邢星 劉勇 孫勇 周鑫 胡超蘇

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

循環(huán)游離核酸(circulating cell-free nucleic acids)是指存在于人體循環(huán)系統(tǒng)中，游離于細(xì)胞外的微量?jī)?nèi)源性或外源性核酸片段，包括核DNA、線粒體DNA(mitochondrial DNA，mitDNA)、病毒DNA、信使RNA(messenger RNA，mRNA)及微小RNA(microRNA，miRNA)等。1948年，Mandel等［1］首次發(fā)現(xiàn)了血液循環(huán)中游離DNA的存在。隨后，循環(huán)游離核酸在病理狀態(tài)下的特異性變化引起了廣泛關(guān)注。1977年，Leon等［2］發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中的游離DNA水平較健康人群明顯升高，并與腫瘤的進(jìn)展與預(yù)后相關(guān)；1989年，Stroun等［3］發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血液中的游離核酸含有與腫瘤細(xì)胞相同的基因突變。近年來，隨著研究的深入，循環(huán)游離核酸所包含的與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的特征性改變逐漸被揭示。越來越多的證據(jù)表明，游離核酸的檢測(cè)在腫瘤的診斷、個(gè)體化治療方案的制定及預(yù)后評(píng)估中有重要價(jià)值。本文針對(duì)這一領(lǐng)域近年來的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 循環(huán)游離DNA

1.1 生物學(xué)來源

血液循環(huán)中游離DNA產(chǎn)生的具體機(jī)制尚未明確，但目前認(rèn)為主要來源于細(xì)胞的凋亡和壞死。腫瘤患者血液中游離DNA來自腫瘤細(xì)胞或非腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞以被動(dòng)和主動(dòng)兩種方式釋放游離DNA片段入血。循環(huán)游離DNA的腫瘤相關(guān)突變多發(fā)生在較短的片段中，長(zhǎng)片段很少含有此類突變，由于短片斷游離DNA多為巨噬細(xì)胞吞噬壞死細(xì)胞消化后的產(chǎn)物，因此血液中腫瘤來源的游離DNA片斷可能主要由壞死的腫瘤細(xì)胞經(jīng)吞噬后釋放［4］。同時(shí)，增生活躍的腫瘤細(xì)胞也可能向血液中主動(dòng)釋放DNA片斷［5］。但非腫瘤來源的游離DNA可能是腫瘤患者血液中游離DNA的更主要來源［6］，皮下種植結(jié)腸癌細(xì)胞的小鼠血漿中，非腫瘤來源的游離DNA濃度是腫瘤來源的游離DNA濃度的10倍以上，且其濃度變化與腫瘤的直徑變化正相關(guān)，提示在腫瘤生長(zhǎng)的過程中，腫瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞之間存在著一定相互作用，促進(jìn)了腫瘤周圍組織細(xì)胞或其他正常組織細(xì)胞的凋亡和壞死［6］。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示肝癌患者血液中的游離DNA呈現(xiàn)出典型的“凋亡梯”，因此腫瘤患者血液中游離DNA的來源可能以細(xì)胞凋亡為主［7］。通常情況下，游離DNA會(huì)被存在于血液中的DNA酶迅速降解，從而維持在較低水平。而腫瘤患者血液中的DNA酶活性降低，減緩了DNA的降解；此外，來源于腫瘤細(xì)胞的游離DNA多以脂蛋白復(fù)合體形式存在，提高了對(duì)DNA酶的抵抗性［8］，這可能是腫瘤患者循環(huán)游離DNA水平升高的另一潛在原因。

1.2 循環(huán)游離DNA與腫瘤

1.2.1 循環(huán)游離DNA濃度

自1977年Leon等［2］首次發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血液中的游離DNA水平明顯升高以來，在多種腫瘤患者的血液中都相繼檢測(cè)到了游離DNA水平的升高。因此許多學(xué)者提出，循環(huán)游離DNA的水平可用于腫瘤的篩查［9-10］。此外，游離DNA的定量在腫瘤預(yù)后的評(píng)估中也體現(xiàn)出一定價(jià)值，Hashad等［9］發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血液中的游離DNA水平與腫瘤的大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)；在卵巢癌、肺癌等患者中，治療后循環(huán)游離DNA持續(xù)在較高水平，則提示更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［11-12］。雖然循環(huán)游離DNA定量檢測(cè)在腫瘤的診斷和療效評(píng)估中體現(xiàn)出了一定價(jià)值，但由于在炎性反應(yīng)、外傷、敗血癥等病理狀態(tài)下循環(huán)游離DNA的水平也明顯升高，導(dǎo)致這一指標(biāo)在腫瘤篩查中的特異性明顯不足；在定量檢測(cè)的技術(shù)方面，不同的研究間也存在較大差異，使得目前難以取得統(tǒng)一的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 基因突變

血漿中與腫瘤相關(guān)的突變基因的檢出與腫瘤密切相關(guān)。Kras基因突變可見于結(jié)直腸癌、胰腺癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞中。Gall等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，血液中kras基因突變的檢出率在胰腺癌患者和正常對(duì)照組間存在顯著差異。外周血中檢測(cè)突變的p53基因也具有較高的診斷價(jià)值，Chen等［14］的研究顯示，乳腺癌患者在治療后外周血中不能檢出p53基因突變則提示病情緩解，而持續(xù)可檢出的p53基因突變可能與治療后的持續(xù)進(jìn)展相關(guān)。

突變基因的檢出還可評(píng)估患者對(duì)治療的敏感性。既往研究已揭示，在肺癌患者腫瘤細(xì)胞中，存在表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)基因突變型的患者對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體絡(luò)氨酸激酶抑制劑(epithelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)的敏感性更高。而血漿中可檢出EGFR基因突變型的患者，其對(duì)EGFR-TKI的應(yīng)答率也同樣高于檢出結(jié)果為野生型的患 者［15］，因此循環(huán)游離DNA中該基因的檢測(cè)可用于個(gè)體化治療方案的選擇。Murtaza等［16］在多個(gè)晚期腫瘤患者的外周血游離DNA中找到了與各自所使用的化療藥物相關(guān)的獲得性藥物抵抗突變基因，如在使用紫杉醇的患者血漿中檢測(cè)到了PIK3CA基因突變，在使用他默昔芬的患者血漿中檢測(cè)到了MED1基因突變等，提示對(duì)于以上突變的檢測(cè)在化療過程中可指導(dǎo)用藥。

游離DNA突變的檢測(cè)還可用于長(zhǎng)期預(yù)后的判斷。Levy等［17］報(bào)道，結(jié)直腸癌患者血液中腫瘤特異性的基因突變與疾病的進(jìn)展存在明顯相關(guān)性。在非小細(xì)胞肺癌患者中，外周血可檢測(cè)到kras基因突變的患者總體生存率和無進(jìn)展生存率明顯低于僅檢測(cè)到野生型的患者，因此kras突變型在游離DNA中的檢出可能提示預(yù)后 不良［18］。

但由于突變基因在血液中的濃度較低，增加了游離DNA中突變檢出的難度。在血樣送檢的過程中，血液細(xì)胞溶解會(huì)釋放出大量正常細(xì)胞來源的DNA，會(huì)造成血液中突變基因的稀釋；此外，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性導(dǎo)致并非所有腫瘤細(xì)胞均含有腫瘤特異性的突變，即使來源于腫瘤細(xì)胞的游離DNA也可能不含有這些突變，以上因素均增加了游離DNA突變檢出的難度。有文獻(xiàn)報(bào)道突變基因在腫瘤組織中的檢出率高于在外周血中的檢出率［15］，或?yàn)榱颂岣咄蛔儥z出率，對(duì)同一患者采集多個(gè)血樣［16］。

1.2.3 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與雜合性丟失

微衛(wèi)星指的是在基因組中由6個(gè)堿基對(duì)以內(nèi)的短單元組成的DNA串聯(lián)重復(fù)序列。微衛(wèi)星片段的突變率高，稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)。MSI的改變可能造成等位基因中的一個(gè)基因喪失部分或全部序列，這種現(xiàn)象稱為雜合性丟失(loss of heterozygosity，LOH)。MSI和LOH可造成基因組的不穩(wěn)定性增高，使抑癌基因丟失，進(jìn)而造成腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。將MSI與其他腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果相結(jié)合，可明顯提高腫瘤檢測(cè)的敏感性［19］。對(duì)LOH的檢測(cè)可以通過對(duì)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的檢測(cè)來實(shí)現(xiàn)。Schwarzenbach等［20］研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血漿游離DNA中，與抑癌基因相關(guān)的多個(gè)LOH位點(diǎn)突變的檢出，提示更強(qiáng)的侵襲性、更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移傾向以及更低的生存率。

1.2.4 非編碼序列的完整性

近年來的研究表明，非編碼DNA序列可能參與DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄等生理過程。非編碼序列通常包含大量重復(fù)序列。ALU序列是一種較短的重復(fù)序列，在整個(gè)人類基因組中占10%左右；LINE1則屬于長(zhǎng)散在重復(fù)元件(long interspersed elements，LINE)中的一種。正常細(xì)胞凋亡釋放出的含有ALU和LINE1的片段較短，通常在200 bp以下。而腫瘤細(xì)胞的壞死可釋放出較長(zhǎng)的ALU片段［7］，同時(shí)腫瘤細(xì)胞也可以通過主動(dòng)分泌的方式釋放此類片段，長(zhǎng)度多在200～400 bp之間［21］。許多研究通過游離DNA長(zhǎng)片段和短片段濃度比作為完整性指數(shù)，來表示血液中游離DNA片段的完整性。Chen等［22］的研究發(fā)現(xiàn)，乙肝病毒相關(guān)性肝細(xì)胞性肝癌患者游離DNA片段的完整性較乙肝患者明顯升高，并與腫瘤大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，而兩類患者血液中總的游離DNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Chan等［23］發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者血漿游離DNA片段完整性指數(shù)在放療后有明顯的下降，持續(xù)高水平的DNA完整性指數(shù)則提示預(yù)后不良。

1.2.5 DNA甲基化

DNA異常甲基化是與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)的一種表觀遺傳學(xué)修飾，包括全基因組的低甲基化與多個(gè)腫瘤相關(guān)基因啟動(dòng)子CpG島的高甲基化。啟動(dòng)子高甲基化在腫瘤形成中的發(fā)生率較高，并穩(wěn)定存在，因此是一種極具優(yōu)勢(shì)的潛在的腫瘤標(biāo)志物。在腫瘤的診斷方面，在卵巢癌、乳腺癌和胃癌患者的血液游離DNA中可檢測(cè)到抑癌基因RASSF1A等的甲基 化［24-26］；細(xì)胞周期相關(guān)基因p15、p16、修復(fù)相關(guān)基因GSTP1等的甲基化可以在包括前列腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤患者的外周血DNA中檢出［27-29］。這些均有望作為腫瘤標(biāo)志物，用于腫瘤的早期診斷。此外，游離DNA甲基化的檢測(cè)在腫瘤患者預(yù)后的判斷中也有潛在的價(jià)值。乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、肺癌等腫瘤患者，其循環(huán)游離DNA所包含的特定位點(diǎn)的甲基化與不良預(yù)后有明顯相關(guān)性［29-31］。Zhang等［26］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于早期卵巢癌的患者，血清游離DNA多個(gè)甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)相結(jié)合，具有比CA125的檢測(cè)更高的敏感性。

1.2.6 腫瘤相關(guān)病毒DNA

病毒與某些腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。如鼻咽癌與Epstein-Barr病毒(EBV)感染、宮頸癌與人乳頭瘤狀病毒感染、肝癌與肝炎病毒的感染等均存在明顯相關(guān)性。既往研究顯示，EBV DNA在鼻咽癌患者的血清中的陽性率達(dá)96%，而在正常對(duì)照組中僅為7%［32］。在1項(xiàng)針對(duì)大樣本人群的篩查中發(fā)現(xiàn)，與現(xiàn)行的篩查指標(biāo)EBV IgAVCA相比，EBV DNA在鼻咽癌篩查中具有更高的敏感性［33］。鼻咽癌患者血液中的EBV DNA水平可以反映患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷，在治療結(jié)束后鼻咽癌患者血液中EBV DNA水平的降低程度則可反映疾病的緩解程度，與短期預(yù)后明顯相關(guān)［34］；此外，血漿EBV的水平降低與較高的遠(yuǎn)期總體生存率也明顯相關(guān)［34-35］。因此有望通過循環(huán)游離EBV DNA的檢測(cè)來輔助鼻咽癌的診斷及預(yù)后評(píng)估。但非腫瘤患者在感染此類病毒時(shí)，血漿中的病毒DNA水平也會(huì)明顯升高，單獨(dú)將這一指標(biāo)用于腫瘤診斷特異性不足，若將該指標(biāo)與其他指標(biāo)相結(jié)合，則可明顯提高診斷的準(zhǔn)確性。此外，在統(tǒng)一檢測(cè)技術(shù)手段的基礎(chǔ)上，選取一個(gè)恰當(dāng)?shù)挠坞x病毒DNA拷貝數(shù)的診斷參考范圍，有助于進(jìn)一步提高這一診斷方式的效力。

1.2.7 MitDNA

MitDNA長(zhǎng)度較短，與核基因組相比結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，循環(huán)中的拷貝數(shù)較多，用于臨床檢測(cè)和篩查更加經(jīng)濟(jì)便捷，敏感性也更高，這些優(yōu)點(diǎn)使循環(huán)mitDNA的檢測(cè)在臨床應(yīng)用中更具優(yōu) 勢(shì)［36］。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤患者血液中可發(fā)現(xiàn)游離mitDNA水平的升高或降低，但導(dǎo)致這一改變發(fā)生的機(jī)制尚不明確。Yu等［37］的研究顯示，在尤文氏肉瘤患者的血清中，mitDNA的水平明顯低于健康對(duì)照組，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。Zachariah等［38］發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血漿游離mitDNA的水平明顯升高，對(duì)游離mitDNA的定量檢測(cè)可以有效區(qū)分出卵巢癌患者與子宮內(nèi)膜異位癥患者，這一結(jié)論有望用于臨床診斷。近年來，在肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性的mitDNA突變［36］。此外，完整性改變也是腫瘤患者游離mitDNA的特征性改變之一。Ellinger等［39］將220 bp的mitDNA和79 bp的mitDNA片段拷貝數(shù)比值作為泌尿系腫瘤的mitDNA完整性指數(shù)，發(fā)現(xiàn)與前列腺癌患者和健康對(duì)照組相比，在腎癌和膀胱癌患者中該指數(shù)明顯升高，這一指數(shù)也與腎癌的病理分期和膀胱癌的分級(jí) 相關(guān)。

2 循環(huán)游離RNA與腫瘤

2.1 mRNA

mRNA本身的穩(wěn)定性較低，同時(shí)腫瘤患者血液中的RNA酶水平升高，因此既往認(rèn)為循環(huán)游離mRNA降解速度較快，臨床應(yīng)用價(jià)值有限。1987年，Wieczorek等［40］的研究揭示了在腫瘤患者的血清中，RNA以脂蛋白復(fù)合體的形式存在。另有研究發(fā)現(xiàn)，游離mRNA多來源于細(xì)胞凋亡，存在于凋亡小體中，因此腫瘤患者血液中的游離mRNA穩(wěn)定性較高［41］。這些特征都使游離mRNA檢測(cè)應(yīng)用于臨床成為了可能。

多種mRNA的定量檢測(cè)均體現(xiàn)出了一定的價(jià)值。人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是維持端粒酶活性的主要組分之一，端粒酶的激活在細(xì)胞的永生化和惡性腫瘤的增殖中起到了至關(guān)重要的作用。Terrin等［42］的研究顯示，以血漿中hTERT的水平來作為結(jié)直腸癌的檢測(cè)方法，其敏感性和特異性分別達(dá)到92%和100%；March-Villalba等［43］的研究表明，以血漿hTERT mRNA的水平來區(qū)分局限性和局部侵襲性的前列腺癌，敏感性和特異性分別達(dá)到83%和73%，且特異性明顯高于PSA。Miura等［44］發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清里的hTERT mRNA的水平與腫瘤的大小、轉(zhuǎn)移情況與復(fù)發(fā)情況相關(guān)。Pucciarelli等［45］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者接受術(shù)前輔助放化療前后的hTERT mRNA水平的差異可能與患者對(duì)放化療的應(yīng)答存在相關(guān)性。

其他游離mRNA在腫瘤的臨床評(píng)估中也體現(xiàn)出了一定價(jià)值。Cyclin D1基因所編碼的蛋白可促進(jìn)細(xì)胞周期從G1向S的轉(zhuǎn)化，該基因的突變可使這一蛋白過度表達(dá)，使細(xì)胞的增殖失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Garcia等［46］研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者的血漿中可以檢測(cè)到cyclin D1 mRNA的患者的總體生存率明顯低于血漿cyclin D1 mRNA陰性的患者；在臨床病理特征提示預(yù)后較好的患者中，血漿中檢出cyclin D1 mRNA的患者預(yù)后較差；在他默昔芬治療的患者中，血漿cyclin D1 mRNA陽性的患者的總體生存率明顯低于cyclin D1 mRNA陰性的患者。

此外，Wong等［47］的研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者血漿mRNA完整性降低，放療后血漿游離mRNA完整性明顯上升，上升的游離mRNA水平可作為病情緩解的指標(biāo)。

2.2 miRNA

miRNA在基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中具有重要作用，并可能發(fā)揮原癌基因或抑癌基因的作用。它們?cè)谘獫{或血清中有極高的穩(wěn)定性，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，這些特質(zhì)使得miRNA成為一種潛在的腫瘤標(biāo)志物。目前已在多種腫瘤患者血液中發(fā)現(xiàn)了miRNA水平的異常改變。miR-155、miR-202、miR-425、miR-302b和miR-125b等是近年來報(bào)道的在健康人群和乳腺癌患者血漿或血清中表達(dá)有明顯差異的miRNA，在乳腺癌的早期篩查中有潛在價(jià)值［48-49］；此外，miR-115在激素敏感與激素不敏感的乳腺癌患者血清中的水平有差異［50］，miR-10b在雌激素受體陰性的患者血清中水平升高［51］。對(duì)于結(jié)腸癌患者，miR-92a在早期檢測(cè)中體現(xiàn)出了較高的敏感性［52］；miR-21的升高、miR34a的降低也具有較高的診斷效 力［53-54］；miR-141和miR-221則被認(rèn)為與不良預(yù)后相關(guān)［55-56］。

3 小 結(jié)

現(xiàn)有研究顯示，通過對(duì)循環(huán)游離核酸的定性定量檢測(cè)，可以獲取腫瘤特異性的生物信息及患者個(gè)體化的遺傳信息，在腫瘤的早期診斷、病情評(píng)估、個(gè)體化治療方案的確定以及預(yù)后判斷中有著重要價(jià)值。同時(shí)，循環(huán)游離核酸的檢測(cè)也具有取樣方便、創(chuàng)傷小、可多次重復(fù)操作等優(yōu)勢(shì)，在臨床應(yīng)用中易于開展。在部分研究中，游離核酸的定性定量檢測(cè)，已體現(xiàn)出比現(xiàn)行腫瘤標(biāo)志物如腫瘤抗體(cancer antigen，CA)等指標(biāo)更高的可靠性。由于循環(huán)游離核酸的水平隨疾病的進(jìn)展和治療處于動(dòng)態(tài)變化中，在腫瘤診斷與治療中，對(duì)于循環(huán)游離核酸的持續(xù)檢測(cè)可能更有意義。

但將循環(huán)游離核酸的檢測(cè)用于臨床實(shí)踐尚存在一些待解決的問題。在血樣的獲取方式、保存方式、血漿或血清的選擇、定量與定性檢測(cè)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化等方面，各項(xiàng)研究間存在差異，造成了結(jié)果和結(jié)論的不同。因此，根據(jù)現(xiàn)有研究難以取得統(tǒng)一的參考標(biāo)準(zhǔn)，游離核酸檢測(cè)的臨床應(yīng)用仍處于探索階段。有鑒于此，相關(guān)研究機(jī)構(gòu)應(yīng)在研究設(shè)計(jì)和檢測(cè)技術(shù)等方面取得共識(shí)，并通過多中心、更大樣本的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)其效用。

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