陳 偉，楊英士，楊海燕*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

昆侖雪菊結(jié)合型黃酮類化合物的分離與鑒定

陳 偉，楊英士，楊海燕*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

昆侖雪菊結(jié)合型黃酮類化合物因與細胞壁以共價鍵結(jié)合，難以直接用溶劑萃取出來。本研究采用堿降解法使結(jié)合型化合物釋放出來并優(yōu)化降解條件，在此基礎上，利用不同溶劑對降解產(chǎn)物進行提取篩選出最佳的溶劑得到粗提物，利用常壓硅膠柱層析和SepdexLH-20凝膠柱層析對粗提物中的黃酮類化合物進行分離純化得到單體化合物，采用Fe3+還原/抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）法及2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）法對單體化合物進行抗氧化活性評價。結(jié)果表明：最佳的堿降解時間2h、溫度5 0℃、NaOH濃度2mol/L，最佳提取溶劑為正丁醇；從粗提物中分離得到2個單體化合物，采用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和電噴霧質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectra，ESIMS）鑒定其化學結(jié)構分別為金雞菊查爾酮-4’-O-β-D- 吡喃葡萄糖（化合物1）、3’,4’,7,8-四羥基二氫黃酮（化合物2）；活性測定結(jié)果表明兩個化合物的總抗氧化能力均強于陽性對照VE，化合物1與化合物2對DPPH自由基的半數(shù)抑制率IC50分別為（17.29±0.17）μmol/L和（70.09±0.09）μmol/L、對ABTS＋·半數(shù)抑制率IC50分別為（ 22.86±0.21）μmol/L和（33.4±0.18）μmol/L，遠低于陽性對照VE的IC50值（分別為（78.08±1.63）μmol/L和（38.54±0.42）μmol/L），說明兩個化合物均有很強的抗氧化活性。

昆侖雪菊；結(jié)合型黃酮類化合物；分離鑒定；抗氧化活性

昆侖雪菊是目前新疆惟一與雪蓮齊名，具有獨特功效的稀有高寒植物，主要分布在昆侖山脈北麓海拔3 000 m雪線以上的部分地區(qū)，僅在每年八月綻放一次，花期短暫，且生長面積小，產(chǎn)量極低，因而彌足珍貴[1-3]。

目前對昆侖雪菊的研究大都集中在對其粗提物活性的研究方面，如降血壓、降血脂、降血糖等[4]。梁淑紅[5]、徐磊[6]等發(fā)現(xiàn)雪菊的乙酸乙酯、乙醇、正丁醇提取物對氯化鉀預收縮血管有不同程度的舒張作用，且各極性部位均表現(xiàn)出顯著的降膽固醇作用[7]，毛新民等[8]發(fā)現(xiàn)雪菊的乙醇、氯仿、正丁醇提取物對α-葡萄糖苷酶有較強的抑制作用。對雪菊的化學成分研究國內(nèi)外鮮有報道，現(xiàn)有的報道大多僅限于對游離黃酮的研究，而忽略了結(jié)合型黃酮。研究表明[10-11]，結(jié)合型黃酮主要通過酯鍵、醚鍵、縮醛鍵與細胞壁構成材料——膳食纖維結(jié)合、能耐受腸道消化酶不被降解并最終穿過胃腸道到達結(jié)腸，結(jié)腸含有的大量細菌菌群可以發(fā)酵降解這些物質(zhì)，降解產(chǎn)物能夠中和氧化劑、維持腸道菌落的生長，從而為維持腸胃健康起到重要作用。因此由于沒有考慮到結(jié)合型黃酮而低估了總黃酮的含量[9]。因此，結(jié)合型黃酮的研究對全面解釋昆侖雪菊的功效具有重要意義。

本實驗采用堿降解法使雪菊中的結(jié)合型黃酮類化合物釋放出來，篩選最佳提取溶劑得到粗提物，利用硅膠柱層析和sephedex LH-20分離純化降解產(chǎn)物中的黃酮類化合物，通過電噴霧質(zhì)譜（electrospray ionization-mass spectrometry，ESI-MS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術鑒定結(jié)合型黃酮類化合物的結(jié)構，采用FRAP、DPPH、ABTS法對單體化合物的抗氧化活性進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆侖雪菊購于烏魯木齊北園春農(nóng)貿(mào)市場。

Sephadex LH-20 瑞典Pharmacia公司；硅膠H（200～400目） 青島海洋化工廠；槲皮素、VE、DPPH、ABTS 美國Sigma公司；環(huán)己烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、正丁醇重蒸后使用，均為工業(yè)用化學純產(chǎn)品；氯化鋁、乙酸鉀、過硫酸鉀、醋酸鈉、冰醋酸、氯化高鐵、2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、無水乙醇等均為工業(yè)用化學純產(chǎn)品。

1.2 儀器與設備

FW200高速萬能粉碎機 天津市華鑫儀器廠；722s型分光光度計、酸度計 上海精密科學儀器有限公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；Allegra64R臺式冷凍離心機、CJJ78-1型磁力加熱攪拌器 金壇市大地自動化儀器廠；N-1100V-WD立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化有限公司；AVA NCE3型（400MHz）核磁共振儀 德國Bruker公司；Mariner API-TOF 型質(zhì)譜儀 美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.3 總黃酮含量測定

采用AlCl3比色法測定總黃酮含量[12]。槲皮素標準曲線的制作：精確稱取0.5 g槲皮素溶于25 mL 80%的乙醇中，得到質(zhì)量濃度為200 μg/mL的貯備溶液，取貯備溶液依次稀釋成20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0、140.0、160.0 μg/mL的標準溶液。吸取0.5 mL標準或樣品溶液，依次加入1.5 mL 95%的乙醇溶液、0.1 mL 10%的AlCl3溶液、0.1 mL 1 mol/L的乙酸鉀溶液以及2.8 mL去離子水，混合均勻，于室溫下靜置30 min后，在415 nm波長下測定吸光度，每個樣品平行測定3 次?？瞻滓哉麴s水代替槲皮素溶液。得到槲皮素的標準曲線方程y=0.0037x－0.007 5（R2=0.994 6），式中：x為槲皮素溶液質(zhì)量濃度/（μg/mL），y為樣品的吸光度。

1.4 游離型黃酮類化合物提取溶劑的選擇

將昆侖雪菊于粉碎機中粉碎后，分別稱取0.5 g的樣品7 份，各加入50 mL環(huán)己烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、去離子水及正丁醇，于磁力攪拌器上攪拌30 min，用布氏漏斗抽濾，取上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器45 ℃真空濃縮至干，加入20 mL 80%乙醇溶液溶解，測定黃酮含量。其中黃酮含量最高組的溶劑作為提取游離黃酮的最佳溶劑。

1.5 結(jié)合型黃酮類化合物提取條件優(yōu)化

結(jié)合黃酮的提取采用堿降解法。結(jié)合型黃酮類化合物的提取主要取決于如何最大限度地將結(jié)合在細胞壁上的化合物釋放出來，可通過優(yōu)化堿降解溫度、時間、堿液濃度、以及溶劑的選擇來確定最佳的提取條件。

1.5.1 提取溶劑的選擇

取0.5 g樣品7 份，用1.3節(jié)所確定最佳溶劑去除游離黃酮后保留濾渣，加入2 mol/L的NaOH溶液20 mL，室溫下堿降解1 h。加入濃鹽酸調(diào)溶液pH值至中性，分別加入環(huán)己烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、水、正丁醇50 mL，磁力攪拌30 min，布氏漏斗抽離，棄去殘渣，上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器45 ℃真空濃縮至干，加入40 mL 80%乙醇溶解，測定黃酮含量。

1.5.2 堿降解溫度的選擇

以1.5.1節(jié)所篩選的溶劑為提取溶劑，去除樣品中的游離黃酮后，加入2 mol/L 的NaOH溶液20 mL，分別在30、40、50、60、70、80 ℃水浴降解1 h，中和后提取、濃縮至干，測定黃酮含量。

1.5.3 堿降解濃度的選擇

采用1.5.1節(jié)和1.5.2節(jié)所篩選的提取溶劑和溫度參數(shù)，去除樣品中的游離黃酮后，分別加入濃度為1、2、3、4、5、6 mol/L的NaOH溶液20 mL降解1 h，中和后提取、濃縮至干，測定黃酮含量。

1.5.4 堿降解時間的選擇

采用1.5.1、1.5.2和1.5.3節(jié)所篩選的提取溶劑、溫度和堿液濃度參數(shù)，去除樣品中的游離黃酮后，分別降解1、2、3、4、5、6h，中和后提取、濃縮至干，測定黃酮含量。

1.6 結(jié)合型黃酮類化合物的提取純化

稱取100 g粉碎的雪菊，采用優(yōu)化條件進行堿降解，并提取結(jié)合黃酮，減壓真空濃縮至干后得1.8 g粗提物。粗提物干法拌樣后上裝有50 g硅膠（300 目）的常壓柱，用石油醚-丙酮-甲醇梯度洗脫分離，洗脫的組分減壓濃縮經(jīng)TLC檢測合并后得到2 個組分（Fraction，簡寫Fr）：Fr.1、Fr.2。經(jīng)測定，僅有Fr.1組分含有黃酮類化合物，用于進一步的純化。組分Fr.1（350 mg）進一步上常壓硅膠柱，氯仿-甲醇（200∶1，V/V）洗脫，得亞組分Fr.2-1（210 mg）和Fr.2.2，F(xiàn)r.2.2（90 mg）含有黃酮類化合物，繼續(xù)分離，組分Fr.2.2進一步上常壓硅膠柱，氯仿-甲醇（100∶1，V/V）洗脫，得化合物1（20 mg）和另一亞組分Fr.2.2.1（15 mg）；組分Fr.2.2.1上Sephadex LH-20純化，氯仿-甲醇（1∶1，V/V）洗脫得到化合物2（11 mg）；分離過程中其余未檢測到黃酮類的組分，不做進一步分離。

1.7 單體化合物的活性測定

采用FRAP、DPPH、ABTS 3種方法對純品單體化合物進行活性評價。

1.7.1 FRAP法[13]。

FRAP工作液制備：取5.1 g醋酸鈉，加入20 mL乙酸并用去離子水定容到250 mL，得到300 mmol/L的醋酸鈉緩沖溶液備用；取0.270 5 g FeCl3·6H2O，用去離子水定容到50 mL，得到20 mmol/L氯化鐵溶液備用；稱取0.031 2 g TPTZ用10 mL 40 mmol/L的鹽酸溶液溶解備用（40 mmol/L的鹽酸溶液：0.1 mL濃鹽酸用30 mL去離子水溶解）。將上述3 種溶液以體積比10∶1∶1混合均勻得到FRAP工作液。

抗氧化活性測定：取0.2 mL無水乙醇配制的樣品，分別加入6 mL FRAP工作液0.6 mL去離子水，搖勻后于37 ℃水浴20 min，在593 nm波長處測吸光度，每個樣品平行3 次?？瞻讟佑?.2 mL無水乙醇代替，VE溶液（100～500 μmol/L）做陽性對照。

無水乙醇配制FeSO4溶液（200～1 000 μmol/L），上述方法測吸光度，得到標準曲線方程y= 0.000 6x+0.070 5，R2= 0.994 6。式中：x為FeSO4溶液濃度/（μmol/L），y為樣品的吸光度。FRAP值的計算：以待測樣品吸光度換算成FeSO4溶液濃度，1 000 μmol/L FeSO4溶液為一個FRAP值。

1.7.2 DPPH法[14-15]

DPPH溶液的配制：準確稱取0.019 7 g DPPH，無水乙醇定容到250 mL，得到濃度為2×10-4mol/L的DPPH溶液。

測定方法：2 mL樣品加2 mL DPPH溶液，搖勻后避光靜置30 min，于517 nm條件下測得吸光度AI，空白用2 mL無水乙醇代替；2 mL樣品加2 mL無水乙醇，搖勻后避光靜置30 min，于517 nm條件下測得吸光度AJ；2 mL無水乙醇加2 mL DPPH溶液，搖勻后避光靜置30 min，于517 nm條件下測得吸光度AC；VE溶液（20～100 μmol/L）做陽性對照，每個樣品平行3 次，清除率按照式（1）計算。

1.7.3 ABTS法[16]。

ABTS工作液的配制：稱取0.191 8 g ABTS，去離子水定容到50 mL容量瓶；取0.066 2 g過硫酸鉀，去離子水定容到100 mL容量瓶；取少量將上述兩種溶液按體積比1∶1混合后避光放置12～16 h；取混合液，加一定量的無水乙醇在734 nm處測量吸光度，用無水乙醇調(diào)吸光度至0.70±0.02即可使用（混合液現(xiàn)配現(xiàn)用）。

測定方法：取0.2 mL無水乙醇配制的樣品加入0.6 mL ABTS工作液，室溫靜置5 min后，于734 nm測量吸光度，空白用無水乙醇代替。VE溶液（20～100 μmol/L）做陽性對照，每個樣品平行3次。清除率按照式（2）計算。清除率/%=（1－AI/A0）×100 （2）式中：A0為空白樣的吸光度；AI各濃度下樣品的吸光度。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2007和SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離型黃酮類化合物的提取溶劑的選擇結(jié)果

圖1 不同提取溶劑對游離型黃酮提取效果的影響Fig.1 Effect of different solvents on the extraction efficiency free flavonoids

由圖1可知，甲醇提取所得游離黃酮含量遠遠高于其他溶劑，丙酮、正丁醇次之，因此采用甲醇作為游離黃酮的提取溶劑。

2.2 結(jié)合型黃酮類化合物的提取條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 提取溶劑的選擇結(jié)果

圖2 不同提取溶劑對結(jié)合型黃酮提取效果的影響Fig.2 Effect of different solvents on the extraction efficiency of bound flavonoids

由圖2可知，不同提取溶劑提取結(jié)合型黃酮類化合物的量差別較大，其中，正丁醇提取的黃酮量要高于其他溶劑的提取量。因此，最佳的溶劑為正丁醇。

2.2.2 堿降解溫度的選擇結(jié)果

圖3 不同堿降解溫度對結(jié)合型黃酮提取效果的影響Fig.3 Effect of degradation temperature on the extraction efficiency of bound flavonoids

由圖3可知，30～50 ℃，結(jié)合型黃酮類化合物提取量隨溫度上升也呈上升趨勢；超過50 ℃后，隨著溫度的升高，黃酮類化合物的含量反而會降低，可能是因為溫度過高導致部分黃酮分解。因此，最佳的堿降解溫度為50 ℃。

2.2.3 堿降解濃度的選擇結(jié)果

圖4 不同堿降解濃度對結(jié)合型黃酮提取效果的影響Fig.4 Effect of alkaline concentration on the extraction efficiency of bound flavonoids

由圖4可知，2 mol/L時降解效果最好，繼續(xù)升高堿液濃度反而會降低黃酮類化合物的含量，這可能是因為堿濃度過高會使部分黃酮降解。

2.2.4 堿降解時間的選擇結(jié)果

圖5 不同堿降解時間對結(jié)合型黃酮提取效果的影響Fig.5 Effect of degradation time on the extraction efficiency of bound flavonoids

由圖5可知，最佳的堿降解時間為2h，長時間的堿降解可能會導致部分黃酮分解。

2.3 化合物的結(jié)構解析

圖6 化合物1的結(jié)構及關鍵的1HH--1H COSY 、HMBCC耦合Fig.6 Chemical structure and selected1H-1H COSY and HMBC correlations for compound 1

化合物1：橘黃色無定型粉末，ESIMS在451.1和449.0處分別給出準分子離子峰[M+H]+和[M-H]－，結(jié)合1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)分析確定其分子式為C21H22O11。1H NMR在δ 3.15～4.90處的一組質(zhì)子以及13C NMR在δ 60.7～101.0處的6個碳原子提示分子中存在一個糖單元；進一步分析1H NMR顯示分子中存在一個AB自旋系統(tǒng)：δ 6.76（d，J = 9.2 Hz，1H，H-5’）和δ 7.73（d，J = 9.2 Hz，1H，H-6’）；一個ABX自旋系統(tǒng)：δ 7.26（d，J = 2.05 Hz，1H，H-2）、δ 6.80（d，J = 8.15 Hz，1H，H-5）和δ 7.20（dd，J = 2. 05 Hz，8.25 Hz，1H，H-6），提示該化合物中含有兩個苯環(huán)；1H NMR在δ 13.12（s，1H，2’-OH）處出現(xiàn)一個典型的寬單峰提示為黃酮2’位羥基質(zhì)子；13C NMR在低場區(qū)δ 192.6的碳信號，提示分子中存在一個酮基，推測分子中含有一個金雞菊查爾酮糖配基。1H-1H COSY 譜確定了糖單元的C的連接順序C1”-C2”- C3＂- C4”- C5”- C6”；HMBC顯示葡萄糖端基質(zhì)子δ 4.89（d，J = 7.30 Hz，1H，H-1”）與C-4’（δ C 150.4）出現(xiàn)關鍵的耦合信號，提示吡喃葡萄糖通過糖苷鍵連接在金雞菊查爾酮的C-4’位上，而且端基質(zhì)子耦合常數(shù)J=7.30，提示糖單元是一個β型吡喃葡萄糖?；衔?的關鍵1H-1H COSY、HMBC耦合見圖6；化合物1的1H NMR和13C NMR譜數(shù)據(jù)歸納見表1；以上數(shù)據(jù)與金雞菊查爾酮-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖一致[17]，因此經(jīng)鑒定化合物1為金雞菊查爾酮-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖。

表1 化合物11H NNMMRR和1133C NMRR譜數(shù)據(jù)Tabbllee111H NMR a nd1133C NMR data of compound 1

化合物2：淡黃色無定型粉末，ESIMS-給出準分子離子峰[M-H]－：287.1，結(jié)合1H NMR（DMSO）和13C NMR數(shù)據(jù)分析確定其分子式為C15H12O6。分析該化合物氫譜與碳譜，發(fā)現(xiàn)該化合物與化合物1非常相似，差別在于缺少一個糖單元，提示該化合物為一個黃酮化合物。1H NMR提示分子中存在一個AB自旋系統(tǒng)：δ 6.61（d，J = 8.7Hz，1H，H-5）和δ 7.30（d，J = 8.7 Hz，1H，H-6），結(jié)合13C NMR數(shù)據(jù)提示分子中存在一個苯環(huán)的1、2取代結(jié)構；進一步分析1H NMR提示分子中存在一個ABX自旋系統(tǒng)：δ 7.06（d，J = 1.8 Hz，1H，H-2’）、6.88（d，J = 8.3 Hz，1H，H-5’）和 6.91（dd，J = 1.8 Hz，8.3 Hz，1H，H-6’），結(jié)合13C NMR數(shù)據(jù)提示分子中還存在一個苯環(huán)的1、3、4取代結(jié)構，13C NMR在低場區(qū)δ 192.6出現(xiàn)一個典型的酮基碳信號，提示該化合物為4取代的黃酮類化合物；具體13C NMR數(shù)據(jù)分析如下：δ 131.1 （C-1’）、114.0 （C-2’）、145.0 （C-3’）、145.3（C-4’）、115.0（C-5′）、118.4 （C-6’）為B環(huán)上的6個碳，δ 117.8 （C-5）、109.6 （C-6）、151.6（C-7）、132.6 （C-8）、150.7（C-9）、114.8（C-10）為A環(huán)上的6個碳，δ 44.1（C-3）、80.3（C-2）分別為C環(huán)上的伯碳和叔碳，以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[18]，該物質(zhì)被鑒定為3’,4’,7,8-四羥基二氫黃酮。

圖7 化合物2的結(jié)構Fig.7 Chemical structure of compound 2

2.4 化合物的活性測定

2.4.1 FRAP法對純品單體化合物進行活性評價結(jié)果

圖8 化合物1與化合物2的總抗氧化活性（FRAAPP）Fig.8 Total antioxidant activities (FRAP) of compounds 1 and 2

由圖8可知，在測試濃度范圍內(nèi)，化合物1與化合物2的FRAP值均大于陽性對照VE，且具有明顯的計量效應關系。隨著濃度的增加，當化合物1、2和VE的FRAP值呈線增加，當濃度為500 μmol/L時，化合物1的FRAP值達到2.50，遠遠高于該濃度下化合物2和VE的FRAP值（分別為1.94和1.62），以上結(jié)果表明，相比化合物1和2具有很強的總抗氧化活性。

2.4.2 DPPH法對純品單體化合物進行活性評價的結(jié)果

圖9 化合物1與化合物2的DPPH自由基清除率Fig.9 DPPH free radical scavenging effects of compounds 1 and 2

由圖9可知，在測試濃度范圍內(nèi)，化合物1和化合物2的DPPH自由基清除率均高于陽性對照VE，化合物1的DPPH自由基清除率在20 μmol/L時便達到了54.55%，遠高于此濃度下化合物1和陽性對照VE的清除率（分別為18.77%、12.02%），60 μmol/L時達到最大值（78.52%），其后增加緩慢。化合物2的DPPH自由基清除率隨濃度增加呈現(xiàn)明顯的計量效應關系，當濃度為100 μmol/L時DPPH自由基清除率達到79.96%，高于此濃度下陽性對照VE的清除率（65.66%）。其中化合物1和化合物2對DPPH自由基的半數(shù)抑制率IC50分別為（17.29±0.17）μmol/L和（70.09±0.09）μmol/L，均低于陽性對照VE的DPPH自由基的半數(shù)抑制率IC50值（（78.08±1.63）μmol/L）。綜上所述，化合物1和2具有很強的DPPH自由基清除活性。

2.4.3 ABTS法對純品單體化合物進行活性評價結(jié)果

圖10 化合物1和化合物2的ABBTTSS＋·清除率Fig.10 ABTS free radical scavenging effects of compounds 1 and 2

由圖10可知，在測試濃度范圍內(nèi)，化合物1的ABTS＋·清除率要高于化合物2和陽性對照VE，在60 μmol/L以內(nèi)時，化合物1的ABTS＋·清除率隨著濃度的增加呈現(xiàn)明顯的計量效應關系，當濃度達到60 μmol/L時清除率達到92.28%，遠高于此濃度下化合物1和VE的清除率（分別為71.19%、60.27%），其后增加緩慢；化合物2的ABTS＋·清除率在80 μmol/L以內(nèi)時隨著濃度的增加呈現(xiàn)明顯的計量效應關系，當濃度為80 μmol/L時，ABTS＋·清除率為89.81%，高于此濃度下陽性對照VE的清除率（78.49%），當濃度為100 μmol/L時，化合物1、2以及陽性對照VE的清除率都超過99%。其中，化合物1和2對ABTS＋·半數(shù)抑制率IC50分別為（22.86±0.21）μmol/L和（33.4±0.18）μmol/L，均低于陽性對照VE的半數(shù)抑制率IC50值（38.54±0.42）μmol/L。綜上所述，化合物1和2具有很強的ABTS＋·清除率活性。

3 討 論

黃酮類化合物是植物的次級代謝產(chǎn)物，結(jié)構上泛指兩個具有酚羥基的苯環(huán)（A與B環(huán)）通過中間的3個碳原子相互連結(jié)而成的一系列化合物，其基本母核為2-苯基色原酮，因苯環(huán)上一般連有多個羥基而具有多種生物活性[12]，如抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌等作用[3-5]。

結(jié)合型黃酮類化合物因其特殊的代謝途徑而受到越來越廣泛的關注，這部分物質(zhì)主要通過醚鍵、酯鍵、縮醛鍵與細胞壁構成材料－膳食纖維結(jié)合而難以直接被腸道攝入，在腸道菌落的作用下局部發(fā)揮功效[11-12]。本實驗采用堿降解法消化結(jié)合型黃酮類化合物將其從細胞壁上釋放下來，得到最佳的提取條件為：堿降解時間為2 h，溫度為50 ℃，NaOH濃度為2 mol/L，最佳提取溶劑為正丁醇；從粗提物中分離出兩個純的化合物，并鑒定其結(jié)構分別為金雞菊查爾酮-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖、3’,4’,7,8-四羥基二氫黃酮，其中3’,4’,7,8-四羥基二氫黃酮為首次從該種植物中分離得到。

大量研究表明[4,19-20]，黃酮類 化合物是昆侖雪菊中的主要活性成分，其抗氧化作用是通過多種途徑來實現(xiàn)的，主要包括清除自由基、抑制氧化酶的 活性、絡合金屬離子、提高抗氧化酶的活性、與其他抗氧化劑（如VC、VE）有協(xié)同增效作用、維持體內(nèi)抗氧化劑濃度等，在捕捉游離基的過程中貢獻苯環(huán)羥基上的氫原子與自由基結(jié)合，中斷自由基鏈式反應而起抗氧化作用，并形成穩(wěn)定的苯氧共振自由基。本研究通過FRAP法、DPPH自由基法和ABTS法評價了化合物的抗氧化活性，其結(jié)果表明化合物1與化合物2均有很好的抗氧化活性，總抗氧化活性均高于陽性對照 VE對照，其中化合物1與化合物2對DPPH自由基的半數(shù)抑制率IC50分別為（17.29±0.17）μ mol/L和（70.09±0.09）μmol/L，對ABTS＋·半數(shù)抑制率IC50分別為（22.86±0.21）μmol/L和（33.4±0.18）μmol/L，遠低于陽性對照VE的IC50值（分別 為（78.08±1.63）μmol/L和（38.54±0.42）μmol/L），說明化合物1和2具有很 強的抗氧化活性。

本研究采用堿降解法使結(jié)合型化合物釋放出來，結(jié)合不同溶劑進行提取得到粗提物，篩選出最佳的提取溶劑并優(yōu)化了降解條件，為分析結(jié)合型黃酮提供了有效的分離方法。對粗提物中的黃酮類化合物進行分離純化得到了兩個單體化合物，并對純化的單體化合物進行了活性評價，為深入分析其活性與構效關系以及進一步開發(fā)雪菊的營養(yǎng)健康功能提供了理論基礎。

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Isolation and Identification of Bound Flavonoids from Coreopsis tinctoria Nutt

CHEN Wei, YANG Ying-shi, YANG Hai-yan*
(1. College of Food Science and Pharmacy, Xinjiang Agricultural University, ürümqi 830052, China)

It is diff cult to extract bound f avonoids directly from Coreopsis tinctoria Nutt owing to their binding to the cell wall material by covalent bond. The bound compounds were released using an alkaline digestion method in the current study and the process parameters were optimized. A crude extract was obtained from the digestion products using the selected optimum solvent and pure f avonoid compounds were isolated from the crude extract by open silica gel column chromatography and Sephedex LH-20 gel column chromatography. The antioxidant activities of the purif ed compounds were evaluated by DPPH, FRAP and ABTS assays. The results revealed that the optimum alkaline degradation conditions were 50 ℃, 2 h and 2 mol/L for temperature, time and NaOH concentration, respectively, and n-butanol was selected as the optimum extraction solvent for f avonoids. Two pure compounds were isolated from the crude extract and their chemical structures were elucidated as okanin-4’-O-β-D-glucopyranoside and 3’,4’,7,8-tetrahydroxyflavanone by nuclear magnetic resonance (NMR) and electro-spray ionization mass spectrometry (ESI-MS). Antioxidant experiments showed that the total antioxidant capacity of these two compounds was higher than that of the positive control vitamin E. The IC50values of compounds 1 and 2 in the DPPH assay were (17.29 ± 0.17) and (70.09 ± 0.09) μmol/L, respectively, while those in the ABTS assay were (22.86 ± 0.21) and (33.4 ± 0.18) μmol/L, respectively, which were far lower than that of vitamin E (the IC50values were (78.08 ± 1.63) and (38.54 ± 0.42) μmol/L for DPPH and ABTS+radicals, respectively), suggesting that bothf avonoids possess powerful antioxidant activities.

Coreopsis tinctoria Nutt; bound f avonoid compounds; structure identif cation; antioxidant activities

TS201.2

A

1002-6630（2014）11-0072-07

10.7506/spkx1002-6630-201411015

2013-11-14

烏魯木齊市科學技術計劃項目（Y121120008）；國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目（31260377）

陳偉（1988—），男，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物提取與利用。E-mail：chenweifood@sina.com

*通信作者：楊海燕（1962—），女，教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物提取與利用。E-mail：yanghaiyan163@163.com