張元政， 邢 新， 楊 超

綜 述

脂肪來源干細胞修復創(chuàng)面的研究進展

張元政， 邢 新， 楊 超

創(chuàng)面； 脂肪來源干細胞； 臨床研究

創(chuàng)面修復是指機體遭受外力作用后，皮膚肌肉等組織出現(xiàn)離斷或損傷后的修復過程，其中包括各種組織的再生和肉芽組織增生瘢痕形成等復雜的病理生理過程。一般的創(chuàng)面通過縫合可促進其愈合。而大面積燒傷、擠壓傷、糖尿病患者，因創(chuàng)面損傷大，愈合能力差，往往形成不愈合創(chuàng)面。目前，臨床多采用皮瓣或皮片移植來修復此類創(chuàng)面，但是存在著供皮區(qū)組織缺損及瘢痕形成等缺點。干細胞技術(shù)為皮膚組織的修復提供了新的思路。常用的干細胞包括胚胎干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)、人工誘導多能干細胞等。ADSCs是Zuk等[1]從脂肪組織中獲取的一類多能干細胞。ADSCs具有取材方便、來源充足、容易培養(yǎng)等優(yōu)點，且具有向3個胚層分化的能力，并可以分泌多種細胞因子[2]。在創(chuàng)面修復中，將ADSCs結(jié)合或者不結(jié)合的支架材料植入皮膚缺損處，通過向表皮細胞分化及細胞因子作用等來修復創(chuàng)面。ADSCs與骨髓間充質(zhì)干細胞相比，甚至表現(xiàn)出更好的創(chuàng)面愈合能力[3]。

1 ADSCs促進創(chuàng)面愈合的機制

1.1 旁分泌作用 生長因子或細胞因子能促進相應細胞遷徙、增生、收縮、分化，改善局部組織的微環(huán)境，加快創(chuàng)面的愈合。ADSCs能分泌多種生長因子，調(diào)控周邊的細胞。

常見的生長因子包括：血小板源性生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等。Lee等[4]將皮膚角質(zhì)細胞與成纖維細胞共同放置于50%ADSCs條件培養(yǎng)基(conditioned medium of ASCs, ASC-CM)中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，ASC-CM上調(diào)了成纖維細胞Ⅰ型膠原蛋白的表達，促進成纖維細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白。在體外創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)，ASC-CM提高了角質(zhì)細胞與成纖維細胞的增殖能力，增強了成纖維細胞收縮能力。Moon等[5]將角質(zhì)細胞放置于低氧條件下的ASC-CM中培養(yǎng)。通過DNA基因片段的分析，篩濾了290個發(fā)生2倍以上改變的基因片段，發(fā)現(xiàn)被調(diào)低的基因片段大部分與細胞黏附相關(guān)，與DNA復制相關(guān)的片段沒有一個被調(diào)低，與細胞周期相關(guān)的基因片段則被大部調(diào)高。角質(zhì)細胞的增殖、遷徙能力獲得顯著提高。對細胞因子的分析中，發(fā)現(xiàn)了肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)、成纖維細胞生長因子-1(fibroblast growth factor-1, FGF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β3(transforming growth factor-β3, TGF-β3)、VEGF、白介素6(interleukin-6, IL-6)、集落刺激因子(colony stimulating factor， CSF)含量的提升。Kim等[6]發(fā)現(xiàn)，ADSCs不僅可以通過細胞間的直接接觸，也可以通過旁分泌作用，促進成纖維細胞的增殖和成纖維細胞向創(chuàng)面遷徙。ASC-CM通過上調(diào)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、纖維連接蛋白和蕭條MMP-1 mRNA的表達，促進成纖維細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白。在動物實驗中，ADSCs能顯著減小創(chuàng)面面積，加速上皮化。

1.2 ADSCs分化為組織細胞來修復創(chuàng)面 ADSCs具有多向分化潛能，能分化為組織細胞來修復創(chuàng)面。Altman等[7]以絲蛋白-殼聚糖支架種植綠色熒光蛋白-1標記的ADSCs后用于鼠類創(chuàng)面，術(shù)后2周實驗組創(chuàng)面部位血管密度較對照組大，成纖維熱休克蛋白、平滑肌肌動蛋白和綠色熒光蛋白標記物陽性，并可見ADSCs 分化成上皮細胞。由此可見，ADSCs能分化形成血管、內(nèi)皮、表皮，修復組織缺損。

1.3 ADSCs促進血管長入創(chuàng)面 局部血運循環(huán)對于創(chuàng)面愈合非常重要，血液循環(huán)一方面可保證組織再生所需要的氧和營養(yǎng)，另一方面對壞死物質(zhì)的吸收及控制局部感染起著重要作用。ADSCs用于創(chuàng)面修復能明顯提高創(chuàng)面的新生血管密度[8-15]，其機制在于ADSCs旁分泌VEGF、bFGF等細胞因子，促進了血管生長。ADSCs能向血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞分化。Zamora等[9]將ADSCs種植于具有三維結(jié)構(gòu)的聚乙二醇-纖維蛋白凝膠，培養(yǎng)3 d后細胞開始出現(xiàn)管狀結(jié)構(gòu)，將其種植于動物模型，其內(nèi)可發(fā)現(xiàn)紅細胞，血管內(nèi)皮特異性標志物vWF呈陽性，表示管狀結(jié)構(gòu)確實是血管內(nèi)皮。

2 優(yōu)化ADSCs治療創(chuàng)面效果的新技術(shù)

2.1 基因改造技術(shù) 基因強化技術(shù)是利用基因工程技術(shù)將編碼特定功能因子的基因轉(zhuǎn)入細胞中，使轉(zhuǎn)染細胞表達目的產(chǎn)物。目前研究轉(zhuǎn)入的目的基因，大部分是調(diào)控生長因子的基因，通過調(diào)整特定生長因子的分泌水平，進而調(diào)控細胞的增值、遷徙、分化，加速創(chuàng)面愈合?；驈娀夹g(shù)目前常用的有特定質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，即通過逆轉(zhuǎn)錄或非逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。

Nauta等[16]使用編碼VEGF的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ADSCs，通過在老鼠創(chuàng)傷模型應用中發(fā)現(xiàn)，極大地增快了創(chuàng)面的愈合時間，第8天創(chuàng)面的愈合水平，相當于普通ADSCs對照組10～12 d的愈合水平。組織學檢查顯示，創(chuàng)面纖維蛋白和膠原沉積較對照組增多。Song等[17]通過逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，將MYC基因和AKT基因轉(zhuǎn)染ADSCs，轉(zhuǎn)染MYC后的ADSCs在與血管內(nèi)皮細胞的共培養(yǎng)中，血管內(nèi)皮細胞構(gòu)成的管狀結(jié)構(gòu)明顯增多，可見VEGF分泌明顯增多，而MYC和AKT共轉(zhuǎn)染的ADSCs在ELISA實驗中，表現(xiàn)出有更多的VEGF分泌。在動物創(chuàng)傷模型中，CA-Akt/v-myc hASCs條件培養(yǎng)基相比普通ASC條件培養(yǎng)基，創(chuàng)面愈合更快。組織學檢查發(fā)現(xiàn)，CA-Akt/v-myc hASCs炎癥反應更小，上皮細胞和膠原沉積與正常上皮更加接近。

2.2 細胞膜片技術(shù) 細胞膜片是近年興起的一種組織工程新技術(shù)，相比種子細胞，其擁有三維結(jié)構(gòu)，保留了細胞培養(yǎng)時分泌的細胞外基質(zhì)與細胞因子，膜片化后的ADSCs使用更加方便。近年來，Lin等[8]將ADSCs制備成細胞膜片，嘗試用于創(chuàng)面修復。在創(chuàng)面愈合的早期，ADSCs膜片創(chuàng)面愈合速度，較直接使用ADSCs的對照組明顯加快。血管密度檢測發(fā)現(xiàn)，ADSCs膜片創(chuàng)面較對照組增加了15%以上。Cerqueira等[18]同樣使用ADSCs膜片來修復全層皮膚缺損創(chuàng)面。實驗發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面愈合速度較不使用膜片的對照組明顯增快。

2.3 缺氧微環(huán)境 脂肪組織處于末梢循環(huán)，往往處于氧飽和度相對較低的微環(huán)境，氧濃度只有約3%。低氧環(huán)境對ADSCs的增殖、分化、黏附、遷移、細胞反應、分泌都有影響[19]。Lee等[20]發(fā)現(xiàn)，低氧(2%)環(huán)境下獲得的ADSC-CM較正常濃度下的CM，更能增強皮膚成纖維細胞的遷移，加快膠原沉積。動物實驗中，mRNA和蛋白測量顯示，低氧上調(diào)了VEGF和bFGF表達，使用低氧環(huán)境下獲得的ADSC-CM能明顯地縮小創(chuàng)面面積。對照試驗中，研究者使用抗VEGF和bFGF抗體中和了VEGF和bFGF，這減弱了成纖維細胞的遷移和創(chuàng)面愈合能力?？梢?，VEGF和bFGF的分泌是影響創(chuàng)面愈合的重要原因之一。

2.4 低能激光 低能激光在臨床中應用廣泛，其不僅能止痛，而且能改善微循環(huán)。同時低能激光能促進細胞遷移、增殖，對間充質(zhì)干細胞還能增加生長因子分泌與分化。Kim等[21]將低能激光(1 J/cm2)結(jié)合ADSCs修復創(chuàng)面時發(fā)現(xiàn)，激光照射減少了細胞凋亡，從而增加了ADSCs在組織中的成活率，同時激光還增加了VEGF和bFGF的分泌。動物實驗表明，低能激光結(jié)合ADSCs修復創(chuàng)面，要優(yōu)于單純干細胞修復創(chuàng)面，創(chuàng)面的血管化水平和皮膚附件再生水平均得到了提高。

2.5 支架材料 支架材料為ADSCs提供合適的生存和分化微環(huán)境，合適的生物支架材料能提高創(chuàng)面修復的效果。Huang等[12]通過對比硅膠和脫細胞真皮作為支架并結(jié)合ADSCs用于修復創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)種植于脫細胞的支架，有更好的愈合效果。Shen等[11]將脂肪細胞種植在聚乙烯-殼聚糖支架中作為人工真皮用于糖尿病創(chuàng)面的修復，發(fā)現(xiàn)能有效加速創(chuàng)面愈合。楊超等[22]制作放射性復合損傷模型。在損傷創(chuàng)面上滴加ADSCs-HA復合物，結(jié)果顯示，在創(chuàng)面血管新生方面，ADSCs-HA復合物組新生微血管數(shù)量明顯提高。

隨著電紡絲納米纖維技術(shù)的發(fā)展，越來越多的材料通過電紡絲技術(shù)被用來制成新的細胞支架。Machula等[23]使用電紡絲彈性蛋白原作為支架，結(jié)合ADSCs用于大鼠全層真皮缺損創(chuàng)面的研究，發(fā)現(xiàn)電紡絲彈性蛋白原與ADSCs有著良好的生物相容性，通過與對照組的比較發(fā)現(xiàn)，明顯加快了創(chuàng)面愈合。Gu等[24]使用電紡絲聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物作為支架，結(jié)合ADSCs修復大鼠創(chuàng)面，加速了創(chuàng)面愈合速度。

3 ADSCs修復難愈性創(chuàng)面

慢性難愈性創(chuàng)面一直是困擾臨床醫(yī)師的難題。難愈性創(chuàng)面可見于創(chuàng)面的慢性感染、糖尿病所致的微循環(huán)障礙、放療等。ADSCs在慢性創(chuàng)面的動物實驗中，發(fā)現(xiàn)能促進傷口的愈合。

3.1 糖尿病慢性潰瘍 糖尿病患者皮膚易損傷，損傷后往往反復發(fā)作，遷延不愈，形成難愈性創(chuàng)面。ADSCs用于糖尿病創(chuàng)面的治療，為改善創(chuàng)面預后提供了新的思路。Zografou、Kim、Maharlooei等[10,25-26]將ADSCs注射于糖尿病老鼠創(chuàng)面邊緣，均發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面的愈合速度較對照組高，實驗組在上皮化、膠原沉積、血管生成等方面有較明顯改變。Nambu等[27]將分離出的初代ADSCs結(jié)合帶硅膠膜片的膠原蛋白支架，移植在糖尿病模型老鼠的全層缺損創(chuàng)面，創(chuàng)面愈合時間較對照組縮短，上皮化水平、毛細血管密度都有明顯提高。Nie等[28]將ADSCs結(jié)合脫細胞真皮支架用于糖尿病老鼠的創(chuàng)面，蛋白定量分析顯示，VEGF、HGF等血管生成相關(guān)的細胞因子表達大幅上調(diào)，這使得創(chuàng)面血管密度、上皮化水平、組織增生有明顯提高，這些促進了創(chuàng)面的愈合。

3.2 放射創(chuàng)面 放射損傷能造成細胞損壞并伴隨諸多的調(diào)控失調(diào)，從而延緩創(chuàng)面愈合。Haubner等[29]用2-12Gy輻射照射真皮血管內(nèi)皮細胞與ADSCs共培養(yǎng)的模型發(fā)現(xiàn)，ADSCs能降低內(nèi)皮細胞接受輻射后引起的多種細胞因子和黏附因子的表達水平，從而穩(wěn)定創(chuàng)面，加快愈合。Forcheron等[30]將ADSCs皮內(nèi)注射于受輻射的小型豬，80%的豬創(chuàng)面得以愈合，而對照組則全部發(fā)生壞死。免疫組化分析角蛋白表達顯示，創(chuàng)面完全上皮化。Huang等[31]用ADSCs治療接受輻射的老鼠，3周后創(chuàng)面較對照組有明顯縮小，組織檢查和免疫印跡顯示，創(chuàng)面邊緣再上皮化區(qū)域有血管長入；細胞追蹤實驗顯示，創(chuàng)面中的ADSCs表達血管內(nèi)皮標志物。

綜上所述，ADSCs對于創(chuàng)面的愈合改善有一定的作用，其機制和效率仍有待進一步研究。如何提高ADSCs修復創(chuàng)面的效率也是最近研究的熱點，對干細胞的基因改造、細胞微環(huán)境改善、細胞膜片技術(shù)，都在實驗室得到了一定肯定，但是在臨床應用中，其安全性仍有待考證。相信隨著今后對ADSCs更深入地研究，其在臨床中用于修復復雜性難愈性創(chuàng)面將可能實現(xiàn)。

[1] Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J]. Mol Biol Cell, 2002,13(12):4279-4295．

[2] Sch?ffler A, Büchler C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells-bisic and clinical implications for novel cell-based therapies[J]. Stem Cells, 2007,25(4);818-827.

[3] Liu X, Wang Z, Wang R, et al. Direct comparison of the potency of human mesenchymal stem cells derived from amnion tissue, bone marrow and adipose tissue at inducing dermal fibroblast responses to cutaneous wounds[J]. Int J Mol Med, 2013,31(2):407-415.

[4] Lee SH, Jin SY, Song JS, et al. Paracrine effects of adipose-derived stem cells on keratinocytes and dermal fibroblasts[J]. Ann Dermatol, 2012,24(2):136-143.

[5] Moon KM, Park YH, Lee JS, et al. The effect of secretory factors of adipose-derived stem cells on human keratinocytes[J]. Int J Mol Sci, 2012,13(1):1239-1357.

[6] Kim WS, Park BS, Sung JH, et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts[J]. J Dermatol Sci, 2007,48(1):15-24.

[7] Altman AM, Gupta V, Ríos CN, et al. Adhesion, migration and mechanics of human adipose-tissue-derived stem cells on silk fibroin-chitosan matrix[J]. Acta Biomater, 2010,6(4):1388-1397.

[8] Lin YC, Grahovac T, Oh SJ, et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model[J]. Acta Biomater, 2013,9(2):5243-5250.

[9] Zamora DO, Natesan S, Becerra S, et al. Enhanced wound vascularization using a dsASCs seeded FPEG scaffold[J]. Angiogenesis, 2013,16(4):745-757.

[10] Zografou A, Papadopoulos O, Tsigris C, et al. Autologous transplantation of adipose-derived stem cells enhances skin graft survival and wound healing in diabetic rats[J]. Ann Plast Surg, 2013,71(2):225-232.

[11] Shen T, Pan ZG, Zhou X, et al. Accelerated healing of diabetic wound using artificial dermis constructed with adipose stem cells and poly (L-glutamic acid)/chitosan scaffold[J]. Chin Med J (Engl), 2013,126(8):1498-503.

[12] Huang SP, Hsu CC, Chang SC, et al. Adipose-derived stem cells seeded on acellular dermal matrix grafts enhance wound healing in a murine model of a full-thickness defect[J]. Ann Plast Surg, 2012,69(6):656-662.

[13] Meruane MA, Rojas M, Marcelain K. The use of adipose tissue-derived stem cells within a dermal substitute improves skin regeneration by increasing neoangiogenesis and collagen synthesis[J]. Plast Reconstr Surg, 2012,130(1):53-63.

[14] Liu S, Zhang H, Zhang X, et al. Synergistic angiogenesis promoting effects of extracellular matrix scaffolds and adipose-derived stem cells during wound repair[J]. Tissue Eng Part A, 2011,17(5-6):725-739.

[15] Lim JS, Yoo G. Effects of adipose-derived stromal cells and of their extract on wound healing in a mouse model[J]. J Korean Med Sci, 2010,25(5):746-751.

[16] Nauta A, Seidel C, Deveza L, et al. Adipose-derived stromal cells overexpressing vascular endothelial growth factor accelerate mouse excisional wound healing[J]. Mol Ther, 2013,21(2):445-455.

[17] Song SH, Lee MO, Lee JS, et al. Genetic modification of human adipose-derived stem cells for promoting wound healing[J]. J Dermatol Sci, 2012,66(2):98-107.

[18] Cerqueira MT, Pirraco RP, Santos TC, et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds[J]. Biomacromolecules, 2013,14(11):3997-4008.

[19] Chung HM, Won CH, Sung JH. Responses of adipose-derived stem cells during hypoxia: enhanced skin-regenerative potential[J]. Expert Opin Biol Ther, 2009,9(12):1499-1508.

[20] Lee EY, Xia Y, Kim WS, et al. Hypoxia-enhanced wound-healing function of adipose-derived stem cells: increase in stem cell proliferation and up-regulation of VEGF and bFGF[J]. Wound Repair Regen, 2009,17(4):540-547.

[21] Kim H, Choi K, Kweon OK, et al. Enhanced wound healing effect of canine adipose-derived mesenchymal stem cells with low-level laser therapy in athymic mice[J]. J Dermatol Sci, 2012,68(3):149-156.

[22] 楊 超, 邢 新, 徐達圓， 等. 脂肪干細胞-透明質(zhì)酸復合物促進放射性創(chuàng)面愈合的初步研究[J]. 中國修復重建外科雜志, 2011,25(12):1499-1503.

[23] Machula H, Ensley B, Kellar R. Electrospun tropoelastin for delivery of therapeutic adipose-derived dtem cells to full-thickness dermal wounds[J]. Adv Wound Care (New Rochelle), 2014,3(5):367-375.

[24] Gu J, Liu N, Yang X, et al. Adiposed-derived stem cells seeded on PLCL/P123 eletrospun nanofibrous scaffold enhance wound healing[J]. Biomed Mater, 2014,9(3):035012.

[25] Kim EK, Li G, Lee TJ, et al. The effect of human adipose-derived stem cells on healing of ischemic wounds in a diabetic nude mouse model[J]. Plast Reconstr Surg, 2011,128(2):387-394.

[26] Maharlooei MK, Bagheri M, Solhjou Z, et al. Adipose tissue derived mesenchymal stem cell (AD-MSC) promotes skin wound healing in diabetic rats[J]. Diabetes Res Clin Pract, 2011,93(2):228-234.

[27] Nambu M, Kishimoto S, Nakamura S, et al. Accelerated wound healing in healing-impaired db/db mice by autologous adipose tissue-derived stromal cells combined with atelocollagen matrix[J]. Ann Plast Surg, 2009,62(3):317-321.

[28] Nie C, Zhang G, Yang D, et al. Targeted delivery of adipose-derived stem cells via acellular dermal matrix enhances wound repair in diabetic rats[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2012,5(3):12-19.

[29] Haubner F, Leyh M, Ohmann E, et al. Effects of external radiation in a co-culture model of endothelial cells and adipose-derived stem cells[J]. Radiat Oncol, 2013,8:66.

[30] Forcheron F, Agay D, Scherthan H, et al. Autologous adipocyte derived stem cells favour healing in a minipig model of cutaneous radiation syndrome[J]. PLoS One, 2012,7(2):e31694.

[31] Huang SP, Huang CH, Shyu JF, et al. Promotion of wound healing using adipose-derived stem cells in radiation ulcer of a rat model[J]. J Biomed Sci, 2013,20:51.

200433 上海，第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院 整形外科

張元政(1989-)，男，浙江人，住院醫(yī)師，碩士研究生.

楊 超，第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院 整形外科，電子信箱：13916086222@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.12.015

2014-10-12)