（Toll-like receptor，Toll樣受體）特異識別CpG，然后作用于模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）引起先天性免疫應答，通過識別病原體特殊分子模式來對抗病原體。TLR9在B細胞和樹突狀細胞中表達量最高，這兩種細胞也是直接由CpG誘導激活的細胞，TLR9基因敲除小鼠的研究顯示B細胞、DC細胞、NK細胞無CpG刺激活性。CpG能有效激活巨噬細胞，增加TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12及抗原提呈分子如MHC-II分子、CD80、CD86、CD40等。CpG通過激發(fā)產(chǎn)生IFN-γ誘導NK細胞。CpG沒有顯示出直接刺激NK細胞或靜止期T細胞的功能，在鼠類可以通過CpG誘導產(chǎn)生IFN來間接刺激T細胞。CpG對于Th1型免疫應答具有良好的作用，皮下注射CpG可以增強組織器官中Th1型免疫應答[22,23]。

5.3 脂質(zhì)體佐劑脂質(zhì)體（liposome）是人工制備類脂質(zhì)小球體，由一個或多個酷似細胞單位膜的類脂雙分子層包裹著水相介質(zhì)組成。這種結(jié)構(gòu)使其能夠攜帶各種親水的、疏水的和兩性的物質(zhì)，它們被包入脂質(zhì)體內(nèi)部水相，或插入類脂雙分子層，或吸附、連接在脂質(zhì)體表面，作為模擬細胞膜和藥物載體。經(jīng)研究證實，脂質(zhì)體佐劑具有良好的靶向性和儲存效應，能夠增強體液免疫應答和細胞免疫應答，還可以增強巨噬細胞的吞噬作用，增強抗原遞呈作用[24]。

5.4 納米佐劑納米（nano meter，nm）是一個長度計量單位，1 nm等于10-9m。納米粒子一般是指粒徑在1～100 nm范圍內(nèi)的超微粒子。用納米級粒子制成的材料叫做納米材料，用納米材料做成的免疫佐劑就叫做納米佐劑（nano particulate adjuvant）。研制納米佐劑時納米材料的選擇尤為重要，在選擇納米材料時需要對以下幾個重要因素進行考慮：納米粒子的粒徑要低于100 nm，小粒徑的納米粒子有利于穿越生物屏障；納米粒子具有很好的生物相容性或者能夠有效地從體內(nèi)清除；能夠持續(xù)釋放抗原，使體內(nèi)抗原維持在有效濃度；易于產(chǎn)業(yè)化和有較好的質(zhì)量保證；能夠?qū)ζ浔砻嫘再|(zhì)進行修飾，因為修飾表面性質(zhì)可以使其引入功能分子，如具有靶向性的配體可以靶向到特定的細胞或者其他成份可以使納米佐劑在免疫后能有效地運輸?shù)较鄳拿庖呒毎鸞25,26]。因此，納米佐劑的優(yōu)勢在于吸附能力強、緩釋功能好、具有很好的靶向性和穩(wěn)定性。從目前研究成果來看，納米佐劑主要有兩大類：第一類是無機納米佐劑如氫氧化鋁納米佐劑、磷酸鈣納米佐劑、活性炭納米佐劑等；第二類是有機納米佐劑如殼聚糖及其衍生物納米佐劑、聚丙交酯乙交酯納米佐劑、蜂膠納米佐劑、多糖納米佐劑等。

6 展望

本文綜述的傳統(tǒng)免疫佐劑、細胞因子佐劑、天然來源佐劑及新型免疫佐劑是學者公認的佐劑作用相對較好的有應用前途的佐劑。理想的免疫佐劑應當有這樣一些特征：對于特定的動物，要保證副作用最??；佐劑作用要持久穩(wěn)定；生產(chǎn)成本要盡量低；產(chǎn)生的免疫應答應適當，最好能誘導機體細胞或體液免疫的強度要能達到保護要求；不同用藥途徑產(chǎn)生的不同毒副作用都應當研究清楚。在選擇免疫佐劑時，佐劑與疫苗配合使用一定要注意在佐劑的優(yōu)點和其產(chǎn)生的不利反應之間選取一個平衡點。隨著研究的深入，今后免疫佐劑研究的方向應該是：一方面進一步從先天性免疫及獲得性免疫方面對已知的免疫佐劑作用機理在細胞分子免疫水平進行研究，盡可能詳細地掌握作用機理；另一方面尋找高效低毒的能夠提高機體細胞免疫水平、體液免疫水平、細胞因子分泌及免疫記憶等“全面”免疫應答的新型免疫佐劑。

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DEVELOPMENT AND PERSPECTIVE OF IMMUNOADJUVANTS

LI Xue-zhao1, HONG Yang2, WANG Zhi-cang1, LI Xiang-rui3, SONG Hong-yan4
(1. Gansu Polytechnique College of Animal Husbandry and Engineering, Wuwei 733006,China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241,China; 3. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095,China; 4. Laboratory Animals Center, Nantong University, Nantong 226019, China)

This article summarizes discovery, mechanism and development of immunoadjuvants, and reviews categories and mechanisms of traditional immunoadjuvants, cytokines, adjuvants, natural adjuvants and newly developed adjuvants. In addition, the perspective of immunoadjuvant is briefl y described.

Vaccine; immunoadjuvant; immunomechanism

S852.43

A

1674-6422（2014）04-0081-06

2013-10-25

2014年甘肅省高等學?？蒲许椖抠Y助（2014B-140）

李學釗，男，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

李學釗，E-mail：lixuezhao621@163.com