王穎娜，張艷梅，藺應(yīng)學(xué)，楊照青

瘧疾(Malaria)是全球性嚴(yán)重危害人類健康的重要傳染病之一，目前全球有90多個國家和地區(qū)的20多億人居住在瘧疾流行區(qū)。撒哈拉以南的非洲國家感染瘧疾疫情最重，瘧疾是非洲兒童死亡的最主要原因之一。東南亞的感染情況僅次于非洲，據(jù)世界衛(wèi)生組織2008年的報告，全球30%的瘧疾發(fā)病率和8%的死亡率集中在這里。雖然2010年世界衛(wèi)生組織報告：瘧疾發(fā)病案例由2005年2.44億人次降到2009年2.25億人次；死亡人數(shù)由2000年98.5萬例降到2009年的78.1萬例，其中非洲地區(qū)死亡人數(shù)雖然大幅下降[1]，但是目前瘧疾仍然是世界六大熱帶病和我國五大寄生蟲病之一，是威脅人類健康的主要疾病，給疫區(qū)帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，阻礙社會的發(fā)展。由于惡性瘧發(fā)病兇險，愈后差，其病死率可高達50%，并且惡性瘧原蟲對多種抗瘧藥已存在耐藥性，因此惡性瘧已經(jīng)成為一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。

自上世紀(jì)60年代以來，全球范圍內(nèi)惡性瘧原蟲對主要抗瘧藥物氯喹產(chǎn)生了抗藥性，瘧原蟲的抗藥性由單一性向多藥抗性發(fā)展。惡性瘧原蟲抗藥株的不斷出現(xiàn)已成為重大的公共衛(wèi)生問題，給瘧疾防治工作帶來新的挑戰(zhàn)，瘧原蟲抗藥性研究迫在眉睫。鑒于全球惡性瘧原蟲對傳統(tǒng)的氯喹、乙胺嘧啶、甲氟喹等已產(chǎn)生耐藥，由于具有抗藥性瘧原蟲會很快遍布所有惡性瘧流行地區(qū)，抗藥強度會不斷增加，原蟲產(chǎn)生抗藥性的速度遠比新藥研發(fā)的進度快得多，從保護青蒿素及其衍生物的角度考慮，世界衛(wèi)生組織建議各國在青蒿素及其衍生物的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他藥物(ACTs)來治療惡性瘧，以延緩瘧原蟲對青蒿素和其他藥物抗藥性的產(chǎn)生。

1 青蒿素類藥物抗藥性的現(xiàn)狀

青蒿素及其衍生物是一類全新結(jié)構(gòu)的抗瘧藥，自其問世以來即以高效、速效、低毒的抗瘧活性得到世界公認(rèn)，對氯喹耐藥的惡性瘧依然有效?，F(xiàn)在多重抗藥的惡性瘧原蟲株已在東南亞和南美洲等地廣泛流行，雖然瘧原蟲已對多種藥物產(chǎn)生了抗藥性，青蒿素類藥物仍能夠在幾天內(nèi)治愈超過90%的瘧疾患者,目前被全世界公認(rèn)為是一種很有效的抗瘧新藥，但是目前已有很多的研究提示青蒿素類藥物的敏感性正逐漸下降，抗藥性的產(chǎn)生是難以避免的。世界衛(wèi)生組織曾經(jīng)警告說,如果失去了ACTs，人們將再也沒有一個治療瘧疾的辦法，或許至少要用十年的時間才能發(fā)現(xiàn)一種新的抗瘧藥。

迄今為止，還沒有文獻報道惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物出現(xiàn)普遍的耐藥性，但有報道稱用青蒿素類藥物治療病人時已經(jīng)出現(xiàn)了敏感性下降，寄生蟲清除時間出現(xiàn)延遲和幾周后再燃等情況[2-3]。最近在柬埔寨西部的Pailin和泰國Wang Pha同時做了一項治療無并發(fā)癥的惡性瘧患者的研究，分為青蒿琥酯單藥組和青蒿琥酯聯(lián)用甲氟喹組兩組，單藥治療組青蒿琥酯的劑量為2 mg/kg,d共7 d，聯(lián)用組青蒿琥酯4 mg/kg,d共3 d，以后給甲氟喹25 mg/kg,分兩次給藥。在柬埔寨的Pailin寄生蟲清除時間為84 h，泰國Wang Pha,為48 h[4]，在過去幾十年的經(jīng)驗表明青蒿素類的藥物可在兩天時間內(nèi)迅速清除血液寄生蟲。排除了再次感染，在兩地單用青蒿琥酯治療組幾周內(nèi)分別有30%和10%的患者出現(xiàn)了癥狀復(fù)發(fā)的情況，而聯(lián)合治療組分別有10%和5%的病人再燃。Pailin和Wang Pha真正的失敗率可能分別高達20.0%和37.5%[4]。2004年柬埔寨第1次報告用青蒿素治療惡性瘧出現(xiàn)耐藥以來[2-3]，許多在泰國-緬甸邊境上出現(xiàn)的“新感染瘧疾”病例，實際上很可能是再燃。在緬甸南部還有另一項研究對青蒿琥酯治療無并發(fā)癥瘧疾患者，治療72 h后進行寄生蟲清除半衰期的分析，表明72 h后有26.9%仍可檢測出原蟲。這是第一次報告青蒿素耐藥性起源在緬甸境內(nèi)[5]，這些研究提供的證據(jù)表明在緬甸的惡性瘧原蟲很可能對青蒿素敏感性降低。在泰國邊境，甲氟喹，青蒿琥酯在體內(nèi)的療效逐步下降，有研究報告用青蒿琥酯治療惡性瘧病人，治療第3 d患者的外周血瘧原蟲陽性率2011年達到28%，而2000年同樣用青蒿琥酯治療病人，3 d后患者外周血瘧原蟲陽性率為0%[6]。惡性瘧原蟲于青蒿素類藥物治療3 d后血液中仍然可以觀察到較多寄生蟲，這就是“延遲瘧原蟲轉(zhuǎn)陰時間”。還有研究表明，經(jīng)過在泰國青蒿素治療后第2 d、第3 d可見瘧原蟲的比例約30%和15%，第28 d有2%可見瘧原蟲[7]。柬埔寨西部的Pailin，患者經(jīng)青蒿琥酯單藥治療或甲氟喹，青蒿琥酯治療2 d后外周血涂片見寄生蟲的比例高達73%，治療3 d后患者外周血涂片見到瘧原蟲的比例為55%[7-8]。瘧原蟲清除時間延長在越南也有報道[9]，但相關(guān)研究仍在繼續(xù)，有待于進一步監(jiān)測及證實。

惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物出現(xiàn)敏感性降低的現(xiàn)象在亞洲比較突出，而在非洲則不同。在西非馬里共和國(RépubliqueduMali)的研究指出，在這項青蒿素耐藥性的研究患者外周血中瘧原蟲轉(zhuǎn)陰時間的中位數(shù)為32 h[10]，遠低于柬埔寨西部報告時間?？赡艿脑驗轳R里2004年以后才廣泛使用青蒿素類藥物，而柬埔寨使用這類藥物超過30年，在馬里瘧疾病人得到青蒿素及衍生物治療的比例遠低于柬埔寨西部，另外馬里大量惡性瘧疾病例主要為輸入性病例，病人不會自行用藥，這些因素可能使得馬里的瘧原蟲未對青蒿素類藥物長沙耐藥[10]。

2009年楊恒林等[11]采用WHO推薦的體外微量法做了緬甸拉咱地區(qū)惡性瘧原蟲對青蒿琥酯等7種藥物體外半數(shù)抑制量(ID50)測定，發(fā)現(xiàn)緬甸拉咱地區(qū)惡性瘧原蟲對青蒿琥酯的ID50為299.2 nM/L比1993年作者在該地區(qū)做的IC50上升1.2倍，提示青蒿琥酯對惡性的敏感性呈下降趨勢。另一項研究[12]用雙氫青蒿素哌喹片(每片含雙氫青蒿素40 mg， 磷酸哌喹320 mg) 2 d 4次療法治療緬甸拉咱市惡性瘧原蟲感染陽性者91例，64 例全程隨訪者中，尚有4 例(6.3%)于服藥后第3 d外周血中瘧原蟲未轉(zhuǎn)陰，但因這4例病人腋溫小于37.5 ℃仍判為臨床治療有效，這4 例患者服藥后隨訪外周血無性體原蟲轉(zhuǎn)陰時間為65.9 h，比研究者在云南觀察的最長無性體原蟲轉(zhuǎn)陰時間(63 h)長，這可能與當(dāng)?shù)貝盒辕懺x對哌喹和青蒿素類敏感性下降有關(guān)，推測當(dāng)?shù)夭糠謵盒辕懺x可能對雙氫青蒿素哌喹片敏感性下降[12]。

2 青蒿素類藥物抗藥性可能的機理

耐多種抗瘧藥的惡性瘧原蟲是全球瘧疾控制的一個主要障礙。雖然青蒿素類藥物抗性關(guān)聯(lián)基因研究被人們進行很多探索，但是到現(xiàn)在為止仍然沒有明確的結(jié)論。惡性瘧原蟲耐抗瘧藥乙胺嘧啶、磺胺、氯喹與特定的pfdhfr，pfdhps和Pfcrt基因突變相關(guān)。然而，有相當(dāng)大的爭議為新興突變的耐青蒿素類抗瘧藥衍生藥物標(biāo)記。一些觀察表明青蒿素抑制惡性瘧原蟲胞漿網(wǎng)織鈣依賴性ATP酶(sarco/endoplasmic calcium-dependent ATPase 6,PfATPase6)，有資料[13]表明，青蒿素類藥物可以抑制在非洲爪蟾卵細胞內(nèi)表達Pfatp6的酶活性，如果在該酶的第三跨膜區(qū)引入L263E這一突變，則解除了青蒿素類藥物對該酶的抑制。jambou[14]等，報道了位于沿巴西北部邊境的圭亞那從惡性瘧患者體內(nèi)分離出的蟲株對蒿甲醚的IC50值有所升高，通過測序，他們發(fā)現(xiàn)Pfatp6的第769位的絲氨酸突變?yōu)樘於０?，提示Pfatp6基因的突變可能會使瘧原蟲對青蒿素的敏感性降低。雖然這種突變的意義還未確定，這些觀察可能表明S769N突變可能是一個藥物抗性標(biāo)記[15]。值得注意的是，大部分的Pfatp6突變是具有地域局限的[16]?，F(xiàn)仍需要進一步的研究，找出能夠可靠預(yù)測的青蒿素耐藥性的分子標(biāo)記。目前，對這個觀點持否定態(tài)度的有所增加[17]。

2010年美國的一個學(xué)者提出，ACT(artemisinin combination therapy)療效的下降，和Pfmdr1基因型有關(guān)[18]。pfmdr1的基因拷貝數(shù)增加，不論在體內(nèi)還是體外實驗，都是甲氟喹和鹵泛群的抗性的主要決定因子[19]。在東南亞，特別是泰國和柬埔寨的一些地區(qū)，高水平的分離與pfmdr1拷貝數(shù)大于1(30%～40%)是由于MQ單藥治療多年，作為第一線治療無并發(fā)癥惡性瘧疾?？汞懠菜幬餅E用可能導(dǎo)致株擴增pfmdr1的患病率快速增加，因為所有瘧疾流行地區(qū)，瘧疾在非洲的傳輸水平是最高的。這種情況可能加速耐藥性的出現(xiàn)行為[24]。作為一個概念證明，研究者用7 d的本芴醇濃度測量估計再感染成倍增加惡性瘧原蟲濃度，多藥耐藥基因(pfmdr1)基因型與藥敏的結(jié)果。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，再次感染寄生蟲pfmdr1單體型的N86/184F/D1246種能夠承受本芴醇血藥濃度高于15倍那些與86Y/Y184/1246Y的單倍型。該方法可應(yīng)用于長半衰期抗瘧疾藥物，能及早發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲體內(nèi)的藥物敏感性降低，這代表一種新的抗瘧藥耐藥的分子標(biāo)記方式[21]。

到今天為止，上述觀點仍一直存在爭議，分子基礎(chǔ)耐藥機制仍不清楚。柬埔寨泰國邊境上出現(xiàn)的青蒿素耐藥性的威脅已得到廣泛承認(rèn)，雖然最終明確的惡性瘧原蟲感染，大多數(shù)仍然以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法治療，耐藥的惡性瘧原蟲清除時間需要3或4 d，而青蒿素敏感的瘧原蟲蟲清除時間不到2 d。防止青蒿素耐藥性的蔓延是瘧疾防治的重大課題[22]。

有報道[273〗指出，在柬埔寨西部青蒿琥酯治療惡性瘧疾的失敗率增加，也就是說青蒿素類藥物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)敏感性下降，其可能的機制是寄生蟲生長休眠情況。休眠恢復(fù)假說為寄生蟲在人體內(nèi)經(jīng)過藥物作用后進入靜止?fàn)顟B(tài)或者休眠，等青蒿素類藥物的短的藥物藥效高峰期過了以后，才進一步發(fā)育，這樣的一個發(fā)育滯后，恰恰保護他們免受藥物致死效果。最近有研究表明，在雙氫青蒿素作用下惡性瘧原蟲很容易進入休眠期。與其他藥物相比，較長半衰期的藥物則不容易進入休眠期[23]。法國和美國科學(xué)家亦發(fā)表了類似研究結(jié)果。

休眠現(xiàn)象實際就是寄生蟲的一種自我保護現(xiàn)象。對于惡性瘧原蟲來說，其表現(xiàn)就是惡性瘧原蟲在人體內(nèi)的清除延遲。盡管清除延遲一直使原蟲復(fù)燃的風(fēng)險增高，但臨床瘧疾卻沒有體現(xiàn)出治療失敗現(xiàn)象[23]。

如果確定休眠現(xiàn)象是青蒿素耐藥性真正的原因，我們在臨床治療時，就可以根據(jù)此機制更靈活的運用并治療。休眠現(xiàn)象被認(rèn)為更多的存在于短期療效的藥物中，此時我們的治療就可以青蒿素短期療效結(jié)合長效藥，以這樣的聯(lián)合用藥為治療的主導(dǎo)地位。

3 結(jié) 語

瘧疾在全球致死性寄生蟲病中位居第一位[24]。青蒿素類藥物作為一種全新抗瘧藥, 以其優(yōu)良的療效和低毒性而成為全世界最常用的抗瘧藥。世界已有多個地區(qū)報道惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物的敏感性下降,寄生蟲在人體內(nèi)清除率時間延長。讓從事瘧疾防治的工作者真正認(rèn)識到惡性瘧原蟲對青蒿素產(chǎn)生抗藥性的危害，對延緩瘧原蟲對青蒿素類藥物耐藥產(chǎn)生意義重大。

雖然青蒿素耐藥性機制近期被多方研究探索，如Pfatp6基因突變、Pfmdr1基因突變，以及研究最熱的寄生蟲休眠假說等等，但是到現(xiàn)在仍然沒有確定，有待進一步的研究探索，解開青蒿素耐藥之謎，延長青蒿素類藥物使用壽命和減緩耐藥性,使瘧疾的治療沒有后顧之憂。

參考文獻：

[1]Organization WH. Multidrug and extensively drug-resistant TB (M/XDR-TB): 2010 global report on surveillance and response[M]. Geneva: World Health Organization, 2010:64.

[2]Denis MB, Tsuyuoka R, Poravuth Y, et al. Surveillance of the efficacy of artesunate and mefloquine combination for the treatment of uncomplicated falciparum malaria in Cambodia[J]. Trop Med Int Health, 2006, 11(9): 1360-1366. DOI: 10.1111/j.1365-3156.2006.01690.x

[3]Organization WH. Resistance to artemisinin derivatives along the Thai-Cambodian border[J]. Wkly Epidemiol Rec, 2007, 82: 360.

[4]Taylor SM, Juliano JJ, Meshnick SR. Artemisinin resistance inPlasmodiumfalciparummalaria[J]. N Engl J Med, 2009, 361: 1807. DOI: 10.1056/NEJMoa0808859

[5]Kyaw MP, Nyunt MH, Chit K, et al. Reduced susceptibility ofPlasmodiumfalciparumto artesunate in Southern Myanmar[J]. PLoS ONE, 2013, 8(3): e57689. DOI: 10.1371/journal.Pone.0057689

[6]Carrara VI, Lwin KM, Phyo AP, et al. Malaria burden and artemisinin resistance in the mobile and migrant population on the Thai Myanmar Border, 1999 2011: An observational study[J]. PLoS Med, 2013, 10(3): e1001398. DOI: 10.1371/journal.Pmed.1001398

[7]Dondorp AM, Nosten F, Yi P, et al. Artemisinin resistance inPlasmodiumfalciparummalaria[J]. New Engl J Med, 2009, 361(5): 455-467. DOI: 10.1056/NEJMoa0808859

[8]Satimai W, Sudathip P, Vijaykadga S, et al. Artemisinin resistance containment project in Thailand. II: responses to mefloquine-artesunate combination therapy among falciparum malaria patients in provinces bordering Cambodia[J]. Malaria J, 2012, 11(1): 1-13. DOI: 10.1186/1475-2875-11-131

[9]Hien TT, Thuy-Nhien NT, Phu NH, et al.Invivosusceptibility ofPlasmodiumfalciparumto artesunate in Binh Phuoc Province, Vietnam[J]. Malaria J, 2012, 11(1): 1-11. DOI: 10.1186/1475-2875-11-355

[10]Ng CL, Fidock DA. No evidence of decreased artemisinin efficacy in a high-transmission malaria setting in Mali[J]. American J Trop Med Hyg, 2012, 87(1): 16. DOI: 10.4269/ajtmh.2012.12-0344

[11]Lin YH, Li XL, Gao BH, et al. Surveillance ofPlasmodiumfalciparumsusceptibility to seven antimalarials, including artemether, in the western part of the Sino-Myanmar border area[J]. J Pathog Biol, 2009, 4(11): 831-832, 843.

[12]Sun XD, Zhang ZX, Wang J, et al. Therapeutic efficacy and safety of compound dihydroartemisinin/piperaquine for uncomplicatedPlasmodiumfalciparuminfection in Laiza City of Myanmar Bordering on China[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2011, 29(5): 372-375. (in Chinese)

孫曉東, 張再興, 王劍, 等. 雙氫青蒿素哌喹片治療緬甸拉咱市惡性瘧的療效和安全性評價[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2011, 29(5): 372-5.

[13]Eckstein-Ludwig U, Webb R, Van Goethem I, et al. Artemisinins target the SERCA ofPlasmodiumfalciparum[J]. Nature, 2003, 424(6951): 957-961. DOI: 10.1038/nature01813

[14]Jambou R, Legrand E, Niang M, et al. Resistance ofPlasmodiumfalciparumfield isolates to in-vitro artemether and point mutations of the SERCA-typePfATPase6[J]. Lancet, 2005, 366(9501): 1960-1963. DOI: 10.1016/S0140-6736(05)67787-2

[15]Brasil LW, Areas AL, Melo GC, et al.Pfatp6 molecular profile ofPlasmodiumfalciparumisolates in the western Brazilian Amazon[J]. Malaria J, 2012, 11(1): 1-5. DOI: 10.1186/1475-2875-11-111

[16]Cui L, Wang Z, Jiang H, et al. Lack of association of theS769Nmutation inPlasmodiumfalciparumSERCA (PfATP6) with resistance to artemisinins[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2012, 56(5): 2546-2552. DOI: 10.1128/AAC.05943-11

[17]Miao M, Wang Z, Yang Z, et al. Genetic diversity and lack of artemisinin selection signature on thePlasmodiumfalciparumATP6 in the Greater Mekong Subregion[J]. PLoS One, 2013, 8(3): e59192. DOI: 10.1371/journal.pone.0059192

[18]Witkowski B, Iriart X, Soh PN, et al.pfmdr1 amplification associated with clinical resistance to mefloquine in West Africa: implications for efficacy of artemisinin combination therapies[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(10): 3797-3799. DOI: 10.1128/JCM. 01057-10

[19]Wilson CM, Volkman SK, Thaithong S, et al. Amplification ofpfmdr1 associated with mefloquine and halofantrine resistance inPlasmodiumfalciparumfrom Thailand[J]. Mol Biochemical Parasitol, 1993, 57(1): 151-160. DOI: 10.1016/0166-6851(93)90252-S

[20]Witkowski B, Nicolau ML, Soh PN, et al.Plasmodiumfalciparumisolates with increasedpfmdr1 copy number circulate in West Africa[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54(7): 3049-3051. DOI: 10.1128/AAC.00209-10

[21]Malmberg M, Ferreira PE, Tarning J, et al.Plasmodiumfalciparumdrug resistance phenotype as assessed by patient antimalarial drug levels and its association withpfmdr1 polymorphisms[J]. J Infect Dis, 2013, 207(5): 842-847. DOI: 10.1093/infdis/jis747

[22]Dondorp AM, Fairhurst RM, Slutsker L, et al. The threat of artemisinin-resistant malaria[J]. New Engl J Med, 2011, 365(12): 1073-1075. DOI: 10.1056/NEJMp1108322

[23]Codd A, Teuscher F, Kyle DE, et al. Artemisinin-induced parasite dormancy: a plausible mechanism for treatment failure[J]. Malaria J, 2011, 10(1): 56. DOI: 10.1186/1475-2875-10-56

[24]Dou XG, Yang SJ, Ren H. Measles[M]. 7thedition of Infectious Diseases, Beijing: People’s Medical Publishing House, 2008: 69-74. (in Chinese)

竇曉光, 楊紹基, 任紅. 麻疹[M]//傳染病學(xué).7版.北京: 人民衛(wèi)生出版社,2008: 69-74.