戴進(jìn) 侯華成 綜述 蔣青審閱

（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院關(guān)節(jié)中心，南京210008）

深靜脈血栓的血清分子標(biāo)志物*

戴進(jìn) 侯華成 綜述 蔣青**審閱

（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院關(guān)節(jié)中心，南京210008）

深靜脈血栓（deep vein thrombosis,DVT）是指在下肢一條或多條深靜脈中產(chǎn)生血塊，常發(fā)生于血流緩慢、血管壁受損以及血液粘稠度增厚的情況下。DVT 松脫后走到肺動脈而形成肺栓塞（pulmonary embolism,PE），而 PE 是 一 種致命性疾病。然而，多數(shù)急性DVT患者并不出現(xiàn)明顯癥狀，這使得DVT的診斷難度增加。以往DVT的診斷主要依賴于影像學(xué)檢查，包括超聲、靜脈造影、CT掃描成像。目前DVT的診斷不僅依賴于影像學(xué)檢查，血清學(xué)檢查亦可用于DVT的輔助診斷。血清學(xué)檢查中分子被稱為血清分子標(biāo)志物，包括 D 二聚體、P-選擇素、凝血因子Ⅷ、凝血酶、一氧化氮合酶、炎性細(xì)胞因子、微粒、纖維蛋白單體、白細(xì)胞計數(shù)等。本綜述旨在分析血清分子標(biāo)志物在DVT診斷和治療過程中所發(fā)揮的作用。

1 P-選擇素

P-選擇素是細(xì)胞粘附分子選擇素家族中的一員，選擇素家族還包括 E-選擇素和 L-選擇素，主要存儲在未受刺激的血小板顆粒膜和內(nèi)皮細(xì)胞中。P選擇素 糖 蛋 白 配 體 1（P-selectin glycoprotein ligand 1,PSGL-1）是 P選擇素在體內(nèi)的主要配體，主要表達(dá)于白細(xì)胞，少量表達(dá)于血小板。在細(xì)胞活化過程中，P-選擇素被重新分配到細(xì)胞表面，且部分以可溶性形式sP-選擇素釋放到血液循環(huán)中[1]。P-選擇素與 PSGL-1的相互作用促進(jìn)了白細(xì)胞的趨動，并且從血液中將白細(xì)胞捕獲，使其聚集在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面。P-選擇素與PSGL-1的相互作用在血栓形成過程中發(fā)揮了重要作用[2,3]。Palabrica 等[2]研究表明，P-選擇素可以影響血栓中的纖維蛋白沉積。使用抗P-選擇素抗體特異性地通過阻斷 P-選擇素信號通路，不僅抑制白細(xì)胞粘附于血小板，而且抑制纖維蛋白在血栓的沉積。Miszti-Blasius等[3]對野生型及 PSGL-1 基因敲除小鼠注射膠原加腎上腺素，可以觀察到PSGL-1基因敲除小鼠相比野生型小鼠出現(xiàn)輕微的血小板減少癥，纖維蛋白沉積減少并且形成血栓的血管數(shù)減少。缺乏PSGL-1可以抑制白細(xì)胞和血小板的相互作用，從而減少血栓形成的潛力。總之，抑制 P-選擇素/PSGL-1 信號通路可以有效抑制血栓的形成。

最近研究表明P-選擇素是DVT形成的危險因素。Rectenwald 等[4]在超聲診斷有 DVT、超聲診斷無DVT 以及一般健康人群中測定 P-選擇素，發(fā)現(xiàn) DVT患者中可溶性 P-選擇素濃度顯著增高，提示 P-選擇素測定可用于評估 DVT 的風(fēng)險。Ramacciotti等[5]評估了聯(lián)合應(yīng)用P-選擇素、其他生物標(biāo)志物以及臨床表現(xiàn)在 DVT 診斷中的效能，當(dāng) sP-選擇素高于 90 μg/ml，聯(lián)合威爾斯評分≥2，診斷DVT的特異性為96%，陽性預(yù)測值為 100%；當(dāng) sP-選擇素低于 60 μg/ml，聯(lián)合威爾斯評分＜2，排除DVT的敏感性為99%，特異性為33%，陰性預(yù)價值測為96%。該研究提出，sP-選擇素聯(lián)合威爾斯評分可用于診斷及排除DVT形成。

P-選擇素基因中的一個單核苷酸多態(tài)性rs6136被報道與靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism, VTE）相關(guān)，這個單核苷酸多態(tài)性對應(yīng)的基因序列變化 對 應(yīng) 著 P-選 擇 素 氨 基 酸 序 列 的 變 化（thr715/ pro715）[6]。Ay 等[7]報道攜帶 pro715 的個體表現(xiàn)為明顯低的 P-選擇素濃度，他們還觀察到攜帶 pro715 的個體表現(xiàn)出更高的VTE發(fā)生率。

2 D-二聚體

D-二聚體是一種特殊的由纖溶系統(tǒng)介導(dǎo)的交聯(lián)纖維蛋白分解產(chǎn)物。凝血酶使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成可溶性的纖維蛋白單體，然后自發(fā)聚合形成可溶性聚合物。鈣存在的條件下，凝血酶可激活凝血因子Ⅷ，從而交聯(lián)纖維蛋白聚合物形成交聯(lián)纖維蛋白。隨后，纖溶系統(tǒng)裂解交聯(lián)纖維蛋白產(chǎn)生D-二聚體。由于凝血酶和凝血因子Ⅷ參與了D-二聚體的形成，認(rèn)為每當(dāng)有凝血酶激活形成交聯(lián)纖維蛋白,如發(fā)生DVT時，D-二聚體應(yīng)該升高。許多研究亦證實了D-二聚體與血栓 的 關(guān) 聯(lián)。Khaira 和 Mann[8]評估了 80 例 DVT患者的血漿 D-二聚體濃度，在這些患者中，血漿 D-二聚體濃度對應(yīng)DVT診斷的敏感性為96%，特異性為40%。因而，作者認(rèn)為正常的血漿 D-二聚體濃度可作為排除 DVT 的依據(jù)，但 D-二聚體仍不能作為診斷DVT的特定指標(biāo)，因為它在其他一些常見的臨床情況下也會升高，如肝臟疾病、妊娠、最近的創(chuàng)傷或手術(shù)、腫瘤、出 血 、多發(fā)傷等[9]。Bozic 等[10]比較了 6 種 D-二聚體的檢測方法，結(jié)果顯示每個D-二聚體檢測方法都可以用于排除DVT的形成。D-二聚體濃度隨年齡的增長而增加，使得其在老年患者中診斷DVT的特異性降低，因此 D-二聚體在老年人群中的應(yīng)用價值較低。Douma 等[11]為老年患者設(shè)置了一個新的 D-二聚體濃度拐點（患者年齡×10）μg/L。D-二聚體檢測最常用于VTE可疑患者的評估，有VTE臨床表現(xiàn)的患者如同時表現(xiàn)為D-二聚體濃度升高，則被認(rèn)為患有 VTE[12]。

此外，D-二聚體濃度在評估 VTE 治療效果以及預(yù)測VTE復(fù)發(fā)風(fēng)險方面也發(fā)揮了作用。研究顯示停止抗凝后 1個月的 VTE 患者中，D-二聚體水平異?；颊叩腣TE復(fù)發(fā)風(fēng)險顯著升高，而繼續(xù)抗凝治療后VTE 風(fēng)險降低[13]。Cosmi等[14]發(fā)現(xiàn)在停用維生素 K 拮抗劑的前3個月內(nèi)重復(fù)檢測D-二聚體可以鑒定出低復(fù)發(fā)風(fēng)險亞組，該亞組的患者無需長期抗凝。最近還有研究提出急性 PE 患者的 D-二聚體升高與短期（＜30 d）和 3 個月的死亡率相關(guān)[15]，提示 D-二聚體可用于PE患者的危險分層。

3 凝血因子Ⅷ

凝血因子Ⅷ是一種糖蛋白輔因子，由血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞以及肝竇內(nèi)皮細(xì)合成分泌。其在血液循環(huán)中主要與 von Willebrand 因子結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。在體內(nèi)環(huán)境中，凝血酶是其唯一的激活物，使其轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜃英鴄。在凝血酶的激活下，凝血因子Ⅷ從穩(wěn)定的復(fù)合物中游離出來，并與凝血因子IX作用，使其轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜃英鵤。凝血因子Ⅸa與凝血因子Ⅴa協(xié)同刺激產(chǎn)生更多的凝血酶。凝血酶可使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，從而參與交聯(lián)反應(yīng)，形成血栓。

高濃度的凝血因子Ⅷ是VTE發(fā)生及復(fù)發(fā)的獨立危險因素，且表現(xiàn)為劑量依賴性。Kraaijenhagen等[16]提出凝血因子Ⅷ濃度增加 10 IU/dl，VTE 的發(fā)生風(fēng) 險 增加 10%，而復(fù) 發(fā) 風(fēng)險 增加 24%。 同 時，Kyrle等[17]也發(fā)現(xiàn)血漿高濃度凝血因子Ⅷ與復(fù)發(fā)性 VTE 的風(fēng)險相關(guān)。

有學(xué)者在遺傳方面研究了血栓形成和凝血因子Ⅷ之間的關(guān)系。Soria 等[18]發(fā)現(xiàn)凝血因子Ⅷ的濃度與18號染色體上的一個數(shù)量性狀位點（QTL）相關(guān)，該位點與靜脈血栓發(fā)生具有相關(guān)性。一個單核苷酸多態(tài)性rs1800291 也被證實與凝血因子Ⅷ濃度具有相關(guān)性[19]。

Singh 等[20]在下腔靜脈血栓形成的小鼠模型中通過人類單克隆抗體部分抑制凝血因子Ⅷ，發(fā)現(xiàn)該抗體能明顯抑制血栓形成，而且未引起自發(fā)性出血風(fēng)險。最近有研究報道，在靜脈血栓小鼠模型中部分抑制凝血因子Ⅷ與完全抑制凝血因子Ⅷ的抗凝效果基本相同，部分抑制凝血因子Ⅷ還可以避免過度抗凝引起的出血風(fēng)險[21]。

4 凝血酶

凝血酶是凝血級聯(lián)反應(yīng)中加速的關(guān)鍵因子，其可作為血小板、凝血因子V、凝血因子Ⅷ的激活物，并形成正反饋，產(chǎn)生大量的凝血酶，促進(jìn)纖維蛋白原向纖維蛋白轉(zhuǎn)化，最終形成血栓。凝血酶已被證實是VTE的危險因素之一，可作為評估個人血栓發(fā)生風(fēng)險的分子指標(biāo)。Dargaud 等[22]發(fā)現(xiàn)有出血傾向患者的凝血酶濃度降低，而在 VTE 患者中增高。van Hylckama Vlieg 等[23]認(rèn)為增高的內(nèi)源性凝血酶濃度與 DVT 發(fā)生的風(fēng)險相關(guān)，但與 DVT 的復(fù)發(fā)風(fēng)險無關(guān)。Segers等[24]評估了凝血酶濃度是否受凝血系統(tǒng)相關(guān)基因的遺傳多態(tài)性影響，研究發(fā)現(xiàn)凝血因子Ⅱ、纖維蛋白原、凝血因子Ⅹ、凝血因子Ⅻ、組織因子途徑抑制物等基因中多態(tài)性與凝血酶濃度相關(guān)。

5 內(nèi)皮型一氧化氮合酶

內(nèi)皮型一氧化氮合酶可以在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生一氧化氮。一氧化氮在維持血管穩(wěn)態(tài)的中發(fā)揮重要作用，它可以調(diào)節(jié)多種生理過程，包括血小板粘附、白細(xì)胞粘附、內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管平滑肌細(xì)胞的遷移，也可以參與血管修復(fù)。這些生理過程一旦發(fā)生障礙均可導(dǎo)致動脈粥樣硬化和血栓性疾病[25]。內(nèi)皮型一氧化氮合酶通過控制血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮的合成而對血管穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生影響，從而影響血栓的發(fā)生。內(nèi)皮型一氧化氮合酶由NOS3基因編碼，有研究報道，NOS3 基因多態(tài)性 rs1799983與 冠 狀 動脈疾病和 VTE 的 風(fēng) 險 相 關(guān)[26]。 Qin 等[27]的 研 究 也 證 實 了rs1799983與關(guān)節(jié)置換術(shù)后下肢DVT的發(fā)生相關(guān)。

6 炎性細(xì)胞因子

越來越多的證據(jù)表明C反應(yīng)蛋白、白介素1b、白介素6、白細(xì)胞介素8、白介素10等炎性細(xì)胞因子與靜脈血栓相關(guān)。炎性細(xì)胞因子可能會影響組織因子的表達(dá)，組織因子是外源性凝血途徑的引發(fā)劑，炎性因子通過該途徑可觸發(fā)血栓性疾病的發(fā)生[28]。實驗室研究表明，C反應(yīng)蛋白濃度升高會導(dǎo)致VTE發(fā)生風(fēng)險顯著升高[29]。然而，Tsai等[30]的一項前瞻性研究發(fā)現(xiàn)C反應(yīng)蛋白濃度和血栓的發(fā)生之間并無相關(guān)性。此外，F(xiàn)ox 和 Kahn[31]綜合多項研究數(shù)據(jù)認(rèn)為 C 反應(yīng)蛋白在VTE診斷中的敏感性為77%，特異性為66%。

Reitsma 和 Rosendaal[32]評 估 了 VTE 和 其 他 炎 性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子a、白介素1β、白介素6、白介素8、白介素10、白介素12p70等的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子a、白介素6和白介素8是VTE的危險因素，而白介素10對應(yīng)VTE的風(fēng)險降低，白介素12p70和 白 介 素 1β 與 VTE 不 具 有 相 關(guān) 性 。 Poredos 和Jezovnik[33]發(fā) 現(xiàn) 特 發(fā) 性 VTE 患 者 不 僅 表 現(xiàn) 為 促 炎 性細(xì)胞因子（如白介素6和白介素8）的濃度增高，還表現(xiàn)為抗炎因子（如白介素10）的濃度降低。

基于炎性細(xì)胞因子和VTE之間的相關(guān)性，炎性細(xì)胞因子對應(yīng)基因的基因多態(tài)性也可能對VTE的易感性產(chǎn)生影響。Beckers等[34]對 49 個炎性細(xì)胞因子的基因多態(tài)性在VTE組及對照組進(jìn)行了相關(guān)性研究，結(jié)果顯示白介素1a、白介素4、白介素6和白介素13與 VTE 具有相關(guān)性。Zee 等[35]在 32 個炎性細(xì)胞因子對應(yīng)基因中選擇了51個基因多態(tài)性，通過前瞻性隊列研究評估了這些基因多態(tài)性與VTE風(fēng)險的相關(guān)性，結(jié)果顯示白介素1β基因中的rs1143634和白介素10基因中的rs1800872與特發(fā)性VTE的風(fēng)險相關(guān)。

7 微粒

微 粒 是 指 0.1～1.0 μm 之 間 的 物 體 ，主 要 是 血 小板、白細(xì)胞、紅細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜在細(xì)胞凋亡或活化過程中釋放的膜性小囊，可通過檢測微粒表面抗原而明確其細(xì)胞來源[36]。以往研究認(rèn)為，微粒是沒有生物功能的細(xì)胞垃圾，但最近研究發(fā)現(xiàn)微粒可能在炎癥、凝血以及血管功能中發(fā)揮作用。微粒濃度增高提示高凝狀態(tài)且預(yù)后不佳，且發(fā)生VTE的風(fēng)險增高[37]。此外，微粒是血液循環(huán)中組織因子的主要載體，而組織因子是血栓形成的主要刺激物。Ramacciotti等[38]在小鼠靜脈血栓模型中證實微粒的濃度和組織因子活性直接相關(guān)。攜帶有組織因子的微粒最終可能成為一個有用的血栓風(fēng)險生物標(biāo)志物。

最近研究顯示微?？蓴y帶RNA及DNA。在體外，微?？蓴y帶細(xì)胞核DNA 和RNA以及細(xì)胞質(zhì)DNA和RNA，尤其是低分子量RNA。微粒可以將低分子量RNA由內(nèi)皮祖細(xì)胞轉(zhuǎn)運至內(nèi)皮細(xì)胞，從而刺激血管形成[39]。

8 纖維蛋白單體

血栓性反應(yīng)涉及多個程序，如血小板激活、凝血系統(tǒng)活性增強以及纖維蛋白形成。纖維蛋白單體是凝 血 酶 誘 導(dǎo) 的 纖 維 蛋 白 原 降 解 產(chǎn) 物 。Vogel等[40]提出，定量檢測纖維蛋白單體可用于術(shù)后下肢DVT的早期診斷。纖維蛋白單體檢測用于診斷DVT的特異性為 73.2%，敏感性為 91.7%。所有纖維蛋白單體異常的DVT 患者至少在出現(xiàn)血栓臨床表現(xiàn)的 1 d前表現(xiàn)出病理性增高的纖維蛋白單體濃度。Reber等[41]認(rèn)為無DVT癥狀患者連續(xù)測定纖維蛋白單體并不能預(yù)見或排除關(guān)節(jié)置換術(shù)后DVT的發(fā)生。

9 白細(xì)胞計數(shù)

多種藥物均可刺激白細(xì)胞的產(chǎn)生，從而增強其促凝血活性而啟動外源性血栓形成通路。在DVT發(fā)生的早期，白細(xì)胞發(fā)生遷移和粘附。Schaub 等[42]在大鼠靜脈血栓模型中發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞計數(shù)在血管結(jié)扎后顯著升高，升高程度與血流阻斷時間密切相關(guān)。Tefferi等[43]評估了白細(xì)胞計數(shù)和血栓形成的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞計數(shù)與血栓形成高度相關(guān)。

目前已有很多用于輔助診斷DVT形成的生物標(biāo)志物，根據(jù)DVT或血栓性疾病發(fā)生的病理機制可大致分為兩類：一類是凝血相關(guān)標(biāo)志物，如 D-二聚體，凝血因子Ⅷ，凝血酶和纖維蛋白單體；另一類是炎癥性標(biāo)志物，如 P-選擇素，炎性細(xì)胞因子，內(nèi)皮型一氧化氮合酶，白細(xì)胞計數(shù)和微粒等。上述生物標(biāo)志物在理論上均與DVT形成的病理機制相關(guān)，并在診斷DVT以及判斷DVT預(yù)后時發(fā)揮不同的作用。

D-二聚體已廣泛應(yīng)用于血栓性疾病的診斷。僅血漿 D-二聚體水平正?？蓡为氂糜谂懦\斷 DVT[8]。由于各個研究得出的結(jié)論不同，目前尚無其他指標(biāo)可單獨用于DVT的診斷，這可能是由于種族差異、環(huán)境差異、選標(biāo)準(zhǔn)差異、研究方法差異以及統(tǒng)計方法差異等造成。聯(lián)合使用兩種生物標(biāo)志物或聯(lián)合使用一種生物標(biāo)志物與某個臨床評分可以提高DVT診斷的敏感性和特異性，如sP-選擇素與威爾斯評分聯(lián)合使用可用于明確診斷以及排除診斷 DVT[5]。

所有生物標(biāo)志物均可用于評估DVT的發(fā)生風(fēng)險，D-二聚體、凝血因子Ⅷ和凝血酶的敏感性和特異性較高。持續(xù)高水平的 D-二聚體、凝血因子Ⅷ及凝血酶不僅提示DVT的發(fā)生風(fēng)險增加，而且DVT的復(fù)發(fā) 風(fēng) 險 也 大 大 增 加[13,16,23]。 D-二 聚 體 還 可 用 于 評 估VTE治療過程中的復(fù)發(fā)風(fēng)險，新發(fā)VTE后3個月內(nèi)重復(fù)測定D-二聚體，可以根據(jù)其濃度將患者分為VTE 復(fù)發(fā)高危組及 VTE 復(fù)發(fā)低危組[14]。

遺傳因素在血栓形成過程中也發(fā)揮了一些作用?？鼓腹δ苋毕荨⒌鞍證功能缺陷以及蛋白S功能缺陷，凝血因子Ⅴ基因突變、凝血酶原基因突變，血型以及高同型半胱氨酸血癥都是導(dǎo)致血栓發(fā)生的遺傳因素[44-46]。此外，P-選擇素，凝血因子Ⅷ，內(nèi)皮型一氧化氮合酶以及炎性細(xì)胞因子的基因多態(tài)性與VTE的發(fā)生相關(guān)。

目前，靜脈造影是診斷 DVT 最可靠的方法[47]，但由于操作復(fù)雜，且具有創(chuàng)傷性，無法用于DVT的常規(guī)篩查。因此，具有高靈敏度和高特異性，可用于早期診斷DVT的生物標(biāo)志物檢測在臨床應(yīng)用中顯得十分重要。而生物標(biāo)志物在預(yù)測DVT方面發(fā)揮的作用有限，聯(lián)合使用兩種生物標(biāo)志物或聯(lián)合使用一種生物標(biāo)志物與某個臨床評分可以提高DVT診斷的敏感性和特異性[5]。在治療方面，D-二聚體和凝血因子Ⅷ可用于DVT患者抗凝治療期間評估DVT的復(fù)發(fā)風(fēng)險。P-選擇素、凝血因子Ⅷ和白介素10在血栓形成過程中發(fā)揮的作用提示我們，它們的抑制劑或抗炎細(xì)胞因子可作為治療血栓的新選擇。遺傳因素在DVT形成過程中發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步的全基因組測序和全基因組相關(guān)性研究可能有助于闡明血栓形成的機制，最終提出預(yù)防DVT的策略，降低DVT的發(fā)病率和死亡率。

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國家杰出青年基金（81125013）；國家自然科學(xué)基金面上項目（30973046，81271945）

**通信作者：蔣青，E-mail:qingj@nju.edu.cn