余勝 胡智明 陶厚權(quán)

●綜 述

Klotho基因與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展

余勝 胡智明 陶厚權(quán)

Klotho基因是Kuro-o等[1]在研究自發(fā)性高血壓時(shí)發(fā)現(xiàn)的與人類衰老密切相關(guān)的基因。該基因與人類心血管疾病、腎臟疾病及骨質(zhì)疏松等衰老性疾病密切相關(guān)。近年來的研究認(rèn)為Klotho基因的異常表達(dá)可能參與到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，作為一個(gè)抑癌基因參與調(diào)控多種腫瘤的生物學(xué)過程[2]。本文現(xiàn)就Klotho基因及其與腫瘤的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 Klotho基因及蛋白的生物學(xué)特性

1.1 Klotho基因結(jié)構(gòu) 人類的Klotho基因定位于染色體13q12，全長約50kb，包括5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。在Klotho基因的結(jié)構(gòu)中，有一個(gè)潛在的可變剪切位點(diǎn)存在于其mRNA上，定位于外顯子3中，如果此位點(diǎn)接受了一個(gè)50bp片段的插入，該序列末斷的兩個(gè)核苷酸TA就會(huì)與外顯子4的第一個(gè)核苷酸G一起而構(gòu)成一個(gè)終止密碼TAG，使得RNA由此截?cái)嘈纬梢粋€(gè)短的開放閱讀框，僅含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子而編碼分泌型蛋白（Klotho-S）；但如果可變剪切位點(diǎn)沒有接受此50bp片段的插入，其RNA就是一個(gè)完整的結(jié)構(gòu)，外顯子全部表達(dá)，編碼形成膜型蛋白。因此，Klotho cDNA包括全長約3 036bp的膜型Klotho cDNA及全長約1 647bp的分泌型Klotho cDNA[3]。

1.2 Klotho蛋白結(jié)構(gòu)與功能 由于Klotho mRNA剪切位點(diǎn)的存在，Klotho基因表達(dá)兩種低聚體的蛋白：含有1 012個(gè)氨基酸的膜型蛋白和含有549個(gè)氨基酸的分泌型蛋白[3]。膜型Klotho蛋白為一種單跨膜蛋白，包括一個(gè)N末端信號(hào)序列、含有兩個(gè)內(nèi)部重復(fù)序列KL1和KL2的胞外區(qū)、一個(gè)單跨膜區(qū)和一個(gè)短的胞內(nèi)區(qū)（此區(qū)為無功能區(qū)），胞外區(qū)KL1和KL2之間有一段賴氨酸-賴氨酸-精氨酸-賴氨酸序列，可能作為蛋白酶裂解位點(diǎn)，有被裂解而釋放胞外段的可能；分泌型Klotho蛋白僅含有N末端序列和KL1胞外區(qū)。Klotho的這兩種蛋白形式，有著不同的生物學(xué)特性，膜型Klotho蛋白主要作為成纖維細(xì)胞生長因子23（FGF-23）的輔助受體，為FGF23提供一個(gè)高親和性的結(jié)合位點(diǎn)[4]，參與磷酸鹽代謝的調(diào)節(jié)；分泌型Klotho蛋白可以調(diào)節(jié)多個(gè)離子通道的活性，具有潛在的糖苷酶活性，更重要的是，它能夠抑制體內(nèi)一些重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在人類衰老、衰老相關(guān)疾病及腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演重要的角色。

Klotho基因高表達(dá)于腎臟遠(yuǎn)曲小管以及腦脈絡(luò)膜，也可在胎盤、前列腺、睪丸及卵巢等性激素依賴器官及小腸中檢測到其低表達(dá)。人類以編碼分泌型Klotho蛋白為主，目前認(rèn)為，Klotho基因的表達(dá)局限于某些特定組織，但其突變后可以引起表型的改變而涉及多種組織器官，也就是說，Klotho蛋白可能作為一種內(nèi)源性循環(huán)激素存在于人體[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，給予可溶性的Klotho蛋白或Klotho過表達(dá)細(xì)胞的條件培養(yǎng)液都能有效抑制乳腺癌及胰腺癌等腫瘤細(xì)胞的生長[7-9]，并且，Klotho對(duì)腫瘤的抑制活性可能是通過其內(nèi)部的重復(fù)序列KL1來調(diào)控[9]。因此，分泌型蛋白可能為Klotho蛋白在人體內(nèi)的主要活性形式。

1.3 Klotho基因多態(tài)性 存在于Klotho基因上的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）大約有400多個(gè)，能夠影響轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的主要是位于啟動(dòng)子區(qū)的16個(gè)SNPs及位于外顯子區(qū)的15個(gè)SNPs，這些SNPs與人類多種疾病發(fā)生有關(guān)，包括心血管疾病、骨質(zhì)疏松及腎臟疾病等[10-12]。目前對(duì)其與腫瘤的關(guān)系研究較少，研究最多的是KLVS，這是Arking等[13]發(fā)現(xiàn)的一種等位基因，包含有6個(gè)SNPs，為完全連鎖不平衡，編碼區(qū)域（外顯子2區(qū)內(nèi)）有3個(gè)SNPs，其中一個(gè)為無義突變，另外兩個(gè)為F352V（rs9536314）和C370S（rs9527025），可導(dǎo)致氨基酸置換引起錯(cuò)義突變，分別為苯丙氨酸替換為纈氨酸、半胱氨酸替換為絲氨酸，影響Klotho蛋白的分泌及酶活性等。Wolf等[14]研究了1 115名德系猶太婦女，發(fā)現(xiàn)在突變體等位基因BRCA1的攜帶者中，等位基因KLOTHO-V的雜合型可以增加乳腺癌及卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，并且該突變與BRCA2之間存在著連鎖不平衡，認(rèn)為KL-VS可能是通過改變BRCA1和BRCA2基因的外顯率來增加攜帶者罹癌腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。但是，Laitman等[15]的一項(xiàng)研究卻沒有發(fā)現(xiàn)這種關(guān)系，該研究包括5 741例BRCA1及3 339例BRCA2攜帶者，發(fā)現(xiàn)KL-VS并不會(huì)改變BRCA1和BRCA2攜帶者中發(fā)生乳腺癌及卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)，不過該研究中德系猶太婦女樣本量小，且KL-VS具有顯著的種族特異性，因此，尚不能確定KL-VS與猶太德系婦女中BRCA1和BRCA2攜帶者腫瘤風(fēng)險(xiǎn)增加的相關(guān)性。Wolf等[14]的研究還發(fā)現(xiàn)，KLOTHO-V對(duì)乳腺癌細(xì)胞也存在生長抑制作用，但較野生型的Klotho對(duì)細(xì)胞的生長抑制活性下降，分泌量也顯著減少，Abramovitz等[9]在胰腺癌細(xì)胞株中同樣檢測到該功能突變體，提示這種活性減弱的KL-VS變體與胰腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。其他如啟動(dòng)子-395也存在G-A變異，該等位基因由Kawano發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為G-A替換可抑制Klotho基因的轉(zhuǎn)錄，降低Klotho蛋白的表達(dá)[16]，我國學(xué)者孟慶玲[17]發(fā)現(xiàn)Klotho基因啟動(dòng)子區(qū)G-395A多態(tài)與江蘇地區(qū)人群的胃癌發(fā)病危險(xiǎn)性呈顯著相關(guān)，攜帶A等位基因患者發(fā)生胃癌的危險(xiǎn)性明顯高于攜帶G等位基因的患者。

2 Klotho與腫瘤

2.1 Klotho基因是抑癌基因 Wolf等[7]于2008年首次提出了Klotho基因是潛在的乳腺癌的抑癌基因，免疫組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，正常乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)Klotho蛋白，而原位導(dǎo)管癌和侵襲性乳腺癌中表達(dá)卻顯著減少。隨后，研究者在胃癌[18]、結(jié)直腸癌[19]、胰腺癌[9]、肝癌[20]、肺癌[8，21]及宮頸癌[22]等多種腫瘤中也發(fā)現(xiàn)這種差異性表達(dá)；研究還發(fā)現(xiàn)，在正常乳腺上皮及輕度增生的乳腺上皮細(xì)胞中Klotho高表達(dá)，在中、重度增生的乳腺上皮及不典型性導(dǎo)管增生組織中低表達(dá)[23]，該蛋白在正常乳腺上皮、增生的乳腺上皮、原位導(dǎo)管癌及侵襲性乳腺癌中的表達(dá)水平呈逐漸下降的趨勢[7，23]，Lee等[22]也注意到Klotho mRNA在浸潤性宮頸癌樣本中表達(dá)缺失，而在宮頸癌早期或浸潤前期可以檢測到其表達(dá)。這提示Klotho的表達(dá)下降可能是腫瘤發(fā)生中的一個(gè)早期事件，并可能與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，敲除腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源性Klotho基因，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，而過表達(dá)Klotho基因的腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力明顯降低[7，21-22，24-25]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠（經(jīng)尾靜脈注射肺癌細(xì)胞A549KL）較對(duì)照組小鼠（經(jīng)尾靜脈注射肺癌細(xì)胞A549mock)的生存期顯著延長，且實(shí)驗(yàn)組小鼠肺內(nèi)形成的轉(zhuǎn)移灶也明顯較少[26]；對(duì)接種胰腺癌細(xì)胞PANC-1的小鼠給予Klotho/Klotho-S治療，可顯著抑制小鼠體內(nèi)的腫瘤生長[9]，這都表明Klotho基因?qū)δ[瘤細(xì)胞具有生長抑制作用并可降低其惡性表型。總之，現(xiàn)有的研究資料強(qiáng)力提示Klotho基因在腫瘤的生物學(xué)進(jìn)程中扮演著抑癌基因的角色。

抑癌基因失活的表觀遺傳學(xué)改變主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑等，為探尋Klotho基因沉默的表觀遺傳機(jī)制，研究者運(yùn)用重亞硫酸鹽測序PCR、甲基化特異性PCR等技術(shù)，檢測到腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞株中Klotho基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化狀態(tài)及啟動(dòng)子相關(guān)組蛋白去乙?；癄顟B(tài)，在對(duì)這些腫瘤細(xì)胞系以單獨(dú)或聯(lián)合DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（5-氮雜-2′-脫氧胞苷）及組蛋白去乙?；敢种苿ㄇ琶顾谹）后，可使Klotho的表達(dá)部分或完全恢復(fù)[9，20，22，24-25]。因此，Klotho基因在腫瘤中表達(dá)下調(diào)或缺失與DNA甲基化和組蛋白去乙酰化有關(guān)。

2.2 Klotho與腫瘤的臨床病理關(guān)系 通過對(duì)Klotho表達(dá)與腫瘤患者臨床病理特征之間的關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白表達(dá)陽性與胃癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)性[18]，Klotho mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯下降，并與患者年齡分布有顯著相關(guān)性，特別是50歲以后年齡段，隨著年齡的遞增，Klotho mRNA表達(dá)呈現(xiàn)遞減[19]。Usuda等[27-28]認(rèn)為，對(duì)手術(shù)切除的小細(xì)胞肺癌及大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌肺癌患者，Klotho陽性表達(dá)預(yù)示較好的臨床預(yù)后。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，該基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)與胃癌及肝癌患者的預(yù)后也密切相關(guān)[20，24]。因此，檢測腫瘤組織中Klotho基因的表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)或許可以作為腫瘤診斷及預(yù)后判斷的一種可靠手段。

2.3 Klotho調(diào)控的腫瘤相關(guān)信號(hào)通路 Klotho參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，可能是依賴于調(diào)控細(xì)胞的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而實(shí)現(xiàn)，通過對(duì)細(xì)胞膜上的特殊受體活性的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)傳遞異常，而出現(xiàn)這些通路的傳遞受阻或異?；钴S，正常的調(diào)控紊亂，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生或者促進(jìn)其發(fā)展。

Insulin/IGF-1通路是與生命進(jìn)化密切相關(guān)的信號(hào)通路，該信號(hào)可以活化Ras-MARK和PI3K/Akt通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。Wolf等[7]發(fā)現(xiàn)，敲除乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的Klotho基因可促進(jìn)IGF-1所致的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的磷酸化，而過表達(dá)Klotho基因則減弱IGF-1誘導(dǎo)的IGF-1受體、胰島素受體底物1、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1、2的磷酸化；過表達(dá)Klotho基因同樣可以減弱胰腺癌細(xì)胞Panc1、MiaPaCa2、Colo357中這些受體的磷酸化[9]。Chen等[21]研究發(fā)現(xiàn)Klotho過表達(dá)可以顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖，但能被IGF-1所逆轉(zhuǎn)，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Klotho基因的肺癌細(xì)胞中IGF-1及Insulin受體的磷酸化明顯受到抑制，而給予Klotho基因沉默的肺癌細(xì)胞以IGF-1或insulin刺激后，IGF-1/Insulin受體的磷酸化顯著增加?？梢?，Klotho對(duì)腫瘤的生長抑制作用部分可能通過抑制Insulin/IGF-1信號(hào)通路來完成。

Wnt信號(hào)通路是一條在進(jìn)化上保守的信號(hào)途徑，該通路的異常激活與多種腫瘤發(fā)生緊密相關(guān)。Liu等[29]在研究Klotho的抗衰老特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，Klotho蛋白是一種分泌型的Wnt拮抗劑，可能通過減弱Wnt蛋白與其受體的結(jié)合而抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。近年的研究認(rèn)為，Klotho在腫瘤中的表達(dá)缺失可激活異常的Wnt通路。在宮頸癌及肺癌細(xì)胞系中過表達(dá)Klotho/Klotho-S可使這些細(xì)胞中活化的β-catenin水平顯著減少，并抑制T細(xì)胞因子/β-catenin下游靶基因（如原癌基因c-Myc、CyclinD1）的轉(zhuǎn)錄，而在Klotho沉默的肺癌細(xì)胞系中無此抑制作用[8，22，30]，這些跡象表明Klotho/Klotho-S可以抑制腫瘤細(xì)胞中Wnt信號(hào)傳遞。Camilli等[31]指出，Klotho可阻止HSPG介導(dǎo)的Wnt5A攝取及信號(hào)傳遞，其表達(dá)缺失增加了黑色素瘤細(xì)胞中Wnt5A的表達(dá)以及Wnt5A所介導(dǎo)的細(xì)胞侵襲遷移潛能；此外，Klotho-S異位表達(dá)可以減少肺癌細(xì)胞系中Wnt3a mRNA的表達(dá)水平，且Klotho-S還可抑制Wnt3a的內(nèi)化，使功能性Wnt3a減少，從而抑制Wnt3a信號(hào)傳遞及其介導(dǎo)的細(xì)胞生長[8]。因此，Klotho在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)缺失或下降可激活Wnt3a、Wnt5a相關(guān)的經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路或非經(jīng)典的Wnt通路，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長、遷移等。

上皮向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變（EMT）是組織損傷后機(jī)體自我修復(fù)的生理機(jī)制之一，也可參與多種臟器的病理過程，如肝、腎、心的纖維化，也可促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。Chang等[30]發(fā)現(xiàn)Klotho的異位表達(dá)可通過上調(diào)宮頸癌細(xì)胞中的細(xì)胞黏附相關(guān)基因（E-cadherin）、下調(diào)神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）以及減少基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）7、9及EMT轉(zhuǎn)錄因子（Slug、Twist）的表達(dá)，而抑制EMT發(fā)生，減弱腫瘤細(xì)胞的活力及侵襲力。TGF-β1是誘導(dǎo)EMT發(fā)生的最重要的生長因子，其主要通過誘導(dǎo)Smad信號(hào)蛋白參與EMT過程，TGF-β1與II型TGF-β受體的結(jié)合（TGFβR2）可以激活I(lǐng)型受體（TGFβR1），活化的TGFβR1使Smad2/3磷酸化增加，磷酸化的Smad2/3轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核后作為轉(zhuǎn)錄因子存在，調(diào)節(jié)下游靶基因TGF-β1的表達(dá)。Doi等[26]認(rèn)為Klotho抑制肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中TGF-β1誘導(dǎo)的EMT發(fā)生，Klotho與TGFβR2結(jié)合，以競爭性抑制或者改變受體構(gòu)象的方式阻礙TGF-β1與TGFβR2結(jié)合，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Smad3磷酸化，影響TGF-β1信號(hào)傳遞，阻礙EMT過程，減少腫瘤轉(zhuǎn)移。

此外，Klotho可以提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)bFGF的敏感性而促進(jìn)FGF通路的活化，上調(diào)CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β的表達(dá)來抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長，通過提高M(jìn)CF-7中p53的表達(dá)及胃癌細(xì)胞AGS、MKN28中p21的表達(dá)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長周期，抑制細(xì)胞增殖，上調(diào)bax和下調(diào)bcl-2基因以促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549的凋亡[7，21，24]。

3 小結(jié)與展望

目前認(rèn)為Klotho基因是一種抑癌基因，該基因的功能性缺失可通過影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的各個(gè)環(huán)節(jié)，使細(xì)胞生長、增殖及凋亡作用失衡，而使細(xì)胞癌變。Klotho基因的抗衰老特性所表現(xiàn)出的腎臟、心血管保護(hù)作用，或許可能為腫瘤的靶向治療提供新的思路；而其與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，或許可以成為評(píng)估腫瘤轉(zhuǎn)移潛能、預(yù)后判斷的新指標(biāo)，甚至成為腫瘤晚期治療的突破口。但是，對(duì)Klotho基因調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)過程仍缺乏足夠認(rèn)識(shí)，需要進(jìn)一步深入研究。

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2013-11-21）

（本文編輯：田云鵬）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院胃腸外科、浙江省胃腸病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（余勝、陶厚權(quán)）；海寧市第三人民醫(yī)院（胡智明）

陶厚權(quán)，E-mail:taohouquan2008@aliyun.com