史國(guó)生，程春雷

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101)

蜜環(huán)菌又名榛蘑，是一種在夏、秋季生長(zhǎng)，能兼性寄生于多種植物的真菌，屬于擔(dān)子菌門、傘菌目、白蘑科。蜜環(huán)菌具有根腐特性，但對(duì)某些植物如中藥天麻和豬苓，必須依靠蜜環(huán)菌的侵染才能生長(zhǎng)繁殖[1]。蜜環(huán)菌含有氨基酸、微量元素、多糖、倍半萜類化合物等成分，其中蜜環(huán)菌多糖是蜜環(huán)菌具有多種藥理活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[2]?，F(xiàn)將其活性多糖的理化性質(zhì)、藥理作用等方面的最新研究進(jìn)展報(bào)道如下。

1 蜜環(huán)菌多糖的成分

由于蜜環(huán)菌的培養(yǎng)方法、提取工藝不同，不同學(xué)者得到的結(jié)果也不盡相同。洪毅等[3]從蜜環(huán)菌菌索中分離得到的多糖，經(jīng)水解確定產(chǎn)物為D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖和半乳糖醛酸。余晨晨等[4]利用紫外、紅外光譜、氣相衍生化分析蜜環(huán)菌發(fā)酵液中水溶性多糖的結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，水溶性多糖成分單一，均為吡喃型葡萄糖。劉曉杰等[5]采用分布醇沉和葡聚糖凝膠(Sephadex G-200)色譜法對(duì)蜜環(huán)菌發(fā)酵液進(jìn)行分類純化，用高效液相色譜(HPLC)法進(jìn)行分子量測(cè)定，采用1 -苯基-3-甲基-5 -吡唑啉酮將單糖進(jìn)行衍生測(cè)定。此方法共獲得2 種均一性多糖(AMFP-1，AMFP-2)，峰位分子量分別為812939 和596217，AMFP-1 主要由半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖組成，而AMFP-2主要由半乳糖醛酸、半乳糖、木糖組成。

2 蜜環(huán)菌多糖提取工藝的優(yōu)化

蜜環(huán)菌多糖具有較多的活性，因此其提取工藝也成為研究熱點(diǎn)。武錄平等[6]用熱水浸提法和超聲波提取法對(duì)蜜環(huán)菌子實(shí)體進(jìn)行了對(duì)比研究，并采用三因素三水平的正交試驗(yàn)將提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，最佳工藝參數(shù)為料液比1 ∶50、溫度40 ℃、提取時(shí)間6 h，得率達(dá)5.96%;超聲法提取的最佳工藝參數(shù)為料液比1 ∶30、超聲時(shí)間35 min、功率360 W，提取率比水提法略低。隨著提取工藝研究的不斷深入，張帆等[7]在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取超聲時(shí)間、超聲溫度、液固比3 個(gè)因子進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)，以多糖提取率為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)，并用響應(yīng)面分析方法對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到的優(yōu)化提取工藝條件修正后為液固比10 ∶1、超聲時(shí)間22 min、超聲溫度77 ℃，最終蜜環(huán)菌多糖的提取率采用超聲后其提取率升高了10%左右。這主要是由于超聲波促使樣品中偶極分子旋轉(zhuǎn)而導(dǎo)致弱氫鍵破裂及離子遷移，加速了溶劑對(duì)樣品的滲透，并使多糖溶解于溶劑中;此外，超聲具有生物效應(yīng)，會(huì)引起樣品細(xì)胞膜破裂，從而加速多糖從細(xì)胞中的釋放。也有研究表明，在水提取法的基礎(chǔ)上進(jìn)行超聲優(yōu)化，多糖得率可增加6%左右，可將超聲波法作為蜜環(huán)菌多糖提取的輔助手段。

3 蜜環(huán)菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

蜜環(huán)菌的發(fā)酵條件對(duì)其多糖的含量有重要影響。余晨晨等[8]以苯酚-硫酸法測(cè)定多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，系統(tǒng)地研究了蜜環(huán)菌的最適氮源。研究結(jié)果表明，紅薯粉和豆粕組合時(shí)最適合產(chǎn)多糖，玉米漿和玉米粉的組合菌絲體的得率最高。發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮源是影響多糖產(chǎn)量的重要營(yíng)養(yǎng)要素，在試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)14 種不同類型的碳氮源系統(tǒng)的進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)天然類培養(yǎng)基的多糖和菌絲體得率明顯高于一般合成類的碳氮源。也有學(xué)者從篩選菌株開始，確定了最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間和碳源、氮源的組合。研究結(jié)果表明，菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間為7 d，根據(jù)菌絲干重和多糖得率綜合分析，最適碳源和氮源組合為糊精+紅薯粉，蠶蛹粉+玉米漿。溫剛等[9]以蜜環(huán)菌胞外多糖為指標(biāo)，對(duì)基本培養(yǎng)基組分進(jìn)行了優(yōu)化，具體的培養(yǎng)基組成為:蔗糖25 g/L，豆餅粉2.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，KH2PO40.25 g/L，MgSO40.5 g/L，ZnSO40.03 g/L，F(xiàn)eSO40.02 g/L。利用此培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)478.5 mg/L，是基本培養(yǎng)基的6 倍。

4 蜜環(huán)菌多糖的藥理活性

4.1 降糖作用

操玉平等[10]根據(jù)純化時(shí)洗脫液的不同，得到了水相(AMP-1)和鹽相(AMP-2)2 種組分。研究表明，AMP-1 能明顯降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖，且可使正常小鼠的糖耐量增加;同時(shí)，一定濃度的AMP-1 對(duì)四氧嘧啶損傷的大鼠胰島素瘤細(xì)胞的分泌胰島素和C 肽具有一定的促進(jìn)作用。為進(jìn)一步研究其降糖機(jī)制，徐寶奎等[11]以四氧嘧啶損傷胰島素細(xì)胞，在培養(yǎng)液中加入AMP-1。結(jié)果表明，AMP-1 能劑量依賴性地提高細(xì)胞存活率，當(dāng)質(zhì)量濃度為400 mg/L 時(shí)，能恢復(fù)至正常水平。運(yùn)用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)表明，四氧嘧啶會(huì)導(dǎo)致胰島素細(xì)胞凋亡，而AMP-1 具有一定的拮抗作用。通過(guò)Western blot 進(jìn)行凋亡通路分析發(fā)現(xiàn)，四氧嘧啶會(huì)使胰島素細(xì)胞bcl-2 蛋白表達(dá)量減少，bax蛋白表達(dá)升高，而AMP-1 的加入會(huì)拮抗這種改變?？梢?，AMP-1可通過(guò)線粒體通路拮抗四氧嘧啶引起的胰島素細(xì)胞凋亡。

4.2 免疫調(diào)節(jié)作用

王惠國(guó)等[12]研究表明，蜜環(huán)菌多糖是一種具有提高機(jī)體免疫力的免疫調(diào)節(jié)劑。小鼠經(jīng)腹腔注射給予不同劑量的蜜環(huán)菌多糖，對(duì)照組給予等量的0.9%氯化鈉注射液，每天給藥1 次，給藥14 d。給藥結(jié)束后，用腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)、炭粒廓清試驗(yàn)觀察小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬能力，采用MTT 法測(cè)定小鼠脾臟T 淋巴細(xì)胞增殖能力，用血清溶血素形成試驗(yàn)觀察蜜環(huán)菌多糖對(duì)小鼠特異性體液免疫功能的影響。結(jié)果表明，腹腔注射蜜環(huán)菌多糖后，小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬功能、脾臟T 淋巴細(xì)胞的增殖能力、小鼠血清中特異性抗體含量均明顯高于陰性對(duì)照組(P ＜0.05)。為進(jìn)一步了解蜜環(huán)菌多糖增強(qiáng)免疫力的機(jī)制，王惠國(guó)等[13]用形態(tài)學(xué)方法測(cè)定各組小鼠在植物血凝素(PHA)誘導(dǎo)下淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定各組小鼠血清中白細(xì)胞介素2(IL -2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βl(TGF -βl)水平。結(jié)果表明，蜜環(huán)菌多糖具有提高小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，增加血清中IL -2 水平，并同時(shí)下調(diào)血清中TGF -βl水平的作用[13]。此研究提示，蜜環(huán)菌多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠免疫細(xì)胞及免疫分子的作用，增強(qiáng)小鼠的免疫功能。

4.3 抗阿爾茨海默病(AD)作用

AD 俗稱老年癡呆癥，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，具體發(fā)病機(jī)制不明，但近年的研究發(fā)現(xiàn)，自由基損傷所造成的神經(jīng)元損傷是引起AD 的重要原因之一。有研究報(bào)道，復(fù)方天麻蜜環(huán)菌片對(duì)AD 有一定療效，可顯著提高AD 患者的簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查量表(MMSE)和簡(jiǎn)易智能量表(HDS)評(píng)分，明顯改善臨床癥狀，降低神經(jīng)功能損傷積分，改善日常生活能力。

為進(jìn)一步闡明其抗AD 的機(jī)制，邱家權(quán)等[14]和殷銀霞等[15]研究了蜜環(huán)菌多糖含藥血清對(duì)Aβ 25-35 及過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。邱家權(quán)等[14]用蜜環(huán)菌多糖制備大鼠含有血清，在Aβ 25-35 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷模型的基礎(chǔ)上加入蜜環(huán)菌多糖含藥血清，采用比色法檢測(cè)培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶的活力、丙二醛含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。結(jié)果表明，不同濃度的含藥血清對(duì)Aβ 25-35 損傷的PC12 細(xì)胞的存活率有提高作用，5%濃度的含藥血清可明顯降低乳酸脫氧酶(LDH)活力、丙二醛(MDA)含量，提高SOD 活力。殷銀霞等[15]改用過(guò)氧化氫損傷PC12 細(xì)胞模型得到了相似的結(jié)果。為進(jìn)一步闡明蜜環(huán)菌多糖的抗氧化作用，朱顯峰等[16]采用分光光度法系統(tǒng)地研究了其對(duì)清除羥基自由基(·OH)、超氧陰離子(O2-)和DPPH 自由基能力，并且與抗壞血酸、TBHQ 進(jìn)行了對(duì)比。蜜環(huán)菌多糖對(duì)·OH 的清除能力與抗壞血酸、TBHQ 相當(dāng)，對(duì)O2-清除能力優(yōu)于TBHQ，但弱于抗壞血酸，對(duì)DPPH 清除能力強(qiáng)于抗壞血酸和TBHQ。武錄平等[17]對(duì)蜜環(huán)菌子實(shí)體多糖進(jìn)行了分離純化，將粗多糖通過(guò)乙醇沉淀分級(jí)得到3 個(gè)組分多糖T30、T60 和T80。T30 經(jīng)凝膠柱(sephadexG-150)層析獲得2 個(gè)純多糖組分T301 和T302;T60 經(jīng)凝膠柱(s 即hadexG-50)層析獲得一個(gè)純多糖組分T601，對(duì)蜜環(huán)菌多糖T30I 和T601 進(jìn)行體外抗氧化試驗(yàn)。結(jié)果表明，2 種多糖都具有一定的抗氧化活性，T301 的效果優(yōu)于T601，表明蜜環(huán)菌多糖的生物活性與多糖的分子量大小有一定關(guān)系。以上研究表明，蜜環(huán)菌多糖有較強(qiáng)的清除自由基、抗氧化能力，這可能是其抗AD、延緩衰老的機(jī)制之一。

4.4 抗衰老作用

蜜環(huán)菌多糖能部分逆轉(zhuǎn)D-半乳糖記憶力下降等衰老行為，并能降低小鼠體內(nèi)NO 和MDA 含量。秀麗隱桿線蟲是廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的模式生物，與人類基因的同源性達(dá)到80%，其生命周期短，易繁殖，是進(jìn)行衰老研究的理想模式生物模型。陳亮穩(wěn)等[18]以生物秀麗隱桿線蟲作為活體模型，測(cè)定蜜環(huán)菌多糖對(duì)線蟲在正常培養(yǎng)條件下的生存期與后代平均數(shù)量，氧化應(yīng)激條件下的存活率和熱休克蛋白16.2(HSP-16.2)、SOD-3 的表達(dá)影響。結(jié)果表明，在正常培養(yǎng)條件下，蜜環(huán)菌菌索多糖(AMP-1 及AMP-2)可顯著延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲的生存期，對(duì)其生殖力沒有損害;在氧化應(yīng)激條件下，顯著提高秀麗隱桿線蟲HSP-16.2 和SOD-3 的表達(dá)。

4.5 抗癌作用

Wu 等[19]從蜜環(huán)菌體中分離純化了一水溶性多糖，該多糖含用高效凝膠色譜分析其相對(duì)分子質(zhì)量為4.6 ×105，而且主要由D-葡萄糖組成。體外研究發(fā)現(xiàn)，該多糖對(duì)A549 腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用，能引起腫瘤細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞阻滯在G0/G1期。研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，該多糖能使腫瘤細(xì)胞的線粒體膜電位下降，因而使細(xì)胞色素C 從線粒體釋放，同時(shí)激活caspase-3 和caspase-9，從而誘發(fā)A549 腫瘤細(xì)胞凋亡。

5 結(jié)語(yǔ)

蜜環(huán)菌是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用真菌，其在滋補(bǔ)防病的應(yīng)用歷史悠久。近幾年來(lái)，真菌多糖的生物活性越來(lái)越引起大家的重視，同樣蜜環(huán)菌多糖的提取、結(jié)構(gòu)鑒定、藥理活性及活性作用機(jī)制也成為研究熱點(diǎn)。目前，已有天麻蜜環(huán)菌片、腦心舒口服液等藥品在臨床使用，而且有蜜環(huán)菌飲料、糖漿等保健品上市。隨著蜜環(huán)菌多糖研究的不斷深入，一定會(huì)有更多制劑開發(fā)出來(lái)，更好地服務(wù)于人類健康。

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