張艷麗，聶春明，周利偉，張 偉，張宇宏,*，楊曉紅*

（1.南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

牛凝乳酶原基因在食品級(jí)乳酸乳球菌中的重組表達(dá)

張艷麗1,2，聶春明2，周利偉2，張 偉2，張宇宏2,*，楊曉紅1,*

（1.南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

將牛凝乳酶原基因連接pNZ8149載體，并轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ3900，經(jīng)乳酸鏈球菌素Nisin誘導(dǎo)，測(cè)得重組菌株胞內(nèi)凝乳酶活力達(dá)到0.7 SU/mL，培養(yǎng)基中檢測(cè)不到凝乳酶活力，實(shí)現(xiàn)了牛凝乳酶原基因在乳酸鏈球菌Nisin誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)（nisin controlled gene expression system，NICE）中活性表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，將分泌信號(hào)肽SPusp45連接于pNZ8149，構(gòu)建了分泌型表達(dá)載體pNZ8149s，并實(shí)現(xiàn)牛凝乳酶原基因在NICE系統(tǒng)中分泌表達(dá)。當(dāng)使用1 ng/mL Nisin誘導(dǎo)5 h后，重組菌株胞內(nèi)檢測(cè)不到凝乳酶活力，培養(yǎng)基中凝乳酶活力為1.2 SU/mL，說(shuō)明pNZ8149s能夠促使凝乳酶原從乳酸乳球菌中分泌。該方法為重組牛凝乳酶在食品級(jí)菌株中重組表達(dá)提供了一種可行的方案。

凝乳酶；乳酸乳球菌；食品級(jí)；表達(dá)

牛凝乳酶（EC3.4.23.4，bovine prochymosin）是從未斷奶小牛皺胃中提取出的一種天冬氨酸蛋白酶，其在酸性條件下能夠自行剪切N端的42個(gè)氨基酸從而形成有活性的凝乳酶[1]。該酶可以專(zhuān)一性裂解κ-酪蛋白中的Phe105-Met106肽鍵，引起乳蛋白凝聚，在乳制品特別是干酪加工中具有重要作用，對(duì)干酪的品質(zhì)和特有風(fēng)味起著決定性的作用[2-4]。近年來(lái)，由于世界干酪產(chǎn)量劇增，小牛皺胃提取的凝乳酶無(wú)法滿足需求。國(guó)內(nèi)外凝乳酶的開(kāi)發(fā)主要集中在新型酶源的開(kāi)發(fā)和多種重組表達(dá)系統(tǒng)的利用兩個(gè)方面。新型的多種來(lái)源凝乳酶的開(kāi)發(fā)利用，例如植物源凝乳酶[5]和微生物源凝乳酶[6]已作為替代品應(yīng)用于干酪生產(chǎn)中，但存在著專(zhuān)一性不強(qiáng)、蛋白水解能力高、在乳中殘留量高等缺點(diǎn)，而且可導(dǎo)致加工的成熟干酪出現(xiàn)苦味或其他不良風(fēng)味[7-8]。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用重組DNA技術(shù)以微生物為宿主生產(chǎn)重組牛凝乳酶是解決需求增加和來(lái)源受限的有效途徑之一，已經(jīng)有牛凝乳酶基因在大腸桿菌、畢赤酵母等微生物中重組表達(dá)的報(bào)道。例如在1983年Beppu等[9]首次利用Escherichia coli生產(chǎn)凝乳酶，但是產(chǎn)物以包涵體的形式累積在胞內(nèi)。之后，馮鎮(zhèn)等[10]克隆了小牛凝乳酶基因并在乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）中進(jìn)行了分泌表達(dá)。也有研究者用畢赤酵母（Pichia pastoris）[11]或構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）[12]成功表達(dá)了有活性的牛凝乳酶。

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）早已被人類(lèi)用來(lái)生產(chǎn)泡菜、奶酪、醬油和酸奶，因而是公認(rèn)的食品級(jí)安全微生物（generally regarded as safe，GRAS），符合美國(guó)食品藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）要求而日益受到重視。雖然其基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控及蛋白質(zhì)分泌的機(jī)制還不是非常清晰，且該表達(dá)系統(tǒng)分子遺傳學(xué)研究晚于大腸桿菌、芽孢桿菌、酵母菌等表達(dá)系統(tǒng)。但是近些年，隨著乳酸菌各類(lèi)表達(dá)調(diào)控元件的分離和基因組的測(cè)序，以乳酸乳球菌作為異源蛋白的宿主菌株，逐漸成為食品工業(yè)、生物制藥和疫苗研究的熱點(diǎn)[13]。一些異源蛋白[14]、細(xì)胞因子[15]等在乳酸乳球菌中得以成功表達(dá)。其中的乳酸乳球菌Nisin誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)（nisin controlled gene expression system，NICE）因其誘導(dǎo)劑、篩選物和宿主菌株均為食品級(jí)，符合FDA安全標(biāo)準(zhǔn)，是乳酸乳球菌中應(yīng)用最廣的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)[16-17]。本實(shí)驗(yàn)將牛凝乳酶原基因在NICE系統(tǒng)中進(jìn)行胞內(nèi)重組表達(dá)，并構(gòu)建分泌型表達(dá)載體pNZ8149s，將牛凝乳酶原分泌至培養(yǎng)基中從而有利于后期純化，誘導(dǎo)酶液經(jīng)組氨酸標(biāo)簽鎳離子親和層析純化，并使用Western blotting鑒定目標(biāo)蛋白。研究結(jié)果為生產(chǎn)食品級(jí)重組牛凝乳酶提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ3900、pNZ8149載體 德國(guó)Mobitec公司；pEASY-T1 simple、大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

M17 broth、EM培養(yǎng)基、NZ3900感受態(tài)制備培養(yǎng)基和孵育液、蛋白胨、酵母膏 英國(guó)Oxoid公司；Taq DNA聚合酶、DNA純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒 天根生化技術(shù)（北京）有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶 加拿大Fermentas公司；基因和引物合成 北京奧科鼎盛生物科技有限公司；鼠抗His-Tag單克隆抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG抗體 康為世紀(jì)公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 牛凝乳酶原基因的克隆

根據(jù)G e n B a n k公布的牛凝乳酶原基因序列（Accession No. FJ768675.1），在其3’端添加組氨酸標(biāo)簽（His-Tag）序列，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成目的基因，命名為pcm，該基因連接于pGH載體得到重組質(zhì)粒PGH-pcm。以PGH-pcm質(zhì)粒為模板，8p-Nco-f（5’-CTGCCATGGGTGCTGAGATTACCAGAATCCCT CTG-3’，下劃線為Nco I 酶切位點(diǎn)）和8p-Sac-r（5’-CTT TGAGCTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGG-3’，下劃線為Sac I 酶切位點(diǎn)）為引物進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s、57 ℃退火40 s、72 ℃延伸60 s，30循環(huán)；72 ℃延伸10 min?；厥漳康钠尾⑦B接到pEASY-T1 simple載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒并測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pT-pcm。

1.3.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

pT-pcm質(zhì)粒及pNZ8149質(zhì)粒（圖1a）用Nco I和Sac I進(jìn)行雙酶切，回收目的片段后用T4 DNA連接酶連接（22 ℃連接3 h），乙醇沉淀濃縮后電擊轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌NZ3900，挑取陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)Nco I / Sac I雙酶切和測(cè)序鑒定，正確的重組載體命名為pNZ8149-pcm（圖1b）。

圖1 重組載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction of recombinant vectors

1.3.3 分泌型重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將合成的信號(hào)肽序列SPusp45（Accession No.M60178.1，北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成），連接于pGH載體得到pGH-SPusp45。按照1.3.2節(jié)所述方法將SPusp45連接到pNZ8149，并獲得正確的載體pNZ8149s（圖1b）。

利用 EcoR I和Not I將pcm基因從pGH-pcm酶切并連接到分泌性表達(dá)載體pNZ8149s，按照1.3.2節(jié)所述方法獲得正確重組載體pNZ8149s-pcm（圖1b）。

1.3.4 乳酸乳球菌感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化

按照Mobitec公司提供的NICE操作手冊(cè)制備L. lactis NZ3900電擊感受態(tài)細(xì)胞，分裝50 μL/支并貯存于－70 ℃冰箱。取5 μL乙醇沉淀并溶解的連接產(chǎn)物加入剛?cè)诨腘Z3900感受態(tài)細(xì)胞中并混勻，置于冰上5 min。Bio-Rad電擊儀轉(zhuǎn)化，電擊條件為2 kV、25 μF、200 Ω。電擊結(jié)束后迅速加入1 mL孵育液，冰浴5 min后30 ℃靜置培養(yǎng)1～1.5 h。取適量菌液涂布于EM平板，30 ℃培養(yǎng)1～2 d直至黃色菌落長(zhǎng)出。含有pNZ8149-pcm質(zhì)粒的重組菌株命名為L(zhǎng)9P，含有pNZ8149s-pcm質(zhì)粒的重組菌株命名為L(zhǎng)9sP。使用同樣條件轉(zhuǎn)化空載體pNZ8149及pNZ8149s質(zhì)粒并于EM平板上進(jìn)行培養(yǎng)，菌株分別命名為L(zhǎng)9、L9s，作為空載體陰性對(duì)照。

1.3.5 重組牛凝乳酶原的誘導(dǎo)表達(dá)

分別將L9、L9s、L9P和L9sP這4種菌株在LM17液體培養(yǎng)基中30 ℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜，然后按2%接種量轉(zhuǎn)入新鮮LM17培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600nm為0.4時(shí)分別加入終質(zhì)量濃度為1 ng/mL的乳鏈菌素Nisin，繼續(xù)在30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h。以不添加Nisin的菌液作為未誘導(dǎo)的陰性對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后10 000 r/min室溫離心5 min，分別收集培養(yǎng)基上清和菌體。培養(yǎng)基上清直接用于測(cè)定胞外凝乳酶活力；菌體細(xì)胞采用液氮研磨法破碎，再用pH 5.5的0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液重懸，用于測(cè)定胞內(nèi)凝乳酶活力。

1.3.6 凝乳酶酶活力的測(cè)定

酶原激活：收集的酶液用1 mol/L HCl調(diào)整至pH 2.0，室溫下（25 ℃）放置2 h，然后用2 mol/L NaOH將其pH值調(diào)至pH5.5。

依據(jù)改進(jìn)的Arima等[18]的方法進(jìn)行凝乳酶活力的測(cè)定。用0.01 mol/L CaCl2溶液配制10 g/100 mL脫脂乳，此溶液配制后在室溫下放置40 min后使用。取1 mL 10 g/100 mL脫脂乳于32 ℃保溫10 min，加入適量稀釋的酶液（未激活的酶液作為對(duì)照），振蕩均勻并開(kāi)始計(jì)時(shí)，觀察管壁上開(kāi)始出現(xiàn)凝乳顆粒為終點(diǎn)，記錄凝乳時(shí)間t/s。在上述條件下，40 min凝結(jié)1 mL 10 g/100 mL脫脂乳所需的酶量定義為一個(gè)Soxhlet單位（SU）。

式中：d為酶液稀釋的倍數(shù)。

同樣條件下，在離心管中進(jìn)行上述凝乳反應(yīng)。反應(yīng)5 h后，倒置離心管，觀察脫脂乳的凝結(jié)情況。

1.3.7 重組菌株L9sP誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

按照1.3.5節(jié)方法對(duì)L9sP進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將Nisin終質(zhì)量濃度分別設(shè)定為0.1、1、5、10、100、1000、10000 ng/mL，分別在誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為1、3、5、9 、20 h（將加入Nisin的時(shí)刻記為0 h），取樣測(cè)定菌體生長(zhǎng)情況和培養(yǎng)基中的凝乳酶活力。

1.3.8 重組牛凝乳酶的純化與鑒定

在最佳誘導(dǎo)條件下，對(duì)4種菌株L9、L9s、L9P和L9sP進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集胞內(nèi)和胞外酶液。并且L9sP的胞外誘導(dǎo)酶液酸化激活后，利用組氨酸標(biāo)簽（His-Tag）鎳離子親和層析進(jìn)行純化，通過(guò)Western blotting鑒定4種菌株中重組牛凝乳酶原的表達(dá)和純化情況。一抗為鼠抗His-Tag單克隆抗體，二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG抗體。

2 結(jié)果與分析

2.1 分泌型載體及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定Fig.2 Construction and identification of recombinant vectors

質(zhì)粒pT-pcm和pGH-SPusp45經(jīng)過(guò)雙酶切后，分別回收1.1 kb 和150 bp的目的片段，連接pNZ8149并電擊轉(zhuǎn)化NZ3900感受態(tài)細(xì)胞。質(zhì)粒pGH-pcm經(jīng)雙酶切后回收1.1 kb的目的片段，連接pNZ8149s并電擊轉(zhuǎn)化NZ3900感受態(tài)細(xì)胞。含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌落在EM平板上呈黃色（圖2a）。提取重組質(zhì)粒并通過(guò)雙酶切（圖2b）和測(cè)序鑒定表明，分泌性載體pNZ8149s、重組載體pNZ8149-pcm和pNZ8149s-pcm均構(gòu)建成功。

2.2 重組牛凝乳酶的凝乳活力

分別對(duì)L9、L9P、L9s和L9sP菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并得到胞內(nèi)和胞外誘導(dǎo)酶液，然后分別測(cè)定各個(gè)樣品的凝乳酶活力。如圖3所示，含空載體的菌株L9和L9s其胞內(nèi)和胞外產(chǎn)物均無(wú)凝乳活力。重組菌株L9P的凝乳活力集中于胞內(nèi)，而含有pNZ8149s-pcm的重組菌株L9sP其凝乳活力集中于胞外產(chǎn)物。說(shuō)明牛凝乳酶原基因pcm連接pNZ81 49載體后可在乳酸乳球菌中成功表達(dá)，但并未分泌至培養(yǎng)基中。而分泌型pNZ8149s載體，能夠?qū)崿F(xiàn)牛凝乳酶原基因pcm在乳酸乳球菌中的分泌表達(dá)。

圖3 重組牛凝乳酶活性檢測(cè)Fig.3 Determination of recombinant chymosin activity

2.3 L9sP中重組凝乳酶原誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

圖4 Nisin質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和重組牛凝乳酶活力的影響Fig.4 Effect of nisin concentration on strain growth and recombinant chymosin activity

在食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)NICE中， Nisin可誘導(dǎo)重組蛋白的產(chǎn)生，但是高質(zhì)量濃度的Nisin對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定的抑制作用[19]。如圖4a所示，當(dāng)培養(yǎng)基中Nisin終質(zhì)量濃度低于10 ng/mL時(shí)，對(duì)菌體生長(zhǎng)無(wú)顯著影響；Nisin終質(zhì)量濃度達(dá)到100 ng/mL時(shí)，菌體生長(zhǎng)速度減慢；當(dāng)高于1 000 ng/mL時(shí)，菌體生長(zhǎng)幾乎完全受到抑制。同樣，誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目標(biāo)蛋白的表達(dá)影響也比較顯著。如圖4b所示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，凝乳酶活力隨之增加，5 h時(shí)達(dá)到最高，隨后緩慢下降。但當(dāng)Nisin高于100 ng/mL時(shí)，凝乳酶活力較低，且并未隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加?？赡苁怯捎诟哔|(zhì)量濃度的Nisin抑制了菌株的生長(zhǎng)和代謝所致。當(dāng)Nisin終質(zhì)量濃度為1 ng/mL時(shí)，凝乳酶活力最高，誘導(dǎo)5 h后凝乳酶活力達(dá)1.2 SU/mL。由此確認(rèn)最佳誘導(dǎo)條件為終質(zhì)量濃度1 ng/mL的Nisin，誘導(dǎo)時(shí)間5 h。

2.4 重組牛凝乳酶的鑒定

由圖5Western blotting結(jié)果可知，與L9、L9s及未經(jīng)Nisin誘導(dǎo)的L9P和L9sP相比，只有重組菌株L9P胞內(nèi)產(chǎn)物和L9sP胞外產(chǎn)物能夠觀察到特異性條帶，分子質(zhì)量約為37 kD和43 kD，分別與牛凝乳酶和牛凝乳酶原蛋白理論分子質(zhì)量相符。同時(shí)出現(xiàn)兩種蛋白條帶的原因可能是在誘導(dǎo)過(guò)程中，重組菌株產(chǎn)酸會(huì)導(dǎo)致一部分重組牛凝乳酶原（43 kD，泳道P上方箭頭所示）自我剪切形成重組牛凝乳酶（37 kD，泳道P下方箭頭所示）。L9sP菌株培養(yǎng)基中的蛋白經(jīng)酸化后進(jìn)行親和層析純化，純化產(chǎn)物在Western blotti ng圖中顯示單一條帶（泳道P下方箭頭所示），且其分子質(zhì)量大小與L9sP粗酶液中的重組牛凝乳酶（37 kD）相符（圖5）。以上結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明重組菌株L9P和L9sP經(jīng)Nisin誘導(dǎo)后，能夠表達(dá)重組牛凝乳酶原，并且L9sP中牛凝乳酶原可分泌至胞外，這表明本研究構(gòu)建的pNZ8149s可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的分泌。

圖5 菌株中重組牛凝乳酶的Western blotting分析Fig.5 Western blotting analysis of the recombinant chymosin in different strains

3 討論與結(jié)論

由于凝乳酶的特殊用途，選用安全型、食品級(jí)的重組表達(dá)系統(tǒng)顯得尤為重要。所以用于生產(chǎn)重組凝乳酶的表達(dá)體系包括載體、宿主菌、選擇標(biāo)記以及誘導(dǎo)物都必須是食品安全級(jí)別的[20]。而乳酸乳球菌的NICE表達(dá)系統(tǒng)是一種典型的食品級(jí)可控表達(dá)系統(tǒng)，其誘導(dǎo)劑、篩選物和宿主均符合食用安全的要求。此外此系統(tǒng)還具有安全性、無(wú)內(nèi)毒素、表達(dá)調(diào)控嚴(yán)謹(jǐn)和高效性等優(yōu)點(diǎn)，是理想的異源蛋白表達(dá)體系[21]。本研究構(gòu)建的生產(chǎn)重組牛凝乳酶原的乳酸乳球菌，為干酪工業(yè)提供了新型及優(yōu)良的凝乳酶來(lái)源。

孫大慶等[22]利用乳酸乳球菌L. lactis NZ9000和表達(dá)載體pNZ8148成功表達(dá)了牛凝乳酶原，重組牛凝乳酶在重組菌株胞內(nèi)表達(dá)。受此啟發(fā)，本研究成功構(gòu)建了牛凝乳酶原乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8149-pcm，在菌體胞內(nèi)表達(dá)出有活性的重組牛凝乳酶，但重組蛋白難以分泌至胞外，易被當(dāng)做外源入侵物而被細(xì)胞內(nèi)水解酶系統(tǒng)水解[23]，同時(shí)，也不利于后期目標(biāo)蛋白的純化。有文獻(xiàn)表明利用乳酸菌usp45基因的分泌信號(hào)序列SPusp45，在乳酸乳球菌中可幫助外源α-淀粉酶成功分泌至胞外[24]。本研究將信號(hào)肽SPusp45融合到pNZ8149載體的PnisA啟動(dòng)子下游，構(gòu)建了分泌型表達(dá)載體pNZ8149s，并進(jìn)一步構(gòu)建了牛凝乳酶原乳酸乳球菌分泌表達(dá)載體pNZ8149s-pcm，并在培養(yǎng)基上清中成功檢測(cè)到了凝乳活性，說(shuō)明本研究構(gòu)建的pNZ8149s可以作為分泌型表達(dá)載體，且實(shí)現(xiàn)了牛凝乳酶原的分泌型表達(dá)。

孫大慶等[22]提出將產(chǎn)凝乳酶的乳球菌直接用于奶酪的加工，使乳酸乳球菌既發(fā)揮原有的發(fā)酵作用又可以在奶酪加工的凝乳階段產(chǎn)生適量的凝乳酶，即發(fā)酵和凝乳角色合二為一，那么將對(duì)奶酪生產(chǎn)更加具有意義。本研究構(gòu)建的食品級(jí)分泌型重組菌株符合發(fā)酵和凝乳功能融合的要求，但是達(dá)不到奶酪工業(yè)生產(chǎn)中凝乳酶量的要求（0.2 mg凝乳酶/L原料乳）。雖然本研究對(duì)搖瓶的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化，但凝乳酶原的表達(dá)量仍然很低，主要原因可能是本研究使用的牛凝乳酶原基因序列為小牛來(lái)源的原始序列，不適應(yīng)乳酸乳球菌中的密碼子偏好性，因此導(dǎo)致牛凝乳酶原表達(dá)量偏低。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，?im?ek等[25-26]通過(guò)提高培養(yǎng)基中的氮源、碳源含量和改善培養(yǎng)條件，提高了Nisin蛋白的表達(dá)量。Kong等[27]通過(guò)密碼子優(yōu)化II型豬圓環(huán)病毒的衣殼蛋白基因，也提高了基因在乳酸乳球菌中的表達(dá)水平。Ng等[28]通過(guò)改變信號(hào)肽SPusp45的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和突變了其中一些氨基酸，使得目標(biāo)蛋白的分泌量都有所增加。因此，提高外源蛋白在乳酸乳球菌中表達(dá)量可通過(guò)改善發(fā)酵條件、目的蛋白密碼子優(yōu)化及信號(hào)肽改造等途徑。目前，我們正在通過(guò)多種策略來(lái)提高牛凝乳酶原的表達(dá)量，使乳酸菌發(fā)酵和凝乳雙重功能合二為一成為可能。本研究為食品級(jí)發(fā)酵生產(chǎn)重組牛凝乳酶提供了新思路和新方法。同時(shí)，也為乳酸菌分泌表達(dá)外源蛋白提供了可行性方案。

重組表達(dá)凝乳酶是彌補(bǔ)奶酪行業(yè)所缺凝乳酶的重要途徑之一。本實(shí)驗(yàn)利用食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)NICE成功表達(dá)了牛凝乳酶原基因，進(jìn)一步通過(guò)經(jīng)改造的分泌型表達(dá)載體pNZ8149s實(shí)現(xiàn)了牛凝乳酶原的分泌表達(dá)，培養(yǎng)基中凝乳酶活力可達(dá)1.2 SU/mL。

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Recombinant Expression of the Bovine Prochymosin Gene in Food-Grade Lactococcus lactis

ZHANG Yan-li1,2, NIE Chun-ming2, ZHOU Li-wei2, ZHANG Wei2, ZHANG Yu-hong2,*, YANG Xiao-hong1,*
(1. Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education, College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

In this study, we cloned the bovine prochymosin gene pcm into the expression vector pNZ8149 and transformed into Lactococcus lactis NZ3900. The intracellular chymosin activity attained 0.7 SU/mL in the presence of nisin induction, suggesting that the bovine chymosin gene was successfully expressed in the food-grade nisin controlled gene expression system (NICE). Furthermore, the secretion signal SPusp45 was ligated into pNZ8149 to generate pNZ8149s. Recombinant L. lactis containing pNZ8149s-pcm showed a chymosin activity of 1.2 SU/mL in culture supernatant after induction by 1 ng/mL nisin for 5 h. This result demonstrated that bovine chymosin could be secreted by the expression vector pNZ8149s. This study provides a feasible method for producing recombinant bovine chymosin in food-grade strains.

chymosin; Lactococcus lactis; food-grade strain; expression

Q812

A

1002-6630（2014）07-0123-05

10.7506/spkx1002-6630-201407025

2013-04-11

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（2013-05）

張艷麗（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物。E-mail：zyl_18651@126.com

*通信作者：張宇宏（1980—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槲⑸锘蚬こ?。E-mail：zhangyuhong@caas.cn

楊曉紅（1963—），女，教授，博士，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物。E-mail：yangxh2@swu.edu.cn