木合布力·阿布力孜，王永波，徐方野，阿布力孜·阿布杜拉

（新疆醫(yī)科大學1.藥學院藥物化學有機教研室、2.新疆地方病分子生物學重點實驗室，新疆烏魯木齊 830011）

肝癌多藥耐藥（MDR）不僅限制了化療效果，也是導致肝癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因，如何逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性已是腫瘤藥物干預研究的熱點。人肝癌Bel-7402細胞株作為一種體外模型，在新型抗癌候選藥物研究中較為常用。國內(nèi)學者利用此種模型從天然藥物中篩選出了對肝癌Bel-7402細胞具有明顯抑制活性的黃芩苷、蟲草素、蜂毒素、蛇葡萄素、川芎嗪等天然活性成分，并探討其在肝癌的輔助治療、逆轉(zhuǎn)耐藥性等方面的應(yīng)用價值［1-4］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，甘草查耳酮成分異甘草素（isoliquiritigenin，ILG）對人宮頸癌SiHa細胞具有明顯的抑制增殖和促進凋亡活性，并對正常細胞的毒性低，從而顯示較好的先導化合物的潛力［5］。本研究參照前期研究方法［6］對天然化合物ILG及其衍生物3-甲氧基異甘草素（3-OM-ILG）進行人工合成制備，并應(yīng)用人肝癌Bel-7402細胞為體外模型，用MTT法和流式細胞儀法對兩種化合物的抗肝癌活性及促進癌細胞凋亡作用進行對比研究。

1 材料

1.1 試劑 人類肝癌細胞株Bel-7402（中國生命科學院上海細胞研究所提供）；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清（GIBCO公司）；DMSO、胰蛋白酶、青／鏈霉素、MTT（購自 Sigma公司）；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 25 cm3和75 cm3培養(yǎng)盒、6孔板、2 ml凍存管（CORING公司）；CO2孵育箱（HERA cell150，Thermo公司）；生物安全柜（HERA safe，德國）；酶標儀（Beckmann，美國）；臺式離心機（3-18K，Sigma公司）；流式細胞儀（LSRⅡ，BD公司）。

2 方法

2.1 化合物的制備 兩種目標化合物ILG和3-OM-ILG按文獻［7］方法進行制備。

2.2 人肝癌Bel-7402細胞培養(yǎng) 配制含10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的 RPMI 1640全培養(yǎng)基，在5%CO2和37℃條件下培養(yǎng)人肝癌Bel-7402細胞，每隔24～48 h更換培養(yǎng)基，常規(guī)消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.3 樣品溶液的制備 將ILG和3-OM-ILG以100%DMSO溶解后，用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成5%DMSO母液，經(jīng)0.22μm過濾器除菌后備用。本研究將ILG和3-MO-ILG與溶液體積之比定為藥物濃度。

2.4 MTT法測定肝癌細胞增殖的抑制活性 取對數(shù)生長期的肝癌Bel-7402細胞，接種于96孔板（細胞密度為2×106·L-1），每孔200μl，按預定濃度（5、25、50、100、200、250 mg·L-1）進行藥物干預24 h。次日，每孔加入10μl MTT（5 g·L-1），并保持培養(yǎng)基的原體積不變。在37℃和5%CO2細胞孵育箱培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)液，用150μl DMSO溶解細胞。振搖15 min，待細胞內(nèi)紫色結(jié)晶溶解后，利用酶標儀測定其570 nm波長處吸光度A值（optical density，OD570），細胞生長抑制率（IR）／% ＝ ［（OD空-OD測）／OD空）］×100%，并判斷細胞活力（注明：OD空為空白對照組的吸光度值；OD測為藥物或陽性對照組在某一濃度的吸光度值）。

2.5 流式細胞儀測定促進癌細胞凋亡活性 選擇對數(shù)生長期的Bel-7402細胞，以1×106細胞／孔的密度種植于6孔板，培養(yǎng)24 h后，以不同的 4種濃度（0、50、100、200 mg·L-1）進行藥物干預。待所有藥物干預過程完成后，收集細胞，參照Annexin V-FITC試劑盒說明書處理細胞，并用流式細胞儀測定細胞凋亡率，主要包括細胞懸浮、結(jié)合Annexin V-FITC（1.25μl）和碘化丙啶（PI，10μl），以及流式細胞儀檢測。流式細胞儀分析條件：激發(fā)波長Ex＝488 nm；發(fā)射波長Em＝530 nm。

2.6 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。資料采用±s表示，各組OD570值與正常對照組比較采用2個獨立樣本的χ2檢驗。

3 結(jié)果

3.1 化合物的鑒定 ILG和3-OM-ILG的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)與文獻［7］一致。

3.2 抗癌生物活性

3.2.1 兩種化合物對肝癌細胞增殖的抑制率 在0～250 mg·L-1的藥物濃度范圍內(nèi)，用MTT法測得的兩種化合物對肝癌Bel-7402細胞增殖的抑制率大致相似，即在10.60%～89.35%及13.09%～91.91%范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增高，抑制率逐漸上升。根據(jù)統(tǒng)計學分析，ILG和3-OM-ILG在中低濃度時（即濃度在5、25、50、100和200 mg·L-1的 5個濃度下）差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），此時，3-OM-ILG對Bel-7402細胞的抑制作用強于ILG，但濃度超過200 mg·L-1時，二者的抑制活性強度差異沒有統(tǒng)計學意義。

3.2.2 用流式細胞儀測定凋亡率 ILG和3-OM-ILG在不同濃度下（0、50、100、200 mg·L-1）對人 Bel-7402細胞產(chǎn)生較強的促凋亡作用。這4種濃度下，ILG對肝癌Bel-7402細胞的凋亡率分別為5.2%、31%、56%、85%；而3-OM-ILG的引起的凋亡率則依次為7%、54%、78%、93.5%。此結(jié)果說明，這兩種甘草查耳酮類化合物對人肝癌Bel-7402細胞產(chǎn)生明顯的促凋亡作用，其中3-OM-ILG的促凋亡作用強于其先導化合物ILG。

4 討論

鑒于細胞毒類常規(guī)化療藥物的全身性嚴重毒副作用問題，從天然產(chǎn)物中尋找結(jié)構(gòu)和作用機制獨特的新型抗肝癌先導化合物及其結(jié)構(gòu)修飾和活性篩選，已成為目前的新型抗癌藥物研究熱點。本研究中，以甘草查耳酮類物質(zhì)ILG為先導化合物，在查耳酮類的構(gòu)效關(guān)系規(guī)律基礎(chǔ)上，對其化學結(jié)構(gòu)進行甲氧基化修飾，制備3-OM-ILG，擬提高化合物的脂溶性和細胞穿透力；并應(yīng)用人肝癌Bel-7402細胞為體外模型，用MTT法和流式細胞儀法對兩種化合物的抗肝癌活性及促進癌細胞凋亡能力進行了考察。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，兩種化合物在濃度為5～250 mg·L-1范圍內(nèi)，對腫瘤細胞增殖的抑制率分別為10.60%～89.35%及13.09%～91.91%；兩者對肝癌細胞顯示明顯的促進凋亡作用（兩者的最高凋亡率分別達85%和93.5%）。此結(jié)果顯示，人肝癌細胞Bel-7402對甘草查耳酮類化合物的抗癌活性具有較高的敏感性。其中3-OM-ILG對肝癌細胞的抑制活性及促進凋亡作用明顯強于先導化合物ILG。這可能是由于先導化合物ILG結(jié)構(gòu)中B環(huán)上引入一個甲氧基，使整個分子的脂溶性增強，對細胞膜的穿透力提高，從而使先導化合物對Bel-7402細胞的抗癌活性增強。本研究對從甘草查耳酮類化合物中篩選抗肝癌候選藥物奠定了一定基礎(chǔ)。

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