楊浩娜， 柏連陽，2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究所，湖南長沙 410128； 2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南長沙 410125)

草甘膦是美國孟山都公司于20世紀(jì)70年代研制出的一種廣譜滅生性除草劑，可以防除一年生和多年生雜草。因為草甘膦理化性質(zhì)穩(wěn)定，具有內(nèi)吸傳導(dǎo)性、高效低毒、低殘留等其他除草劑所不具備的優(yōu)點，現(xiàn)已成為世界最主要的除草劑之一。我國自1980年開始生產(chǎn)草甘膦以來，逐漸成為全球生產(chǎn)和銷售草甘膦的中心[1]，起初草甘膦在我國僅在果園使用，后來隨著少耕免耕等耕作方式的改變和作物行間的定向保護(hù)性噴霧技術(shù)的發(fā)展[2]，使得草甘膦使用范圍得到進(jìn)一步擴(kuò)大。草甘膦現(xiàn)在既廣泛用于橡膠、桑、茶、果園等田地，也用于大豆、棉花、水稻、小麥等草本科農(nóng)田。長期使用單一的除草劑必將加快雜草產(chǎn)生抗藥性。草甘膦具有獨特的作用方式和代謝機(jī)制，在土壤中殘留量極低，使人們認(rèn)為在田間不可能有雜草對草甘膦產(chǎn)生抗藥性[3]。然而，1996年澳大利亞首次報道發(fā)現(xiàn)抗草甘膦瑞士黑麥草(Loliumrigidum)之后，越來越多的抗草甘膦雜草在世界范圍內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，給草甘膦的應(yīng)用帶來了前所未有的挑戰(zhàn)，引起了國內(nèi)外專家的極大關(guān)注[3]。在國內(nèi)，越來越多的雜草被發(fā)現(xiàn)對草甘膦產(chǎn)生抗藥性，如廣東省發(fā)現(xiàn)牛筋草對草甘膦產(chǎn)生抗性[4]，湖南省、浙江省發(fā)現(xiàn)小飛蓬對草甘膦產(chǎn)生抗性[5-6]等。因此，建立一套科學(xué)快速的抗草甘膦雜草檢測方法，為雜草抗藥性和農(nóng)田施藥指導(dǎo)等相關(guān)工作提供理論支撐意義深遠(yuǎn)。本研究總結(jié)歸納科學(xué)有效的抗草甘膦雜草檢測方法，旨在為農(nóng)田抗草甘膦雜草檢測體系的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 常用檢測方法

1.1 培養(yǎng)皿法

培養(yǎng)皿檢測法以其簡單、快速、方便等特點[7]，一直被人們用于各類雜草抗藥性檢測試驗當(dāng)中。Perez等和 Lenardo等利用培養(yǎng)皿法成功檢測了智利果園多花黑麥草(Loliummultiflorum)和巴西的馬唐(Digitariainsularis)對草甘膦的抗藥性水平[8-9]。培養(yǎng)皿檢測法首先需要將待測雜草種子打破休眠，然后配制等量不同濃度的草甘膦藥液，其濃度梯度設(shè)置為6～8個，一般設(shè)置為6個，其中1個為空白對照，待藥液均勻浸濕濾紙后，再將剛露白的種子放在培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放至恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，設(shè)置待測雜草最適的溫度、濕度和光照條件。處理1～3周后，通過測定待測雜草種子的發(fā)芽數(shù)、主根長、芽長等指標(biāo)，對其抗藥性水平進(jìn)行檢測。不同種群的雜草，其參照指標(biāo)并不相同。

1.2 整株檢測法

整株檢測法相對于培養(yǎng)皿檢測法來說，其周期時間長，占用空間大，但因其具有簡單易行、重復(fù)性好等優(yōu)勢，被認(rèn)為是檢測雜草抗藥性最普遍有效的方法[10]，也被國際雜草抗藥性管理組織推薦為主要檢測方法[11]。楊彩宏等利用整株檢測法成果地檢測出廣東省牛筋草(Eleusineindica)對草甘膦的抗性水平[4]。整株檢測法一般采用Ryary法，將待測雜草的種子打破休眠后，統(tǒng)一進(jìn)行盆栽，放置在溫室或者培養(yǎng)箱中，設(shè)置待測雜草最適的溫度、濕度和光照條件，雜草生長期間定時澆水，定期拔出非目標(biāo)雜草。1～2個月后，待雜草長到5 cm以上，一般為3～6葉期為宜，不同雜草應(yīng)根據(jù)本身條件而定。禾本科雜草一般為3～4葉期，闊葉雜草等須根據(jù)其生長情況而定，一般以其生物量適合稱量為宜。處理前對待測雜草進(jìn)行間苗，選擇長勢一致的為同一批次，用6～8個不同劑量的草甘膦溶液處理待測雜草，一般設(shè)置為6個，其中1個為空白對照，噴霧處理24 h內(nèi)最好不要對施藥雜草澆水。1～4周后，稱取雜草地上部分，測量其鮮質(zhì)量、干質(zhì)量等指標(biāo)。不同雜草應(yīng)根據(jù)本身條件而定，不同劑量處理之后，待測雜草產(chǎn)生不同程度藥害表現(xiàn)情況即可。并根據(jù)施藥劑量和相應(yīng)指標(biāo)變化量得出線性回歸方程，計算出引起50%死亡的劑量RD50。

1.3 癥狀指數(shù)法

草甘膦處理雜草后，雜草會對應(yīng)出現(xiàn)葉片變黃、萎蔫等藥害癥狀，一般其嚴(yán)重程度和施藥劑量呈正相關(guān)。陳景超等根據(jù)雜草癥狀嚴(yán)重程度將其分為6個級別[12]。該方法前處理和整株檢測法一樣，待雜草噴藥后，1～4周左右出現(xiàn)藥害癥狀，可根據(jù)雜草的藥害表現(xiàn)，對應(yīng)相應(yīng)級別，記錄每個處理中每株雜草的級別，統(tǒng)計不同濃度處理雜草的總癥狀級別指數(shù)，得出線性回歸方程。癥狀指數(shù)法操作簡單，重復(fù)性好，可以同時和整株法聯(lián)用；但是由于各個癥狀級別之間的界限不明顯，植株癥狀表現(xiàn)形式劃分也帶有一定的主觀性，所以具有一定的局限性，一般不將其作為主要的檢測方法。

1.4 莽草酸含量法

草甘膦的作用機(jī)理主要是通過競爭性抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性，造成莽草酸堆積，合成過程受阻[13]，使植株不能正常生長?？剐运讲灰恢碌碾s草被草甘膦處理過后，其植株體內(nèi)莽草酸含量變化的情況也不一樣，敏感種群植株會迅速積累大量莽草酸，明顯多于抗性種群[14]。因此，通過檢測比較雜草莽草酸含量變化，可以得出雜草是否產(chǎn)生抗藥性。Vangessle 和Feng等 通過測定莽草酸含量，得出小飛蓬(Conyzacanadensis)對草甘膦的抗藥性，其結(jié)果與整株法和培養(yǎng)皿法結(jié)果相同[15-16]。楊彩宏在檢測牛筋草(Eleusineindica)對草甘膦的抗性水平的試驗中，也使用了莽草酸含量法，其結(jié)果也得到驗證[4]。莽草酸含量法操作簡單，不用大量重復(fù)試驗。用草甘膦藥液處理長勢一致的3～6葉期待測植株，以12 h為倍數(shù)設(shè)定樣品采集間隔，采集待測植株頂端葉片組織，用液相色譜儀或者紫外分光光度計測量雜草體內(nèi)莽草酸含量，依據(jù)雜草體內(nèi)莽草酸隨時間變化的趨勢可以得出雜草抗性情況。設(shè)置不同濃度的草甘膦藥液處理待測雜草，檢測莽草酸含量，也可以得出待測植株對草甘膦的抗性水平[17]。

2 其他檢測方法

2.1 EPSPS檢測法

EPSPS是草甘膦作用靶標(biāo)酶，通過測定草甘膦處理后植株靶標(biāo)酶活力的變化，檢測待測植株是否產(chǎn)生草甘膦抗藥性。Baerson等通過對剛性黑麥草(Loliumrigidum)EPSPS活力測定，檢測出不同剛性黑麥草對草甘膦產(chǎn)生不同抗性水平[18]。EPSPS檢測法類似于莽草酸含量法，但是其操作復(fù)雜，需要靈敏度高的儀器，成本也較高。而且并不是所有的抗草甘膦雜草在草甘膦處理后，其EPSPS活性都會增加，因此，不能成為抗草甘膦雜草的常用檢測方法，只適用于部分抗草甘膦雜草的檢測。

2.2 葉綠素含量法和葉綠素?zé)晒鈪?shù)法

草甘膦由植株莖葉的吸收，通過紊亂植株體內(nèi)蛋白質(zhì)合成過程，導(dǎo)致植株死亡，其雖然不屬于光合作用抑制劑類農(nóng)藥，但阮祚禧等[19]和卜貴軍等[20]認(rèn)為，草甘膦會對藍(lán)藻葛仙米(N.sphaeroides)和大豆的光合作用和葉綠素?zé)晒鈪?shù)產(chǎn)生影響，因此，通過測定葉綠素含量變化和葉綠素?zé)晒鈪?shù)能夠在一定程度上檢測抗草甘膦雜草的抗藥性水平。葉綠素含量法和葉綠素?zé)晒鈪?shù)法用不同濃度草甘膦處理長勢一致的3～6葉期待測植株，處理1～2周后，隨機(jī)采取植株頂端第2層完全展開的葉片為測量對象，以24 h為倍數(shù)設(shè)定樣品采集間隔，規(guī)定采集時間段，采集樣品。葉綠素含量測定可選用丙酮和乙醇的混合液浸提法[21]，或者HPLC等方法[22]，得出施藥后不同抗性水平植株葉綠素a、葉綠素b的含量變化。管銘等[23]和楊彩宏等[4]都曾經(jīng)利用葉綠素?zé)晒鈪?shù)法檢測假稻種群[Leersiajaponica(Makino) Honda]和牛筋草(Eleusineindica)的敏感性和抗藥性。

2.3 DNA分析法

目前，大部分雜草對草甘膦抗藥性的機(jī)理研究都圍繞雜草DNA、RNA分子方面展開。根據(jù)植物基因的改變情況和程度，也可為其抗藥性水平推斷提供依據(jù)。通過采集待測植株的樣品，提取出總DNA，參考文獻(xiàn)資料或者基因庫設(shè)計合成引物，PCR擴(kuò)增之后，獲取EPSPS基因目的片段進(jìn)行測序。通過同種雜草的同源性比對分析，可以檢測雜草抗藥性。2004年Ng等通過提取不同地區(qū)牛筋草(Eleusineindica)的DNA，測序比對EPSPS基因片段，得出抗性種群基因突變的結(jié)果[24]。2010年Gaines等通過提取長芒莧(Amaranthuspalmeri)的RNA，進(jìn)行同源性分析，也得出抗性和敏感種群之間的差異[25]。此類方法具有取樣簡單、檢測速度快、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點，而且還可以同時為分析抗性產(chǎn)生的原因提供依據(jù)；但其重復(fù)性不高，每株雜草的突變點都不同，很難得出準(zhǔn)確的抗性水平，所以較少用來作為雜草抗性的檢測方法。

2.4 RT-PCR分析法

實時熒光定量PCR(real-time PCR)技術(shù)1996年在美國推出之后，迅速在生物學(xué)各研究領(lǐng)域得到廣泛運用，已經(jīng)成為一項不可或缺的重要技術(shù)。與常規(guī)PCR相比，RT-PCR具有更強(qiáng)的特異性，并且能對模板進(jìn)行定量分析。通過采集草甘膦處理后的待測植株，提取RNA，將其RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA之后，參考文獻(xiàn)資料或者基因庫設(shè)計合成引物，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，PCR擴(kuò)增之后，獲取帶有熒光基團(tuán)的EPSPS基因目的片段，根據(jù)Ct值可以得出起始模板拷貝數(shù)[26]，反映出草甘膦處理后雜草EPSPS的表達(dá)量差異，因此根據(jù)待測雜草EPSPS表達(dá)量的差異，可以檢測雜草抗藥性。Gaines等通過提取長芒莧(Amaranthuspalmeri)的RNA，進(jìn)行RT-PCR分析，得出抗性和敏感種群之間EPSPS表達(dá)量的差異[25]。

3 結(jié)論

隨著草甘膦使用范圍的擴(kuò)大和使用量、使用年限的增加，抗草甘膦雜草種類數(shù)目快速增長[27-28]。除了本研究提及的檢測方法，雜草抗藥性檢測還有其他方法，如分蘗檢測法、花粉粒檢測法等，由于這類方法實際操作中存在不足之處，所以沒有用于雜草對草甘膦抗藥性的檢測。目前雜草對草甘膦抗藥性檢測中，運用最廣泛的是整株檢測法，該法簡單易行，可以同時進(jìn)行大量樣本檢測，而且結(jié)果準(zhǔn)確性較高，但所需時間較長。而莽草酸含量法以及葉綠素含量法、葉綠素?zé)晒鈪?shù)法前期雜草處理跟整株檢測法是相同的，因此，可以將這幾種方法結(jié)合起來同時使用，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，完善雜草對草甘膦抗藥性的檢測體系。雜草DNA、RT-PCR分析檢測法取樣簡單，準(zhǔn)確性高，雖尚處于起步階段，但值得進(jìn)行深入研究。

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